CN102078344A - 救必应药物组合物及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种防治心脑血管疾病的救必应药物组合物，该组合物是从中药救必应(Ilicis routundae cortex)中经提取、精制而获得，该组合物特征在于主要是由具栖冬青苷、紫丁香苷和救必应酸等物质所组成。本发明还包括救必应组合物的制备方法和在制备冠心病、心绞痛、心肌缺血、脑缺血的药物中的应用。

Description

救必应药物组合物及其用途

技术领域

本发明涉及一种从救必应(Ilicis routundae cortex)中提取的药物组合物的新方法及医药用途，具体的说是一种具有防治冠心病、心绞痛、心肌缺血、心肌梗死、脑缺血、脑梗死等心脑血管疾病的药物组合物。也涉及该药物的药物制剂，本发明属于医药技术领域。

背景技术

心脑血管疾病是心血管疾病和脑血管疾病的统称，泛指由于高脂血症、血液黏稠、动脉粥样硬化、高血压等所导致的心脏、大脑及全身组织发生缺血性或出血性疾病的通称。心脑血管疾病已成为全球的重大公共卫生问题，在我国尤为突出。我国心脑血管疾病的总发病率和死亡率已经接近或超过许多发达国家，而且仍呈上升趋势。我国因心脑血管病所致死者约占总死亡构成比45％左右，每年因心脑血管疾病死亡的人数约有260万，平均每小时死亡的人数约有300人。因此，可以说心脑血管疾病是危害人类特别是老年人生命的第一大杀手。

心脑血管疾病具有“发病率高、致残率高、死亡率高、复发率高，并发症多”—“四高一多”的特点，因此，一个安全有效、毒副作用小的治疗心脑血管疾病的药物，正是患者所需要的。我们发明的本专利正是符合本条件的天然药物在防治心脑血管疾病方面的应用。

救必应(Ilicis routundae cortex)来源于冬青科植物铁冬青(Ilex rotunda Thunb.)的干燥树皮。铁冬青生长于荒山疏林、丘陵或溪边，主要分布于广东、广西、福建、台湾、云南、江苏、浙江、安徽、江西、湖南等省区。味苦、性寒，有清热解毒、消肿止痛、利湿、祛风解暑等功效，收载于《岭南采药录》，称“自木香、味苦、清热毒”为我国南方地区民间草药(黄闻键，救必应的民间应用，江西中医药，1996，2：147)。救必应树皮含黄酮甙、酚类，鞣质、三萜甙。临床上常用于感冒、扁桃体炎，咽喉炎、急性肠胃炎、痢疾、骨痛等，外用治跌打损伤、痈疖疮疡，外伤出血、烧伤、烫伤等。目前利用救必应药材为原料生产的药物，主要都是粗提物，制备工艺主要以水提醇沉，提取物干燥、粉碎直接入药的方法。何冰等研究表明救必应乙醇粗提取物有较明显的降低冠脉流量、减慢心率及使心肌收缩力减弱，提高耐缺氧能力，水粗提取物也能降低冠脉流量，提高耐缺氧能力及抗心律失常作用(中药材，1997年20卷6期，303-306)，但由于救必应醇提物及水提物属粗制剂，成分复杂，所以活性成分不明确；陈小夏研究表明救必应正丁醇提取物具有抗心律失常和抗心肌缺血作用(中药药理与临床，1998；14(4)，22-24)，提取物也为混合物，其中主要活性成分不明确；李超生等公开了救必应总皂苷具有治疗冠心病，心绞痛，中风，脑梗死等心脑血管系统疾病的作用(公开号：CN101032534)；李超生等也公开了紫丁香苷可明显减轻犬冠脉前降支导致的心肌缺血程度和范围，降低心肌耗氧指数，并能明显对抗氯化钡诱导的大鼠抗心律失常，还可减少局灶性脑缺血大鼠的脑梗死面积，这些作用表明了其抗心律失常、心肌缺血、脑缺血作用显著(公开号：CN101596203)；而我们实验研究证明，由具栖冬青苷(Pedunculoside)30-70％、紫丁香苷(Syringin)6-25％、救必应酸(rotundic acid)1-5％组成的组合物，是从天然存在的中药材救必应中提取而得，具有防治冠心病、心绞痛、心肌缺血、脑缺血的作用，并且我们出乎意料的发现救必应药物组合物较单一成分具栖冬青苷、紫丁香苷具有更强的药理活性，这正符合中医的复方理论和多成分的复合协调作用，本发明相对其他文献报道具有很大的进步及本质的区别。

