发明内容
发明贡献之一是,我们通过吸收入血的有效成分研究发现救必应中的具栖冬青苷不是主要吸收入血成分,而是具栖冬青苷通过肠道菌代谢成救必应酸,再吸收入血起到防治心脑血管作用,通过进一步的研究发现救必应酸具有改善心肌缺血、心肌梗死,提高耐缺氧能力,明显降低全血比黏度和血浆比黏度,改善脑缺血、脑梗死的作用。与文献报道的水提取、乙醇提取、正丁醇提取的混合物及救必应总皂苷在治疗心脑血管疾病方面的应用有本质的区别和明显的技术进步。
本发明的重要意义在于将救必应的提取物服用之前在体外将总皂苷通过碱进行降解,获得能吸收入血的有效成分救必应酸,解决了由于个体差异造成口服救必应粗提物在体内降解程度的不同而使生物活性不一致的问题,同时可减少服用量,降低药物的毒副作用。
发明贡献二是,提供了一种不使用大孔树脂,不使用有毒有机试剂,而是合理地使用了氧化钙和氢氧化钙的碱性和钙离子的技术,药材提取时直接加入氧化钙和氢氧化钙,除去一些酚酸类鞣质、色素等杂质成分,从而制备救必应酸的方法,减少了对环境的严重污染问题,并且具有操作简单、周期短、纯度高的特点,是本发明的另一个主要创新点。
发明贡献三是,有效剂量的救必应酸作为有效成分可以与药学上可接受的不同辅料采用常规的制备工艺制成各种不同的药物制剂,如注射剂、冻干粉针剂、片剂、胶囊剂、滴丸、缓释剂、口服液等。
本发明所述的救必应提取的救必应酸的制备方法如下:
救必应药材加药材重量0.5-5%的氧化钙或氢氧化钙,用50-95%的乙醇或甲醇回流提取2-3次,每次1-3小时,合并提取液,加药液体积0.3-3.0%药用活性碳,过滤,滤液浓缩至每1ml含1g药材,加1-5倍量水,搅拌,用稀盐酸调PH值为6-7,放置,过滤,沉淀物用水洗至中性;沉淀物用10-60倍量50-95%的乙醇或甲醇加热溶解,加入药液体积的0.1-2%的药用活性炭,趁热过滤,滤液回收溶剂至每1ml含1g药材,加1-5倍量水,搅拌,放置,过滤,滤饼干燥,得救必应总皂苷;总皂苷加含10-30%乙醇或甲醇的0.2~2mol/l的碱溶液10-80倍量,100℃水解1-5小时,放冷,用酸调PH值为2-7,过滤,弃去水解液,滤饼用去离子水洗至中性,再用50-95%的乙醇或甲醇加热至沸,加入药液体积的0.2-2%的药用活性炭,趁热过滤,滤液减压浓缩回收至无醇味、加水至每1ml含1g药材,放置,过滤,水洗,干燥,再重结晶1-3次,得救必应酸。
本发明的生产工艺生产周期短,安全,成本低,收率高,纯度可达95%以上。本发明的工艺所得的救必应酸可产业化大量制备。鉴于本发明提取的救必应酸有预防和治疗心脑血管等疾病的作用,因此将有广阔的应用前景。
为实现上述目的,本发明提供以下技术解决方案。
救必应酸利用高效液相色谱法测定:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以甲醇-0.05%磷酸水溶液(80∶20)为流动相;检测波长为215nm。理论板数按救必应酸峰计算不低于3000。
对照品溶液的制备精密称取救必应酸对照品,置容量瓶中,用甲醇溶解制成1ml含救必应酸0.1mg的对照品溶液。
供试品溶液的制备取提取物10mg,精密称定,置100ml量瓶中,加甲醇溶解定容至刻度,摇匀,作为供试品溶液。
测定方法分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,即得。
救必应酸具有防治心脑血管等疾病的作用,这些药理作用,通过以下药效学试验例得到证实。
1、救必应酸对垂体后叶素(Pit)致急性心肌缺血大鼠心电图的影响取健康、经筛选心电图正常大鼠50只,随机均分为5组,每组10只,雌雄各半,按照表1分组,各组均灌胃给药,每天灌胃给药1次,连续给药7d,正常对照组给等量生理盐水。末次药后50min,各组均于舌下静脉注射Pit 1U/kg,于10秒内注射完毕,记录20min的心电图,测量给垂体后叶素30秒内ST段及T波的变化。结果见表1。
表1救必应酸对垂体后叶素致急性心肌缺血大鼠心电图的影响
