CN101019878B - 一种含有丹参丹酚酸a的注射药物组合物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种含有丹参丹酚酸A的注射药物组合物及其制备方法，其特征在于通过药代动力学、药效学、毒理学实验确定了药物组合物：丹参丹酚酸A1-10重量份，灯盏花素1-20重量份；优选丹参丹酚酸A1-5重量份，灯盏花素1-12重量份；以上述组合物为原料制备成水针剂、输液剂、粉针剂，药理实验表明，具有很好的药理作用。
Description
技术领域
本发明涉及中药制药技术领域，具体涉及一种含有丹参丹酚酸A的注射药物组合物及其制备方法。
背景技术
丹酚酸A【salvianolic acidA】是丹参中活性最强的成分，具有很好的药理作用(杜冠华【基础医学与临床，2000，20(5)：10～14】、胡义扬【中药药理学报，1997，18(5)：478-480】)，丹参丹酚酸A在丹参中含量很低，只有万分之五左右，即使通过一系列的工艺将其提取出，只能得到微量级的丹酚酸A，因此传统中药将丹参与其它药材进行配伍，其实质是与丹参其它相对作用较弱的成分(比如丹参酮、丹酚酸B等)的配伍，这种配伍虽然在临床上起到了一定的治疗作用，但没有将丹参中发挥最大药效的有效成分应用于疾病的治疗中，造成了资源的巨大浪费。因此将批量级的丹酚酸A应用于疾病的治疗是很多医药科研者的希望，特别是将批量级的丹酚酸A与其它中药有效成分的配伍，更是需待解决的难题之一。
灯盏花素是从菊科飞蓬植物灯盏花(Erigeron brieviscapus(Vant)Hand Mazz.)中提取出来的黄酮类有效成分，具有扩张脑血管、冠脉血管和外周血管的作用，可使血流量增加，改善局部供血，使外周阻力下降，改善微循环等；临床上以灯盏花素为原料的制剂包括有灯盏花素注射液、灯盏细辛注射液等，这些制剂在临床应用对血栓性心脑血管疾病具有一定的治疗作用，但血栓溶散恢复组织器官血流的同时，将会不同程度的发生再灌注损伤，可导致更为严重的后果，灯盏花素注射制剂无法较好的解决溶栓的同时产生的再灌注损伤，因而其疗效并不是非常理想，需要在临床中配伍几种药物，以降低溶栓后再灌注产生的损伤，这些临床上简单的配伍，虽然能够达到一定的治疗作用，但会产生大量的不良反应，给医生带来巨大的用药困难，给患者带来更大的痛苦，因此，应针对中药有效成分或组分有效部位的配伍，进行一系列的实验，挖掘中药有效成分或组分有效部位的组合，以降低不良反应，增加疗效，将能够进一步推动中药现代化的进程。
传统中药配伍研究多停留在药材配伍的基础上，虽然可以用中医理论进行解释，但其科学性一直存在争议，因此将中药有效成分或组分有效部位进行配伍，已经被众多科研工作者认同，这种配伍与配比关系是其核心与灵魂所在，是中医药的特色和优势，它既不是简单的中药药材在作用上、数量上的相加，也不是机械的毒性反应的抵消，而是通过一系列的研究(药效学筛选、系统药效学评价与药代动力学研究等方面)，在辨证法的基础上，以法统方，立方遣药，有序组合而成的有制之师。
查阅文献和专利，未有丹参丹酚酸A与灯盏花素配伍的报道，但有丹参总酚酸与灯盏花素的配伍，这种药物组合虽然具有一定的疗效，但因为现有技术的存在着一定的缺陷：得到丹参丹酚酸是以丹参丹酚酸B为主的丹酚酸类物质，而无法得到批量级的丹参丹酚酸A，因此，批量级的丹参丹酚酸A与灯盏花素能否进行组合，需要科研人员通过大量的科研实验才能确定。
发明内容