在本发明完成之前，未发现有文献报道由具栖冬青苷、紫丁香苷、救必应酸组成的药物组合物具有防治心脑血管疾病的研究，也未发现该组合物用于防治心脑血管疾病的临床方面应用。同时也未发现从其他天然中药材中提取获得具栖冬青苷、紫丁香苷、救必应酸组成的组合物。

发明内容

发明目的是提供一种救必应组合物，用于预防和治疗冠心病、心绞痛、心肌缺血、脑缺血、心肌梗死等心脑血管疾病的药物，本发明对中药材救必应的有效成分进行研究，寻找新的有效部位，用于心脑血管疾病的预防和治疗，通过进一步的研究表明，由具栖冬青苷、紫丁香苷、救必应酸组成的药物组合物较单一成分具栖冬青苷及紫丁香苷在心脑血管方面有更显著的作用。这种天然的药物组合物还未在其他药材中发现，也体现了中药化学成分复合作用，具有突出的贡献。

本发明所述的药物组合物，是由救必应药材提取精制而成，其特征在于，将救必应药材粉碎成粗粉，用乙醇回流提取，滤过，滤液回收乙醇，滤过，得提取物Ⅰ；滤液挥至无醇味，通过已处理好的大孔树脂柱，先用水洗至无色，再用乙醇洗脱，浓缩乙醇液，得提取物Ⅱ；将提取物Ⅰ及提取物Ⅱ合并，干燥得救必应药物组合物。本发明提取的救必应组合物与以往报道的救必应提取物、救必应制剂有本质的区别和明显的技术进步。

本发明的有益效果是：填补了制备救必应有效部位，其中包含提供一种天然药物组合物，这种天然的组合物特点是，主要由皂苷类、苯丙素类、五环三萜酸类组成，具有很高的药用价值。组合物其特征在于，按重量计：具栖冬青苷30-70％、紫丁香苷6-25％、救必应酸1-5％，这种天然的化学成分复方制剂，具有明确的药理作用，在其他中药材中还未能发现，具有很高开发利用价值。

本发明的另一个目的是，提供救必应药物组合物的药物制剂。主要的药物形态为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、混悬剂、滴丸剂，注射剂中的任何一种。

本发明的所述的救必应药物组合物制备方法如下：

将救必应药材粉碎成粗粉，用5-10倍量药材重量的50-95％的乙醇回流提取1-3次，每次1-3小时，滤过，滤液回收乙醇，滤过，得提取物Ⅰ；滤液挥至无醇味，通过已处理好的大孔树脂柱，先用水洗至无色，再用30-80％乙醇洗脱，浓缩乙醇液，得提取物Ⅱ；将提取物Ⅰ及提取物Ⅱ合并，干燥得救必应药物组合物。

本发明提取方法具有生产周期短、可操作性强，没有使用易燃易爆化学试剂、安全，成本低，可以满足大工业化生产的需要。鉴于本发明具有明确的药理活性，本发明工艺所得的救必应组合物可以产业化制备，具有广阔的应用前景。

具栖冬青苷、紫丁香苷、救必应酸高效液相色谱法测定方法：

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.05％磷酸水溶液为流动相；具体比例见下表，检测波长为210nm。理论板数按紫丁香苷计算不低于3000。

对照品溶液的制备  精密称取紫丁香苷、具栖冬青苷、救必应酸对照品，置容量瓶中，用甲醇溶解制成每ml含紫丁香苷0.05mg，具栖冬青苷0.15mg，救必应酸0.008mg混合溶液。