与正常对照组比较:*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001
正常对照组给垂体后叶素后,心电图ST段和T波均明显抬高,表明垂体后叶素能诱发大鼠急性心肌缺血性心电图的改变。与对照组比较,救必应酸高、中、低剂量组,对给垂体后叶素诱发大鼠急性心肌缺血性心电图的变化有明显的改善作用。
2、救必应酸对异丙肾上腺素(Iso)致急性心肌缺血大鼠脂质过氧化的影响
取健康、经筛选心电图正常大鼠60只,随机均分为6组,每组10只,雌雄各半,按照表2分组。正常对照组给生理盐水,其余各给药组每天灌胃给药1次,连续给药7d。末次药后1h,水合氯醛腹腔注射麻醉,各组大鼠均采取皮下多点注射Iso 8mg/kg,多点注射部位包括:四肢根部和背部共5~6点,10s内注射完毕。24h后,水合氯醛麻醉,腹主动脉取血5mL,3000rpm离心15min,取血清。按照试剂盒说明分别测定血清MDA含量和SOD活性。见表2。
表2救必应酸对异丙肾上腺素(Iso)致急性心肌缺血大鼠脂质过氧化的影响
与模型组比较:*P<0.05,**P<0.01
与正常对照组比较,救必应酸高、中剂量组和普萘洛尔能显著降低血清MDA含量,救必应酸高、中剂量组和复方丹参能显著升高因缺血损伤造成的血清SOD活性降低。
3、救必应酸对大鼠急性血瘀模型血液流变学指标的影响
取大鼠60只,随机均分为6组,每组10只,雌雄各半,按照表3分组。连续灌胃7d,末次给药前一天,除正常对照组外,各组大鼠皮下注射盐酸肾上腺素0.8mg/kg两次,间隔6h,首次注射3h后,将大鼠置于0~2℃冰水中刺激5min。禁食不禁水18h后,末次给药1次,药后1h,以水合氯醛麻醉,腹主动脉取血,肝素抗凝,血液黏度计测红细胞压积、全血比黏度(高切变率120/s、低切变率30/s)、血浆比黏度。结果见表3。
表3救必应酸对大鼠急性血瘀模型血液流变学指标的影响
与正常对照组比较:△△P<0.01;与模型组比较:*P<0.05,**P<0.01
与正常对照组比较,模型组大鼠全血比黏度、血浆比黏度明显升高,表明肾上腺素加冰水刺激可造成血瘀症模型,表现在血液的黏、凝等方面,救必应酸组和复方丹参片组大鼠全血比黏度和血浆比黏度显著下降,表明救必应酸组和复方丹参片组能够改善血液流变学。
4、救必应酸对心肌梗死大鼠LDH、CPK、心肌梗死面积的影响
大鼠禁食12h后,不限饮水。腹腔注射20%乌拉坦(0.5ml/100g)麻醉后仰卧位固定四肢及头部。颈部、胸前手术野备皮,切开气管,连接小动物呼吸机(室内空气,潮气量2ml/100g,呼吸频率60/min)。逐层分离皮下组织、肌肉,沿胸骨左缘第3、4肋间开胸,剪开心包,暴露心脏。在左冠状动脉根部(肺动脉圆锥和左心耳连线中点与心尖的连线为其标志)下方约2mm处穿520缝线,末端套一小塑料垫片,上套一直径为115mm的聚氯乙烯管,稳定10min后拉线管,蚊式止血钳固定以阻断左冠状动脉血流,此时缺血心肌壁呈现发绀、膨出,心肌收缩减弱,同时心电图示ST段明显上抬,T波高耸,造成心肌缺血,45min后松开蚊式止血钳、放松缝线以恢复冠状动脉血液灌流,心肌再灌注2h,心电图示ST段回落1/2以上。结扎前心电图不正常,或未到观察终点而死亡以及造模不成功者剔除。入选SD雄性大鼠90只,按照表5分组。各组动物常规饲养,条件相同。各组分别按1ml/100g量给予生理盐水或药物灌胃,每天1次,连续10天,末次给药后1h,用于实验。实验结束后腹主动脉抽血3ml,2500rpm离心10min,分离血清,LDH、CPK检测。TTC染色法检测心肌梗死面积。实验结束取血后,立即取出心脏,用4℃生理盐水冲洗干净残留血液,用滤纸吸去水分。在结扎线以冲洗干净残留血液,用滤纸吸去水分。在结扎线以下,从心尖起平行切成等厚5片,置于1%TTC磷酸缓冲液37℃浸染10min。将各心肌切片置于玻璃平板与扫描平板之间,应用扫描仪进行图像采集,然后用计算心肌梗死面积(TTC非染色区),计算梗死心肌面积占心室面积百分比。结果见表4。