基于上述原因，我们通过对丹参药材进行一系列的转化实验，即将丹参总酚酸通过一定的化学反应得到了批量级的丹参丹酚酸A，再通过注射给药的方式，以药代动力学、药理学、毒理学等实验确定了一定量的丹参丹酚酸A与一定量的灯盏花素可以进行组合，这种药物组合除了具有互补的作用外，还能够很好的解决溶栓后产生的再灌注损伤，降低了临床注射药物联合用药的不良反应，达到了1+1大于2即增加疗效，降低不良反应的效果。
本申请通过下述方案实现的。
含有丹参丹酚酸A的注射药物组合物，其中：丹参丹酚酸A1-10重量份，灯盏花素1-20重量份；
含有丹参丹酚酸A的注射药物组合物，其中优选为：丹参丹酚酸A1-5重量份，灯盏花素1-12重量份；
其中灯盏花素含量以灯盏花乙素计大于等于90％且小于100％；
其中丹参丹酚酸A的含量大于等于90％且小于100％；(市售或文献记载方法得到。)
药物组合物制备成单位剂量的水针剂、输液剂、粉针剂；
其中单位剂量为5mg-1000mg；其中优选单位剂量为20-500mg。单位剂量低于5mg在临床使用中没有效果，单位剂量大于1000mg在临床使用会产生一定的毒副反应。
含有丹参丹酚酸A的注射药物组合物在制备治疗和/或预防心脑血管疾病、高血脂、痛风、肝损伤、肝纤维化、肺纤维化、肿瘤、衰老药物中的应用。
一.工艺制法
丹参丹酚酸A的提取纯化：
丹参用水或乙醇溶液提取得到水提取液或醇提取液，醇提液浓缩乙醇至尽，调PH值至7.5-9.0、30-80℃温度、加热1-6小时或调PH值至3.5-6.0、110-130℃温度、表压0.05MPa-0.17MPa压强，加热1-6小时；溶液进行过滤，滤液经非极性或弱极性大孔树脂柱层析分离，先用水、10-30％稀乙醇洗脱，除去杂质，再用30-70％浓度的乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇至尽；浓缩液用葡聚糖凝胶LH-20或聚酰胺层析柱分离，先用水、20-50％乙醇溶液洗脱，弃去洗脱液，再用50-95％乙醇溶液，洗脱液回收乙醇至尽；浓缩液调PH值至2-5，经有机溶剂萃取，分离有机溶剂相，得含药溶液，浓缩，干燥或冷冻干燥，得丹参丹酚酸A；
灯盏花素为现有技术制备。
制剂制备：
水针剂制备：
取丹参丹酚酸A和灯盏花素，按照水针剂的药剂学常规要求制备成水针剂；
输液剂制备：
取丹参丹酚酸A和灯盏花素，按照输液剂的药剂学常规要求制备成输液剂；
粉针剂制备：
取丹参丹酚酸A和灯盏花素，按照粉针剂的药剂学常规要求制备成粉针剂。
其中水针剂、输液剂、粉针剂制备方法中所述大孔树脂柱为HPD-100、HPD-100A、HPD-300、HPD-400、HPD-400A、HPD-450、D101、1300-I、1400或AB-8。
其中水针剂、输液剂、粉针剂制备方法中所述的有机溶剂选自乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、正丁醇、异丙醇中的一种。
二.检测分析方法
1.丹参丹酚酸A检测分析方法：
色谱柱：C18反相色谱柱，NUCLEODUR，250*4.6mm，ODS；
色谱条件与系统适用性实验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流速1.0ml/min；柱温35℃；检测波长286nm；理论板数按丹酚酸A计应不低于60000；以乙腈-0.2％醋酸水溶液为流动相，按下述梯度洗脱条件进行梯度洗脱，运行90分钟；