供试品溶液的制备  取组合物20mg，精密称定，置50ml量瓶中，加甲醇40ml，超声30min，放置至室温，甲醇定容至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

测定方法  分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

救必应药物组合物(紫丁香苷占20.1％、具栖冬青苷占60.4％、救必应酸占3.7％)具有防治心脑血管等疾病的作用，这些药理作用，通过以下药效学试验例得到证实。

1、救必应组合物对垂体后叶素(Pit)致急性心肌缺血大鼠心电图的影响

取健康、筛选心电图正常大鼠70只，随机均分为7组，每组10只，雌雄各半，按照表1分组，各组均灌胃给药，每天灌胃给药1次，连续给药7d，正常对照组给等量生理盐水。末次药后50min，各组均于舌下静脉注射Pit 1U/kg，于10秒内注射完毕，记录心电图，测量给垂体后叶素30秒内ST段及T波的变化。结果见表1。

表1救必应组合物对垂体后叶素致急性心肌缺血大鼠心电图的影响

与模型对照组比较：^*P＜0.05，^**P＜0.01，^***P＜0.001

模型对照组给垂体后叶素后，心电图ST段和T波均明显抬高，表明垂体后叶素能诱发大鼠急性心肌缺血性心电图的改变。与模型对照组比较，救必应组合物高、中、低剂量组，对给垂体后叶素诱发大鼠急性心肌缺血性心电图的变化有明显的改善作用。救必应组合物(80mg/kg)与具栖冬青苷(80mg/kg)及紫丁香苷(80mg/kg)相比，对给垂体后叶素诱发大鼠急性心肌缺血性心电图的变化改善作用更明显。

2、救必应组合物对异丙肾上腺素(Iso)致急性心肌缺血大鼠脂质过氧化的影响

取健康、筛选心电图正常大鼠60只，随机均分为6组，每组10只，雌雄各半，按照表2分组。正常对照组给生理盐水，其余各给药组每天灌胃给药1次，连续给药7d。末次药后1h，水合氯醛腹腔注射麻醉，各组大鼠均采取皮下多点注射Iso 8mg/kg，多点注射部位包括：四肢根部和背部共5～6点，10s内注射完毕。24h后，水合氯醛麻醉，腹主动脉取血5mL，3000rpm·min^-1离心15min，取血清。按照试剂盒说明分别测定血清MDA含量和SOD活性。见表2。

表2救必应组合物对异丙肾上腺素(Iso)致急性心肌缺血大鼠脂质过氧化的影响

与模型组比较：^*P＜0.05，^**P＜0.01

与模型对照组比较，救必应组合物高、中剂量组和普萘洛尔能显著降低血清MDA含量，救必应组合物高、中剂量组和复方丹参能显著升高因缺血损伤造成的血清SOD活性下降。

3、救必应组合物对急性血瘀模型大鼠血液流变学指标的影响

取大鼠60只，随机均分为6组，每组10只，雌雄各半，按照表3分组。连续灌胃7d，末次给药前一天，除正常对照组外，各组大鼠皮下注射盐酸肾上腺素0.8mg/kg两次，间隔6h，首次注射3h后，将大鼠置于0～2℃冰水中刺激5min。禁食不禁水18h后，末次给药1次，药后1h，以水合氯醛麻醉，腹主动脉取血，肝素抗凝，血液黏度计测红细胞压积、全血比黏度(高切变率120/s、低切变率30/s)、血浆比黏度。结果见表3。

表3救必应组合物对急性血瘀模型大鼠血液流变学指标的影响

与正常对照组比较：△△P＜0.01；与模型组比较：^*P＜0.05，^**P＜0.01

与正常对照组比较，模型组大鼠全血比黏度、血浆比黏度明显高于正常组，表明肾上腺素加冰水刺激可造成血瘀症模型，表现在血液的黏、凝等方面，救必应组合物组和复方丹参片组大鼠全血比黏度和血浆比黏度显著下降，表明救必应组合物组和复方丹参片组能够改善血液流变学。