表4救必应酸对心肌梗死大鼠LDH、CPK、心肌梗死面积的影响
与模型组比较:*P<0.05,**P<0.01
缺血再灌注模型组LDH、CPK显著高于假手术组。救必应酸大、中、小剂量组与模型组比较,LDH、CPK显著降低。缺血再灌注模型组心肌梗死面积显著高于假手术组。与模型组比较,救必应酸大剂量组心肌梗死面积显著缩小。
5、救必应酸对大鼠局灶性脑缺血的治疗作用
取50只雄性大鼠,随机分为5组;阴性对照组(注射等体积溶剂)、救必应酸低剂量组(2mg/kg)、救必应酸中剂量组(4mg/kg)、救必应酸高剂量组(8mg/kg)、尼莫地平组(1.2mg/kg)。给药时间为缺血后立即尾静脉注射,给药体积为1ml。按Tamura的方法制备脑缺血模型,并于手术后24小时进行行为学评分,评分采用单盲法,在大鼠右侧大脑中动脉阻断24小时,断头取脑,在显微镜下进一步确证右侧大脑中动脉已在嗅束与大脑下静脉之间烧断且脑实质无损害者,将其进行切片染色,分别称坏死区及大脑右半球的重量。
表5救必应酸对中动脉结扎大鼠的组织学和行为学影响
与阴性对照组比较,*P<0.05,**P<0.01
从表5可以看出,与阴性对照组比较,救必应酸高、中剂量组能明显改善局部性脑缺血的行为学缺陷,显著缩小大鼠坏死脑组织的重量,减少局部性脑缺血大鼠的脑梗死重量占脑半球重量的百分比。表明救必应酸对急性局部性脑缺血有很好的治疗作用。
6、救必应酸对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用
取60只雄性大鼠,随机分为6组;假手术组、模型组、救必应酸低剂量组(2mg/kg)、救必应酸中剂量组(4mg/kg)、救必应酸高剂量组(8mg/kg)、尼莫地平组(2mg/kg)。给药时间为缺血后立即股静脉注射,给药体积为1ml。缺血再灌注模型的建立根据Longa方法改良形成的本实验室方法:用水合氯醛按360mg/kg腹腔注射麻醉,颈正中切口,依次分离右颈总动脉,右颈内、颈外动脉,结扎颈总动脉和颈外动脉,从颈外动脉和颈内动脉分叉膨大处下方的颈总动脉上剪一小口,将头部圆钝并经多聚赖氨酸处理的鱼线插入颈内动脉,插入长度以分叉处计18~20mm,结扎颈内动脉,固定鱼线,缝合(鱼线预留少许于体外)。缺血2h后,固定大鼠,将鱼线抽拉至颈内颈外动脉分叉处,实现再灌注。假手术组麻醉和手术过程与模型组相同,分离右侧颈总动脉及颈内外动脉,结扎颈总和颈外动脉,但不插线。模型成功判断标准以动物出现不能完全伸展对策前爪或向外侧划圈或向对侧倾倒作为模型成功判断标准。在脑缺血2h,再灌注24h后,断头取脑,剔除嗅脑、低位脑干及小脑,分离左右半脑,取MCAO侧半脑称重后,将脑组织做冠状切片,厚度为2mm左右,然后立即置于2%红四氮唑(TTC,PBS配置)溶液中,37℃避光孵育30min。经染色后,正常脑组织呈玫瑰红色,而脑梗塞区呈白色,按颜色小心分离脑组织。计算脑梗死面积。缺血2h,再灌注24h后,断头取脑,观察脑缺血再灌注损伤的脑组织水肿情况。用滤纸吸去脑表面的水分,装入称量瓶,称取湿重,然后置于干燥箱内100℃烘至恒重,再称取干重,计算脑含水量。
表6、救必应酸对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用
从表6可以看出,救必应酸高、中剂量组可以显著降低大鼠行为评分,救必应酸各剂量组能缩小脑梗死面积,减轻缺血侧脑半球水肿程度。表明救必应酸对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤有教强的保护作用。
本发明是通过如下的实验施例得以实现(证实)
实施例1、救必应酸的制备方法