0-15分钟时，乙腈的比例由10％升至20％，0.2％醋酸水溶液的比例由90％降至80％；15-55分钟时，乙腈的比例由20％升至30％，0.2％醋酸水溶液的比例由80％降至70％；55-65分钟时，乙腈的比例由30％升至50％，0.2％醋酸水溶液的比例由70％降至50％；65-72分钟时，乙腈的比例由50％升至80％，0.2％醋酸水溶液的比例由50％降至20％；72-77分钟时，乙腈的比例80％，0.2％醋酸水溶液的比例20％；77-80分钟时，乙腈的比例由80％降至10％，0.2％醋酸水溶液的比例由20％升至90％；80-90分钟时，保持乙腈-0.2％醋酸水溶液以10∶90的比例进行洗脱；
对照品溶液的配制：精密称取丹酚酸A对照品到容量瓶中，加甲醇溶解摇匀，并稀释至刻度；
样品溶液的配制：精密称取丹酚酸A样品，加入甲醇溶解摇匀，并稀释至刻度；或精密量取或称取制剂，加甲醇溶解摇匀，并稀释至刻度；
测定法：分别精密吸取对照品溶液和样品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，采用外标法以峰面积计算，即得；
2.灯盏花素检测分析：
色谱条件与系统适用性实验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流速1.0ml/min；柱温30℃；检测波长335nm；理论板数按灯盏花乙素计不低于2000；以体积比甲醇∶冰醋酸∶水＝32∶2∶66溶液为流动相；
对照品溶液的制备：精密称定灯盏花乙素对照品，加甲醇溶解摇匀，并稀释至刻度；
供试品溶液的制备：精密称取灯盏花素，加甲醇溶解摇匀，并稀释至刻度；或精密称取或量取本申请注射制剂，加甲醇溶解摇匀，并稀释至刻度；
测定法：分别精密吸取对照品溶液和样品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，采用外标法以峰面积计算，即得；
实验结果见表1、表2：
表1原料药的检测分析
表2制剂的检测分析
实验结论：通过上述实验表明，本申请药物组合具有实际意义。
三.药效学验证实验
1.对麻醉大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用
实验方案：
方案1：丹参丹酚酸A1重量份，灯盏花素1重量份；
方案2：丹参丹酚酸A1重量份，灯盏花素20重量份；
方案3：丹参丹酚酸A5重量份，灯盏花素12重量份；
方案4：丹参丹酚酸A4重量份，灯盏花素7重量份；
方案5：丹参丹酚酸A9重量份，灯盏花素1重量份；
方案6：丹参丹酚酸A8重量份，灯盏花素2重量份；
方案7：丹参丹酚酸A10重量份，灯盏花素20重量份；
方案8：丹参丹酚酸A5重量份；
方案9：灯盏花素5重量份；
实验方法：
取健康SD大鼠，体重240-260g，随机分组：空白对照组，实验方案组。置于相同环境预饲养2天，自由饮食。预饲养结束后，进行实验，动物称重，20％乌拉坦按0.6ml/100g腹腔注射，待麻醉满意后，仰卧固定于鼠板上，气管插管，接呼吸机，按10～12ml潮气量，70次/分的频率给予呼气，持续正压呼吸，吸∶呼比为1∶1。根据呼吸频率及深度调整呼吸参数。随后接心电图机，测正常心电图。剪去胸前手术区毛，碘酒消毒，剪开皮肤、皮下组织、胸前肌肉及筋膜3～4cm，用18#血管钳沿第三肋间钝性分离肋间肌3cm长，打开胸腔及心包膜，记录心电图，撑开3、4肋骨，用左手四指托住大鼠右侧胸腔，助手用眼科镊将胸腺向上推，在左心耳与肺动脉圆锥之间找到结扎标志血管左冠状静脉，在左心耳下方2mm处用无创小圆针带6-0丝线穿线，进针深度为1～1.5mm，宽2～3mm，穿线后记录心电图，经尾静脉给予相应药液(给药量为4mg/kg)，空白对照组给予相应量的生理盐水，给药10min后记录心电图，并用一带凹槽的小塑料管垫在结扎部位，两端线头在其上结扎。