4、救必应组合物对心肌梗死大鼠LDH、CPK、心肌梗死面积的影响

大鼠禁食12h后，不限饮水。腹腔注射20％乌拉坦(0.5ml/100g)麻醉后仰卧位固定四肢及头部。颈部、胸前手术野备皮，切开气管，连接小动物呼吸机(室内空气，潮气量2ml/100g，呼吸频率60次/min)。逐层分离皮下组织、肌肉，沿胸骨左缘第3、4肋间开胸，剪开心包，暴露心脏。在左冠状动脉根部(肺动脉圆锥和左心耳连线中点与心尖的连线为其标志)下方约2mm处穿520缝线，末端套一小塑料垫片，上套一直径为115mm的聚氯乙烯管，稳定10min后拉线管，蚊式止血钳固定以阻断左冠状动脉血流，此时缺血心肌壁呈现发绀、膨出，心肌收缩减弱，同时心电图示ST段明显上抬，T波高耸，造成心肌血，45min后松开蚊式止血钳、放松缝线以恢复冠状动脉血液灌流，心肌再灌注2h，心电图示ST段回落1/2以上。结扎前心电图不正常，或未到观察终点而死亡以及造模不成功者剔除。入选SD雄性大鼠90只，按照表5分组。各组动物常规饲养，条件相同。各组分别按1ml/100g量给予生理盐水或药物灌胃，每天1次，连续10天，末次给药后1h，用于实验。实验结束后腹主动脉抽血3ml，2500rpm/min离心10min，分离血清，LDH、CPK检测。TTC染色法检测心肌梗死面积。实验结束取血后，立即取出心脏，用4℃生理盐水冲洗干净残留血液，用滤纸吸去水分。在结扎线以冲洗干净残留血液，用滤纸吸去水分。在结扎线以下，从心尖起平行切成等厚5片，置于1％TTC磷酸缓冲液37℃浸染10min。将各心肌切片置于玻璃平板与扫描平板之间，应用扫描仪进行图像采集，然后用计算心肌梗死面积(TTC非染色区)，计算梗死心肌面积占心室面积百分比。结果见表4。

表4救必应组合物对心肌梗死大鼠LDH、CPK、梗死面积的影响

与模型组比较：^*P＜0.05，^**P＜0.01

缺血再灌注模型组LDH、CPK显著高于假手术组。救必应组合物大、中、小剂量组与模型组比较，LDH、CPK显著降低。缺血再灌注模型组心肌梗死面积显著高于假手术组。与模型组比较，救必应组合物大剂量组心肌梗死面积显著缩小。

5、救必应组合物对大鼠局灶性脑缺血的治疗作用

取50只雄性大鼠，随机分为5组；阴性对照组(注射等体积溶剂)、救必应组合物低剂量组(2mg/kg)、救必应组合物中剂量组(4mg/kg)、救必应组合物高剂量组(8mg/kg)、尼莫地平组(1.2mg/kg)。给药时间为缺血后立即尾静脉注射，给药体积为1ml。按Tamura的方法制备脑缺血模型，并于手术后24小时进行行为学评分，评分采用单盲法，在大鼠右侧大脑中动脉阻断24小时，断头取脑，在显微镜下进一步确证右侧大脑中动脉已在嗅束与大脑下静脉之间烧断且脑实质无损害者，将其进行切片染色，分别称坏死区及大脑右半球的重量。

表5救必应组合物对中动脉结扎大鼠的组织学和行为学影响

与阴性对照组比较^*P＜0.05，^**P＜0.01

从表5可以看出，与阴性对照组比较，救必应组合物高、中剂量组能明显改善局部性脑缺血的行为学缺陷，显著缩小大鼠坏死脑组织的重量，减少局部性脑缺血大鼠的脑梗死重量占脑半球重量的百分比。表明救必应组合物对急性局部性脑缺血有很好的治疗作用。

