发明内容
本发明的目的之一是提供一种女贞子的提取物及其制备方法。
本发明的另一个目的是公开一种含该提取物的药物组合物。
本发明还有一个目的是公开这种组合物的治疗用途,即治疗心脑血管疾病的用途。
本发明的提取物由以下方法制备得到:以水溶性溶剂作为提取溶剂提取女贞子,提取液浓缩至浸膏,干燥,提取液浓缩至干或浓缩至适量,得到提取浓缩物。所述的水溶性溶剂选自水、丙酮或C1-4的直链或支链的脂肪族醇中的一种或两种以上溶剂组成的混合溶剂。得到的提取浓缩物经有机溶剂萃取,得到萃取物,干燥,即得粗提物。所述的有机溶剂选自石油醚、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇的一种或几种。
上述制备方法进一步可包括:得到的粗提物用层析柱进行分离,以体积比0-100∶100-0的乙醇∶水或者甲醇∶水或者丙酮∶水进行梯度洗脱,分段收集流出液,其中所述的层析柱选自大孔树脂柱、聚酰胺柱、硅胶柱、氧化铝柱或葡聚糖凝胶柱;将上述流出液中含有红景天苷及酪醇的流出液合并,回收溶剂,浓缩至干,干燥后得到精提物。
本发明中含有红景天苷及酪醇。一般的,粗提物中含有红景天苷及酪醇的量为3-15%,精提物中的量为30-60%,因此,质量控制选择红景天苷及酪醇的含量作为一个质量指标。
本发明组合物还公开了一种药物组合物,其含有治疗有效量的女贞子提取物与药学上可接受的载体。
所述的女贞子提取物可以是粗提物,也可以是精提物。可以是片剂、胶囊、丸剂、散剂、粉剂、颗粒、锭剂、分散片、栓剂、软胶囊、口服液、混悬剂、大或小容量注射剂、无菌胃肠外溶液、冻干粉针、无菌粉分装等制剂形式。
以上活性剂的剂量将因配方而异。一般的剂量为每单位制剂中含提取物3-2000mg,也可根据不同的剂型选择不同的剂量。
本发明可用于心脑血管疾病,优选为冠心病和脑卒中的治疗。在药理试验中,发现本品能改善心脏的血流动力学状况,减轻心肌缺血损伤程度,缩小心肌缺血损伤范围。本品还对大鼠脑梗死模型的损伤有明显的保护作用,使病灶面积显著缩小,组织含水量减少,水肿程度明显减轻,明显提高机体的耐缺氧能力。
以下是本发明的部分实验结果:
试验1:本发明组合物对麻醉犬心脏血流动力学的影响
试验药品为按照本发明实施例1制备的的提取物,分为两个剂量组:小剂量组(20mg.kg-1)和大剂量组(60mg.kg-1)。对照药品为三七总皂苷片(以下简称总苷片)。
试验动物选用体重为8~12kg的健康杂种犬24只,雌雄各半,雌性未孕。用蒸馏水将提取物和三七总皂苷片配成试验所需浓度灌胃给药,分别将其称为提取物组和总苷片组,而将只给予给药量溶媒的试验组定义为溶媒对照组。
试验条件为室温18~22℃(空调控制),湿度55~65%。各犬在3%戊巴比妥钠静脉麻醉下,取仰卧位固定。颈部正中切口,暴露并切开气管,接气管插管以备人工呼吸;分离左侧颈静脉以备冠状静脉窦插管进行血氧含量测定;手术分离左侧股动脉,接水银检压计直接描记血压;分离右股动脉以备采血进行动脉血氧含量测定;分离左股静脉接输液瓶,以补充丢失的体液;四肢皮下固定针式电极,描记标准肢体II导联的心电图,以计算心率;然后动物取前肢右卧位,胸前区去毛,于左四、五肋间,沿第四肋下缘切开皮肤,钝性分离肌肉,暴露胸膜后,接人工呼吸机,充分止血后切开胸膜,提起心包膜切开并作心包床,小心分离冠状动脉左旋支和主动脉根部后留预置线,根据冠状动脉和主动脉的粗细,选择合适的电磁流量计探头进行调试;从右颈静脉插管至冠状静脉窦(心导管内注入肝素抗凝);冠状动脉和主动脉按上合适的电磁流量计探头。腹部正中切口,找出十二指肠以备给药。上述操作结束后,静脉注射肝素进行全身肝素化(5mg/kg)。肝素化后,再次检查有无出血并充分止血后,稳定30分钟。记录并记录血压、心电图和冠状动脉、主动脉流量,股动脉和冠状静脉窦取血进行血气分析等,作为给药前的正常值。根据不同组别和剂量给药后,再于给药后20、40、60、120和150分钟分别测定冠状静脉窦、主动脉血流量、血压和心电图等,并于给药后40分钟和60分钟采血测冠状静脉窦和主动脉血氧含量。实验结束后,取出心脏称重。