结扎后即刻记录心电图，以左室前壁呈紫绀或II导联S-T段弓背向上抬高大于0.1mv并持续0.5h以上为结扎成功标志(S-T段无改变者淘汰)。结扎后10min再次记录心电图，结扎30min后剪开结扎线，实现再灌注，并记录再灌注即刻心电图，清除胸腔内积血后逐层缝合胸壁，撤呼吸机，动物恢复自主呼吸，气管切口不做处理。再灌即刻、10min、20min、40min、1h、2h、3h分别记录心电图。再灌3小时，经腹主动脉取血，4000rpm离心10min取血清，解剖取心脏，冰生理盐水洗去残血，剪去心房及右心室，立即放入冰箱中冷冻。将心脏在冰箱中冷冻10min后，自心尖向心底平行房室沟方向将左室切成相等厚度的5片，放入1％TTC染液中，37℃染色10min，未坏死区为暗红色，坏死区呈灰白色。数码相机拍照。将坏死区和非坏死区分别称重，计算坏死区占左心室重量的百分比，即梗死范围。
检测指标分别为，心肌梗死范围。实验结果详见表3：
表3对结扎/再通大鼠左冠状动脉前降支所致心肌缺血/再灌注损伤心肌梗死范围(％)的影响(x±s)
注：与对照组比较**P＜0.01，*P＜0.05；与方案9比较#P＜0.05。
2.大鼠降血脂实验
实验方案：
方案1：丹参丹酚酸A1重量份，灯盏花素12重量份；
方案2：丹参丹酚酸A5重量份，灯盏花素1重量份；
方案3：丹参丹酚酸A3重量份，灯盏花素9重量份；
方案4：丹参丹酚酸A4重量份，灯盏花素8重量份；
方案5：丹参丹酚酸A8重量份，灯盏花素1重量份；
方案6：丹参丹酚酸A15重量份，灯盏花素1重量份；
方案7：丹参丹酚酸A1重量份，灯盏花素20重量份；
方案8：丹参丹酚酸A5重量份；
方案9：灯盏花素5重量份；
实验方法：雄性SD大鼠，适应性喂养一周以后，按体重随机分为正常对照组、模型组、实验方案组。除正常对照组每天上午8点-9点灌胃1.0ml/100g的蒸馏水外，其余各组灌胃1.0ml/100g脂肪乳剂，组方为30％猪油、10％胆固醇、2％胆酸盐、0.2％丙基硫氧嘧啶、20％吐温80、20％丙二醇、10％蔗糖，用蒸馏水溶成100ml，连续10天。禁食12小时眶静脉丛取血，检测血清TC、TG、HDL-C及LDL-C含量，并按血清TC水平重新分组。调整分组后，各组大鼠每天上午按上述造模试验方法给予脂肪乳剂，乳剂配方变为：20％猪油、5％胆固醇、2％胆盐、0.2％丙基硫氧嘧啶、10％吐温、10％丙二醇、5％蔗糖用蒸馏水溶成100ml，下午1点-2点按各组给药剂量尾静脉给药，连续给药4周，给药量为4mg/kg。给药4周结束后，禁食12小时，股动脉取血，一部分血液用1％肝素抗凝(约4ml)，用于血液流变学检测。另一部分血液分离血清用于生化指标的检测。试验期间每周称一次体重，按体重调整给药量，并测定摄食量。给药4周分别检测血清TC、TG、LDL-C和HDL-C水平，实验结果见表4
表4给药4周丹灯对大鼠血脂的影响(X±S)
注：与对照组比较**P＜0.01，*P＜0.05；与方案8、9比较#P＜0.05。
3.脑血管疾病药理实验
实验方案：
方案1：丹参丹酚酸A1重量份，灯盏花素12重量份；
方案2：丹参丹酚酸A1重量份，灯盏花素15重量份；
方案3：丹参丹酚酸A3重量份，灯盏花素1重量份；
方案4：丹参丹酚酸A3重量份，灯盏花素9重量份；