6、救必应组合物对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用

取60只雄性大鼠，随机分为6组；假手术组、模型组、救必应组合物低剂量组(2mg/kg)、救必应组合物中剂量组(4mg/kg)、救必应组合物高剂量组(8mg/kg)、尼莫地平组(2mg/kg)。给药时间为缺血后立即股静脉注射，给药体积为1ml。缺血再灌注模型的建立根据Longa方法改良形成的本实验室方法：用水合氯醛按360mg/kg腹腔注射麻醉，颈正中切口，依次分离右颈总动脉，右颈内、颈外动脉，结扎颈总动脉和颈外动脉，从颈外动脉和颈内动脉分叉膨大处下方的颈总动脉上剪一小口，将头部圆钝并经多聚赖氨酸处理的鱼线插入颈内动脉，插入长度以分叉处计18～20mm，结扎颈内动脉，固定鱼线，缝合(鱼线预留少许于体外)。缺血2h后，固定大鼠，将鱼线抽拉至颈内颈外动脉分叉处，实现再灌注。假手术组麻醉和手术过程与模型组相同，分离右侧颈总动脉及颈内外动脉，结扎颈总和颈外动脉，但不插线。模型成功判断标准以动物出现不能完全伸展对策前爪或向外侧划圈或向对侧倾倒作为模型成功判断标准。在脑缺血2h，再灌注24h后，断头取脑，剔除嗅脑、低位脑干及小脑，分离左右半脑，取MCAO侧半脑称重后，将脑组织做冠状切片，厚度为2mm左右，然后立即置于2％红四氮唑(TTC，PBS配置)溶液中，37℃避光孵育30min。经染色后，正常脑组织呈玫瑰红色，而脑梗塞区呈白色，按颜色小心分离脑组织。计算脑梗死面积。缺血2h，再灌注24h后，断头取脑，观察脑缺血再灌注损伤的脑组织水肿情况。用滤纸吸去脑表面的水分，装入称量瓶，称取湿重，然后置于干燥箱内100℃烘至恒重，再称取干重，计算脑含水量。

表6、救必应组合物对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用

与阴性对照组比较^*P＜0.05，^**P＜0.01

从表6可以看出，救必应组合物高、中剂量组可以显著降低大鼠行为评分，救必应组合物各剂量组能缩小脑梗死面积，减轻缺血侧脑半球水肿程度。表明救必应组合物对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤有较强的保护作用。

从以上的药效学实验可知，救必应组合物具有预防和治疗冠心病、心绞痛、心肌缺血、脑缺血、心肌梗死、脑梗死的作用，并且长期服用没有副作用。

本发明是通过如下的实验施例得以实现(证实)，但并不意味这本发明就限于此，具体实施方法如下。

实例1

将救必应药材2kg粉碎成粗粉，用8倍量药材重量的70％的乙醇回流提取3次，每次2小时，滤过，合并滤液，回收乙醇，至2500ml，滤过，取滤饼得提取物Ⅰ；滤液挥至无醇味，通过已处理好的D101大孔树脂柱，先用水洗至无色，再用50％乙醇洗脱4BV，收集乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩，得提取物Ⅱ；将提取物Ⅰ及提取物Ⅱ合并，干燥，得救必应药物组合物160.9g。利用高效液相色谱法测定，计算，紫丁香苷占20.8％、具栖冬青苷占58.7％、救必应酸占3.1％。

实例2

将救必应药材2kg粉碎成粗粉，用6倍量药材重量的50％的乙醇回流提取3次，每次3小时，滤过，合并滤液，回收乙醇，至2500ml，滤过，取滤饼得提取物Ⅰ；滤液挥至无醇味，通过已处理好的D101大孔树脂柱，先用水洗至无色，再用60％乙醇洗脱4BV，收集乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩，得提取物Ⅱ；将提取物Ⅰ及提取物Ⅱ合并，干燥，得救必应药物组合物165.8g。利用高效液相色谱法测定，计算，紫丁香苷占19.9％、具栖冬青苷占57.6％、救必应酸占2.9％。