将获得的血压、心率、冠状动脉血流量及血氧含量、主动脉血流量及血氧含量的测定结果进行统计学处理,并根据公式计算出冠状动脉血流量、心输出量、每分钟百克心肌血流量、冠脉阻力等,并将其统计学处理结果分别记录于表1~3。
表1.提取物对犬冠脉流量(ml/min)、心输出量(L/min)的影响(n=6)
指标 | 组别 |
剂量(mg.kg-1) | 给药前 |
给药后不同时间(min)的增加值 |
20 |
40 |
60 |
120 |
150 |
冠脉流量 |
溶媒对照组总皂苷片组提取物组(小)提取物组(大) |
等容量30.02060 |
41.32±9.3648.90±15.1646.73±7.3247.15±13.16 |
0.35±0.782.36±3.691.28±3.142.62±4.68 |
0.70±0.9812.96±6.17**16.00±8.67**18.62±5.86** |
1.04±1.048.33±4.49**17.39±8.08**22.84±9.82**△△ |
-0.35±1.430.48±4.004.65±3.89**11.80±11.74*△ |
-0.69±0.98-0.17±3.650.05±4.516.52±9.02* |
心输出量 |
溶媒对照组总皂苷片组提取物组(小)提取物组(大) |
等容量30.02060 |
2.66±1.542.18±1.082.43±1.013.18±1.15 |
0.00±0.110.08±0.080.04±0.100.36±0.52** |
0.08±0.050.51±0.15**0.34±0.14**0.79±0.42** |
0.11±0.090.54±0.16**0.40±0.091.03±0.63* |
0.02±0.130.24±0.18*0.13±0.090.65±0.68** |
-0.03±0.090.12±0.160.10±0.090.35±0.32 |
与给药前比较:*P<0.05 **P<0.01 与总皂苷片组比较:△P<0.05 △△P<0.01
可见提取物组在给药后明显提高了犬冠脉流量和心输出量,60分钟时提取物大剂量组较总皂苷片组的冠脉流量有明显提高。
表2.提取物对犬冠脉阻力(mmHg/ml/100g/min)的影响(n=6)
指标 |
组别 |
剂量(mg.kg-1) |
给药前 |
给药后不同时间(min)的增加值 |
20 |
40 |
60 |
120 |
150 |
冠脉阻力 |
溶媒对照组总皂苷片组提取物组(小)提取物组(大) |
等容量30.02060 |
0.81±0.210.68±0.170.70±0.440.71±0.33 |
-0.01±0.02-0.03±0.04**-0.02±0.02-0.05±0.05 |
-0.04±0.02-0.18±0.08**-0.20±0.16*-0.22±0.14* |
-0.07±0.03-0.15±0.07*-0.22±0.16*-0.23±0.15* |
-0.05±0.03-0.071±0.04-0.09±0.10-0.14±0.05**△ |
-0.04±0.02-0.054±0.03-0.05±0.13-0.11±0.05* |
与给药前比较:*P<0.05 **P<0.01 与总皂苷片组比较:△P<0.05
可见提取物组在给药后明显减小了犬冠脉阻力,120分钟时提取物大剂量组较总皂苷片组效果明显。
表3.提取物对犬每分钟百克心肌血流量(ml/100g/min)的影响(n=6)
指标 | 组别 |
剂量(mg.kg-1) | 给药前 |
给药后不同时间(min)的增加值 |
20 |
40 |
60 |
120 |
150 |
每百克心肌血流量 |
溶媒对照组总皂苷片组提取物组(小)提取物组(大) |
等容量30.02060 |
148.08±26.80177.54±47.54161.60±69.41151.94±110.25 |
1.20±2.688.38±13.216.69±16.398.68±15.44 |