方案5：丹参丹酚酸A7重量份，灯盏花素6重量份；
方案6：丹参丹酚酸A10重量份，灯盏花素3重量份；
方案7：丹参丹酚酸A1重量份，灯盏花素19重量份；
方案8：丹参丹酚酸A5重量份；
方案9：灯盏花素5重量份；
实验方法：采用大脑中动脉阻塞(MACO)诱导大鼠局灶性脑缺血模型的方法，探讨不同方案对大鼠大脑中动脉闭塞所致局部脑缺血的防治作用。应用生理盐水作为阴性对照组，尼莫地平为阳性对照，尾静脉给药，给药量为4mg/kg，各方案组给药量为4mg/kg，以脑含水测定作为指标，实验结果见表5：
表5对MACO大鼠脑组织含水量
注：与对照组比较**P＜0.01，*P＜0.05；与方案8、方案9组比较#P＜0.05。
4.抗老年性痴呆药理实验
实验方案：
方案1：丹参丹酚酸A1重量份，灯盏花素1重量份；
方案2：丹参丹酚酸A1重量份，灯盏花素20重量份；
方案3：丹参丹酚酸A5重量份，灯盏花素2重量份；
方案4：丹参丹酚酸A2重量份，灯盏花素8重量份；
方案5：丹参丹酚酸A10重量份，灯盏花素7重量份；
方案6：丹参丹酚酸A9重量份，灯盏花素4重量份；
方案7：丹参丹酚酸A10重量份，灯盏花素19重量份；
方案8：丹参丹酚酸A5重量份；
方案9：灯盏花素5重量份；
实验方法：取经跳台法和八臂迷宫法筛选的正常大鼠采用侧脑室注射β-AP25-35，制成阿尔茨海默病(AD)大鼠模型，应用跳台法和八臂电迷宫法判断给药前后大鼠的空间学习和记忆能力；采用化学比色法测定脑组织中乙酰胆碱酯酶(AchE)活性，各方案组尾静脉给药，给药量为4mg/kg。
实验结果：与溶剂组大鼠相比，模型大鼠八臂电迷宫错误次数明显增加(P＜0.05)，跳台学习和记忆错误次数明显增加(P＜0.01)。大鼠造模前后连续静注给药21d后，方案1-7组大鼠上述行为学指标得到明显改善(P＜0.01)，脑组织AchE活性降低(P＜0.01)。结果表明本申请制剂对β-AP25-35侧脑室注射所致大鼠空间学习和记忆障碍有显著的预防和治疗作用，该作用与降低脑组织中AchE活性呈相关性。其它组效果不是太明显，与模型组没有显著性差异。
5.抗器官纤维化实验
方案1：丹参丹酚酸A5重量份，灯盏花素12重量份；
方案2：丹参丹酚酸A3重量份，灯盏花素1重量份；
方案3：丹参丹酚酸A3重量份，灯盏花素2重量份；
方案4：丹参丹酚酸A1重量份，灯盏花素2重量份；
方案5：丹参丹酚酸A4重量份，灯盏花素9重量份；
方案6：丹参丹酚酸A9重量份，灯盏花素4重量份；
方案7：丹参丹酚酸A10重量份，灯盏花素15重量份；
方案8：丹参丹酚酸A5重量份；
方案9：灯盏花素5重量份；
实验方法：用40％四氯化碳复合因素致大鼠肝纤维化模型。同时给与方案组治疗。试验结束时检测肝功能、III型前胶原(pcIII)、透明质酸(HA)，分离肝组织检测肝羟脯氨酸含量及电镜观察肝组织病理变化，各方案组尾静脉给药，给药量为4mg/kg。
实验结果：方案1-7组能明显改善肝纤维化大鼠的肝功能，降低血清pCIII、HA含量及使肝组织羟脯氨酸明显下降；明显减轻贮脂细胞增生及胶原的沉积。其它组效果不是太明显，与模型组没有显著性差异。
6.微循环药理实验
实验方案：
方案1：丹参丹酚酸A1重量份，灯盏花素1重量份；
方案2：丹参丹酚酸A1.5重量份，灯盏花素9重量份；
方案3：丹参丹酚酸A3重量份，灯盏花素1重量份；
方案4：丹参丹酚酸A1重量份，灯盏花素5重量份；
方案5：丹参丹酚酸A8重量份，灯盏花素2重量份；
方案6：丹参丹酚酸A4重量份，灯盏花素10重量份；