实例3

将救必应药材2kg粉碎成粗粉，用8倍量药材重量的80％的乙醇回流提取2次，每次3小时，滤过，合并滤液，回收乙醇，至2500ml，滤过，取滤饼得提取物Ⅰ；滤液挥至无醇味，通过已处理好的AB-8大孔树脂柱，先用水洗至无色，再用40％乙醇洗脱4BV，收集乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩，得提取物Ⅱ；将提取物Ⅰ及提取物Ⅱ合并，干燥，得救必应药物组合物143.6g。利用高效液相色谱法测定，计算，紫丁香苷占24.4％、具栖冬青苷占62.8％、救必应酸占3.5％。

实例4

将救必应药材2kg粉碎成粗粉，用8倍量药材重量的50％的乙醇回流提取3次，每次2小时，滤过，合并滤液，回收乙醇，至2500ml，滤过，取滤饼得提取物Ⅰ；滤液挥至无醇味，通过已处理好的AB-8大孔树脂柱，先用水洗至无色，再用35％乙醇洗脱4BV，收集乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩，得提取物Ⅱ；将提取物Ⅰ及提取物Ⅱ合并，干燥，得救必应药物组合物135.8g。利用高效液相色谱法测定，计算，紫丁香苷占24.8％、具栖冬青苷占64.1％、救必应酸占2.8％。

实例5、(胶囊剂)

救必应药物组合物100g，药用淀粉适量，混合均匀，制粒，干燥，整粒，装入1号胶囊，制成1000粒，即得。每次1粒、每日2次。

实施例6、(片剂)

救必应药物组合物100g，药用淀粉适量，糊精适量，混合均匀，制粒，干燥，整粒，干燥，加入润滑剂适量，压片，制成1000片，即得。每次1片、每日2次。

实施例7、(滴丸剂)

称取15g聚乙二醇4000，15g聚乙二醇6000，在水浴上熔化，救必应药物组合物10g，搅拌均匀，倾入保温管中，调节恒温装置，使药液在80-90℃下滴入冷却过的液体石蜡中，滴完后，将药丸倾入滤纸上吸干石蜡油，制成1000粒，即得。每次10粒、每日2次。

实施例8、(颗粒剂)

救必应药物组合物100g，糊精400g，乳糖500g，混合均匀，用适量乙醇制粒，干燥、整粒、分装，制成1000袋，即得。每次1袋、每日2次。

Claims (6)

1.一种由救必应提取的药物组合物的制备方法，其特征在于：将救必应药材粉碎成粗粉，用5-10倍量药材重量的50-95％的乙醇回流提取1-3次，每次1-3小时，滤过，滤液回收乙醇，至每1ml含0.8g药材，滤过，取滤饼得提取物Ⅰ；滤液挥至无醇味，通过已处理好的大孔树脂柱，先用水洗至无色，再用30-80％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩，得提取物Ⅱ；将提取物Ⅰ及提取物Ⅱ合并，干燥得救必应药物组合物。

2.根据权利要求1所述的救必应药物组合物，其特征在于：主要由具栖冬青苷、紫丁香苷和救必应酸组成。

3.根据权利要求2所述的救必应药物组合物，其特征在于按重量百分比计：具栖冬青苷占30-75％，紫丁香苷占6-25％，救必应酸占1-5％。

4.一种口服药物制剂，其特征在于含有权利要求1和权利要求3所述的治疗有效剂量的救必应药物组合物和一种或多种药学上可接受的赋形剂。

5.根据权利要求4所述的药物制剂，其特征在于所述的口服制剂选自片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、混悬剂、滴丸剂、口服液等制剂中的一种。

6.根据权利要求3所述的救必应药物组合物，在制备预防和治疗冠心病、心绞痛、心肌缺血、心肌梗死、脑缺血、脑梗死等心脑血管疾病的药物中的应用。