2.53±3.5846.91±20.98**65.34±48.62*67.62±17.29** |
3.70±3.7130.07±15.80**67.87±35.35**△84.79±37.2**△△ |
-0.79±5.451.80±13.9918.30±16.543.54±42.33△ |
-2.46±3.50-0.36±12.880.67±15.9923.62±30.82 |
与给药前比较:*P<0.05**P<0.01 与总皂苷片组比较:△P<0.05 △△P<0.01
可见提取物组在给药后明显减小了犬冠脉阻力,60分钟时提取物组较总皂苷片组效果明显。
试验2:对实脸性大鼠心梗死损伤的保护
取wistar大鼠50只,体重250~300g,雌雄各半,随机均分成假手术组(等容量0.5%CMCNa)、模型组(等容量0.5%CMCNa)、总苷片组(50mg/kg,按公斤体重计算,相当于临床人用量168mg/d的10倍)、提取物小(20mg/kg)和大剂量组(60mg/kg),连续给药3天后,将大鼠用乙醚麻醉,于左第4肋间开胸暴露心脏,距左冠状动脉起点2~3mm处,穿5个0手术线结扎,闭胸,假手术组只开胸,不结扎冠状动脉。手术结束后立即给药,测定0.5、1、2、3、5小时心电图,观察ST段抬高值,结果见表4。手术后24小时处死大鼠,立即开胸,取出心脏,自房室沟切除心房,自心尖至心底共取四片,每片厚约0.1cm,用0.5%NBT染色液于37℃恒温水浴锅中染色15min,分离梗死区,称重,计算梗死区重量占心室重量的百分比,结果见表5。
表4.提取物对模型大鼠心电图ST段的影响(
x±s)
组别 |
剂量(mg/kg) |
动物数 |
各时间点的ST抬高值(mv) |
正常 |
0 |
1 |
3 |
5 |
假手术组模型组总皂苷片 |
等容量等容量50 |
101010 |
0.030±0.0220.029±0.0150.028± |
0.020±0.0140.243±0.038△△0.226± |
0.024±0.0210.099±0.025△△0.025± |
0.024±0.0160.184±0.026△△0.072± |
0.026±0.0250.106±0.063△△0.062± |
组提取物组(小)提取物组(大) | 2060 | 1010 |
0.0320.031±0.0260.029±0.026 |
0.059△△0.206±0.027△△*0.181±0.074△△* |
0.028**0.027±0.026**0.014±0.018** |
0.046△△**0.090±0.046△**0.068±0.056△** |
0.0480.074±0.0710.055±0.059* |
与模型组比*p<0.05 **p<0.01,与假手术组比△△p<0.01
表5.提取物对模型大鼠心肌梗塞后心肌梗死重量的影响(
x±s)
组别 |
剂量(mg/kg) |
动物数(n) |
心室重(g) |
梗死区重(g) |
心肌梗死区重量×100%心室重量 |
假手术组模型组总皂苷片组提取物组(小)提取物组(大) |
等容量等容量50.0020.0060.00 |
1010101010 |
0.7655±0.10360.8891±0.13010.7415±0.14820.7556±0.16300.7344±0.1494 |
0.0000±0.00000.2162±0.03930.1206±0.03470.1325±0.0415**0.1140±0.0303** |
0.00±0.0024.45±3.4316.17±2.5117.39±3.26**15.43±1.81** |
与模型组比*p<0.05 **p<0.01,与假手术组比△p<0.05 △△p<0.01
试验3.对实脸性大鼠脑梗死损伤的保护