方案7：丹参丹酚酸A10重量份，灯盏花素20重量份；
方案8：丹参丹酚酸A5重量份；
方案9：灯盏花素5重量份；
实验方法：显微电视放大系统定量观测各方案组对正常及去甲肾上腺素(NA)所致耳廓微循环障碍小鼠耳廓微循环的影响；血浆复钙试验测定抗凝作用，各方案组给药量为6mg/kg。
实验结果：方案1-7组能显著促进或改善正常及NA所致耳廓微循环障碍小鼠耳廓的微循环；亦可延长血浆复钙时间。
7.抗肿瘤实验
实验方案：
方案1：丹参丹酚酸A1重量份，灯盏花素4重量份；
方案2：丹参丹酚酸A4重量份，灯盏花素9重量份；
方案3：丹参丹酚酸A2重量份，灯盏花素12重量份；
方案4：丹参丹酚酸A1重量份，灯盏花素9重量份；
方案5：丹参丹酚酸A9重量份，灯盏花素1重量份；
方案6：丹参丹酚酸A4重量份，灯盏花素17重量份；
方案7：丹参丹酚酸A10重量份，灯盏花素1重量份；
方案8：丹参丹酚酸A5重量份；
方案9：灯盏花素5重量份；
实验方法：以小鼠骨髓细胞微核实验和睾丸染色体畸变实验观察各方案组的抗突变作用，以S-180和H-22移植性肿瘤观察各方案组的抗肿瘤效果，各方案组尾静脉给药，给药量为6mg/kg。
实验结果：方案1-7组对环磷酰胺诱发的小鼠骨髓细胞微核发生和丝裂霉素诱发的小鼠睾丸细胞染色体畸变均有明显的抑制效果；对S-180和H-22小鼠移植性肿瘤生长也有明显的抑制作用。表明方案1-7组对体细胞和生殖细胞的DNA损伤均有保护作用，对小鼠移植性肿瘤也有一定的抑瘤作用。
实验8
治疗痛风的药理实验
实验方案：
方案1：丹参丹酚酸A1重量份，灯盏花素12重量份；
方案2：丹参丹酚酸A5重量份，灯盏花素12重量份；
方案3：丹参丹酚酸A5重量份，灯盏花素1重量份；
实验方法：将尿酸溶解于1mol/L的NaOH溶液中，以HCl调整PH，经搅拌、过滤、低温干燥、筛选、消毒，制备成无菌尿酸盐结晶。以无菌操作法，用4号注射针头，将5％尿酸盐溶液50μl，注入痛风模型组和方案组大鼠右后肢内踝的胫跗关节腔内，每个动物仅注射一次。方案组大鼠在痛风模型制备的同时，尾静脉给药，给药量4mg/kg，连续3天，正常组及痛风模型组给等体积生理盐水。检测踝关节及其周围组织K+浓度，实验结果见表6：
表6踝关节及其周围组织的K+浓度
注：与痛风模型组比较**P＜0.01
药理实验小结：通过上述药理实验表明，在本申请范围内药物组合与对照组具有很好的药理作用(P＜0.01)；与丹参丹酚酸A、灯盏花素组分比较具有显著性差异(P＜0.05)，充分说明丹参丹酚酸A与灯盏花素组合除具有很好的互补作用外，还具有互相影响提高药理活性的作用。
四.药代动力学研究
实验方案：
方案1：丹参丹酚酸A1重量份，灯盏花素21重量份；
方案2：丹参丹酚酸A1重量份，灯盏花素1重量份；
方案3：丹参丹酚酸A1重量份，灯盏花素7重量份；
方案4：丹参丹酚酸A1重量份，灯盏花素12重量份；
方案5：丹参丹酚酸A1重量份，灯盏花素20重量份；
方案6：丹参丹酚酸A11重量份，灯盏花素1重量份；
方案7：丹参丹酚酸A4重量份，灯盏花素1重量份；
方案8：丹参丹酚酸A9重量份，灯盏花素1重量份；
方案9：丹参丹酚酸A1重量份，灯盏花素17重量份；
方案10：丹参丹酚酸A1重量份，灯盏花素22重量份；
方案11：丹参丹酚酸A3重量份，灯盏花素5重量份；
方案12：丹参丹酚酸A4重量份，灯盏花素9重量份；
方案13：丹参丹酚酸A8重量份，灯盏花素6重量份；
方案14：丹参丹酚酸A8重量份，灯盏花素19重量份；