救必应药材加药材重量2%的氧化钙,用70%的乙醇回流提取3次,每次2小时,合并提取液,加药液体积1%药用活性碳,过滤,滤液浓缩至每1ml含1g药材,加3倍量水,搅拌,用稀盐酸调PH值为6,放置,过滤,沉淀物用水洗至中性;沉淀物用30倍量80%的乙醇加热溶解,加入药液体积的0.5%的药用活性炭,趁热过滤,滤液回收溶剂至每1ml含1g药材,加2倍量水,搅拌,放置,过滤,滤饼干燥,得救必应总皂苷;总皂苷加含25%乙醇的1mol/l的氢氧化钠溶液50倍量,100℃水解4小时,放冷,用酸调PH值为5,过滤,弃去水解液,滤饼用去离子水洗至中性,再用95%的乙醇加热至沸,加入药液体积的0.2%的药用活性炭,趁热过滤,滤液减压浓缩回收至无醇味、加水至每1ml含1g药材,放置,过滤,水洗,干燥,再重结晶1-3次,得救必应酸。
实施例2、救必应酸的制备方法
救必应药材加药材重量3%的氧化钙,用80%的乙醇回流提取3次,每次2小时,合并提取液,加药液体积2%药用活性碳,过滤,滤液浓缩至每1ml含1g药材,加4倍量水,搅拌,用稀盐酸调PH值为6,放置,过滤,沉淀物用水洗至中性;沉淀物用30倍量85%的乙醇加热溶解,加入药液体积的0.2%的药用活性炭,趁热过滤,滤液回收溶剂至每1ml含1g药材,加2倍量水,搅拌,放置,过滤,滤饼干燥,得救必应总皂苷;总皂苷加含10%乙醇的0.5mol/l的氢氧化钾溶液60倍量,100℃水解4小时,放冷,用酸调PH值为5,过滤,弃去水解液,滤饼用去离子水洗至中性,再用95%的乙醇加热至沸,加入药液体积的0.4%的药用活性炭,趁热过滤,滤液减压浓缩回收至无醇味、加水至每1ml含1g药材,放置,过滤,水洗,干燥,再重结晶1-3次,得救必应酸。
实施例3、救必应酸的制备方法
救必应药材加药材重量0.5%的氧化钙,用50%的乙醇回流提取3次,每次2小时,合并提取液,加药液体积0.3%药用活性碳,过滤,滤液浓缩至每1ml含1g药材,加5倍量水,搅拌,用稀盐酸调PH值为6-7,放置,过滤,沉淀物用水洗至中性;沉淀物用60倍量95%的乙醇加热溶解,加入药液体积的0.5%的药用活性炭,趁热过滤,滤液回收溶剂至每1ml含1g药材,加3倍量水,搅拌,放置,过滤,滤饼干燥,得救必应总皂苷;总皂苷加含10%乙醇的2mol/l的碳酸钠溶液50倍量,100℃水解5小时,放冷,用酸调PH值为6,过滤,弃去水解液,滤饼用去离子水洗至中性,再用85%的乙醇加热至沸,加入药液体积的0.5%的药用活性炭,趁热过滤,滤液减压浓缩回收至无醇味、加水至每1ml含1g药材,放置,过滤,水洗,干燥,再重结晶1-3次,得救必应酸。
实施例4、救必应酸的制备方法
救必应药材加药材重量4%的氧化钙,用90%的甲醇回流提取2次,每次3小时,合并提取液,加药液体积1%药用活性碳,过滤,滤液浓缩至每1ml含1g药材,加5倍量水,搅拌,用稀盐酸调PH值为6-7,放置,过滤,沉淀物用水洗至中性;沉淀物用25倍量85%的甲醇加热溶解,加入药液体积的0.5%的药用活性炭,趁热过滤,滤液回收溶剂至每1ml含1g药材,加2倍量水,搅拌,放置,过滤,滤饼干燥,得救必应总皂苷;总皂苷加含30%甲醇的2mol/l的碳酸钾溶液60倍量,100℃水解5小时,放冷,用酸调PH值为4,过滤,弃去水解液,滤饼用去离子水洗至中性,再用95%的甲醇加热至沸,加入药液体积的0.5%的药用活性炭,趁热过滤,滤液减压浓缩回收至无醇味、加水至每1ml含1g药材,放置,过滤,水洗,干燥,再重结晶1-3次,得救必应酸。
实例5、(胶囊剂)
救必应酸100g,药用淀粉适量,混合均匀,制粒,干燥,整粒,装入1号胶囊,制成1000粒,即得。每次1粒、每日2次。
实施例6、(片剂)
救必应酸100g,药用淀粉适量,糊精适量,混合均匀,制粒,干燥,整粒,干燥,加入润滑剂适量,压片,制成1000片,即得。每次1片、每日2次。
实施例7、(滴丸剂)
称取15g聚乙二醇4000,15g聚乙二醇6000,在水浴上熔化,救必应酸10g,搅拌均匀,倾入保温管中,调节恒温装置,使药液在80-90℃下滴入冷却过的液体石蜡中,滴完后,将药丸倾入滤纸上吸干石蜡油,制成1000粒,即得。每次10粒、每日2次。
实施例8、(颗粒剂)
救必应酸100g,糊精400g,乳糖500g,混合均匀,用适量乙醇制粒,干燥、整粒、分装,制成1000袋,即得。每次1袋、每日2次。