SD大鼠(雄性,体重300~350g)用戊巴比妥钠40mg/kgiP麻醉,然后在右眼和右耳之间的中点作1.5cm长的切IJ,分开颖肌,暴露颧突和颖骨,在颧突之头端1~2mm处,用牙科钻开一直径为2mm的小孔,将软脑膜开一小孔,暴露中脑动脉起始部位,用刮刀将脑组织轻轻移开,用微小双极电凝器灼断大脑中动脉,然后将颞肌和皮肤分层缝合。取手术成功的32只大鼠,分成4组:模型对照组,提取物低、高剂量组(20,60mg/kg),脑血栓片对照组(0.15g/kg),连续用药15d后,将动物处死,取其大脑,以均等间距横切5个断面,用1%四氮哇蓝(TTG)磷酸缓冲液在37℃染色10min后,分离梗死区与非梗死区,称重,用重量法计算梗死面积,最后将脑组织放入I10℃烘箱内连续烘干24h,取出称脑组织干重,算出脑含水量。结果见表6。
表6.提取物对大鼠实验性脑梗死的保护作用(
x±s)
组别 |
动物数 |
剂量(mg/kg) |
梗死百分率% |
含水量% |
模型组 |
8 | |
32.1±4.8 |
85.3±1.8 |
脑血栓片提取物组(小)提取物组(大) |
888 |
1502060 |
19.1±4.4**19.3±4.2**15.6±4.7** |
81.3±1.5**79.1±1.3**77.5±1.1** |
与模型组比*p<0.05 **p<0.01
试验4.对实脸性大鼠脑缺氧的保护
SD大鼠(雄性,体重300~350g)30只,分成3组:对照组(蒸馏水),提取物低、高剂量组(20,60mg/kg),于用药后1小时,腹腔注射3%的亚硝酸钠溶液,记录其死亡时间。结果见表7。
表7.提取物对大鼠脑缺氧的保护作用(
x±s)
组别 |
动物数 |
剂量(mg/kg) |
死亡时间 |
对照组提取物组(小)提取物组(大) |
101010 | 2060 |
18.1±1.321.3±1.2*24.6±2.7** |
与对照组比*p<0.05 **p<0.01
通过下面的具体实施例,以进一步清楚地了解本发明。
具体实施方式
实施例1:
取女贞子1kg,加70%乙醇回流提取2小时,共2次,合并药液,浓缩,回收乙醇至相对密度1.2。分别加乙酸乙酯、正丁醇萃取2次,浓缩到浸膏。浸膏加10倍量水溶解,流经大孔树脂层析柱进行分离,先以水洗脱,再用体积比20∶80的乙醇∶水进行剃度洗脱,分段收集流出液,流出液经浓缩,真空减压干燥,得到黄色固体。其中含红景天苷38%、酪醇4%。
实施例2:
取女贞子1kg,加60%乙醇回流提取2小时,共2次,合并药液,浓缩,回收乙醇至相对密度1.2。分别加乙酸乙酯、正丁醇萃取3次,浓缩到浸膏。浸膏加10倍量水溶解,流经大孔树脂层析柱进行分离,先以水洗脱,再用体积比10∶90的乙醇∶水进行洗脱,收集流出液,流出液经浓缩,真空减压干燥,得到淡黄色固体。其中含红景天苷47%、酪醇8%。
实施例3:
取女贞子1kg,加60%乙醇回流提取2小时,共2次,合并药液,浓缩,回收乙醇至相对密度1.2。分别加乙酸乙酯、正丁醇萃取1次,浓缩到浸膏。浸膏加8倍量水溶解,流经硅胶柱进行分离,先以水洗脱,再用体积比10∶90的乙醇∶水进行洗脱,收集流出液,流出液经浓缩,喷雾干燥,得到黄色粉末。其中含红景天苷18%、酪醇2%。
实施例4:
取女贞子1kg,加60%乙醇回流提取2小时,共2次,合并药液,浓缩,回收乙醇至相对密度1.2。分别加乙酸乙酯、正丁醇萃取3次,浸膏加8倍量水溶解,流经氧化铝柱进行分离,先以水洗脱,再用体积比30∶70的乙醇∶水进行洗脱,收集流出液,流出液经浓缩,喷雾干燥,得到黄色粉末。其中含红景天苷18%、酪醇2%。
实施例5:
取女贞子精提物2g,加淀粉10g,微晶纤维素10g,聚维酮3g,加水制软材,过20目制粒,60℃干燥2小时,24目整粒,加0.4g硬脂酸镁,混匀,压片,即得100片。
实施例6:
取实施例5中的颗粒灌装到1号胶囊中,即可。
实施例7:
取女贞子粗提物200g,加蔗糖300g,加水制软材,过10目制粒,60℃干燥2小时,14目整粒,混匀,灌装,即得100袋。
实施例8:
取女贞子精提物10g,加水500ml,溶解,调节pH值,加活性炭搅拌20分钟滤过,灌封后于100℃煮沸15分钟,即得100支。
实施例9:
取女贞子精提物10g,甘露醇40g,加水200ml,溶解,调节pH值,加活性炭搅拌20分钟滤过,用0.2μm微孔滤膜精滤,装瓶,冷冻干燥,即得100支。