方案15：丹参丹酚酸A10重量份，灯盏花素1重量份；
方案16：丹参丹酚酸A12重量份，灯盏花素1重量份；
方案17：丹参丹酚酸A1重量份，灯盏花素23重量份；
方案18：丹参丹酚酸A5重量份；
方案19：灯盏花素5重量份；
实验方法：SD大鼠，雄性，8周龄，SPF级；测定方法：选用LC-MS/MS方法检测；血浆处理方法：精密量取血浆标本100μl，加入100μl 0.1％磷酸、400μl甲醇，涡旋混匀后，10000r/min离心5min。经0.2μm过滤器过滤后，上清液通过自动进样器进样；雄性SD大鼠，每组6只，经尾静脉单次给予不同方案的药物组，由生理盐水溶解，给药体积为2ml/kg。在药前及给药后2min、5min、10min、20min、30min、45min、1h、1.5h、2h、3h、4h、6h、10h、12h经大鼠尾静脉收集血样(0.6ml)，计算不同方案的制剂的半衰期，实验结果见表7：
表7不同方案半衰期的考察
五.毒理学研究
实验方案：
方案1：丹参丹酚酸A1重量份，灯盏花素21重量份；
方案2：丹参丹酚酸A1重量份，灯盏花素1重量份；
方案3：丹参丹酚酸A1重量份，灯盏花素5重量份；
方案4：丹参丹酚酸A1重量份，灯盏花素12重量份；
方案5：丹参丹酚酸A2重量份，灯盏花素1重量份；
方案6：丹参丹酚酸A3重量份，灯盏花素1重量份；
方案7：丹参丹酚酸A4重量份，灯盏花素17重量份；
方案8：丹参丹酚酸A1重量份，灯盏花素20重量份；
方案9：丹参丹酚酸A11重量份，灯盏花素1重量份；
方案10：丹参丹酚酸A5重量份；
方案11：灯盏花素5重量份；
实验方法：上述不同方案的药物组合物，进行毒理学实验，测定小鼠单次静脉给药急性毒性的LD50，实验结果见表8：
表8不同方案的LD50值
实验结论：通过药效学论证实验、药代动力学实验、毒理学实验，我们确定丹参丹酚酸A1-10重量份，灯盏花素1-20重量份；优选丹参丹酚酸A1-5重量份，灯盏花素1-12重量份。
六.制备实施例
实施例1
丹参丹酚酸A的提取纯化：
丹参用50％乙醇溶液提取得到醇提取液，醇提液浓缩乙醇至尽，调PH值至8.0、50℃温度、加热4小时，溶液进行过滤，滤液经HPD-300大孔树脂柱层析分离，先用水、20％稀乙醇洗脱，除去杂质，再用50％浓度的乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇至尽；浓缩液用聚酰胺层析柱分离，先用水、35％乙醇溶液洗脱，弃去洗脱液，再用75％乙醇溶液洗脱，回收乙醇至尽；浓缩液调PH值至2，经有机溶剂乙酸乙酯萃取，分离有机溶剂相，得含药溶液，浓缩，干燥或冷冻干燥，得丹参丹酚酸A；丹参丹酚酸A含量90.03％；
灯盏花素为现有技术制备，其中灯盏花素含量以灯盏花乙素计90.02％；
制剂制备：
药物组合为：丹参丹酚酸A10克，灯盏花素10克；
水针剂制备：
取丹参丹酚酸A和灯盏花素，按照水针剂的药剂学常规要求制备成水针剂1000支；
输液剂制备：
取丹参丹酚酸A和灯盏花素，按照输液剂的药剂学常规要求制备成输液剂1000瓶；
粉针剂制备：
取丹参丹酚酸A和灯盏花素，按照粉针剂的药剂学常规要求制备成粉针剂1000支；
单位剂量为5mg；
含有丹参丹酚酸A的注射药物组合物在制备治疗和/或预防心脑血管疾病、高血脂、肝损伤、痛风、肝纤维化、肺纤维化、肿瘤、衰老药物中的应用。
实施例2
丹参丹酚酸A的提取纯化：
丹参用80％乙醇溶液提取得到醇提取液，醇提液浓缩乙醇至尽，调PH值至6.0、130℃温度、表压0.17MPa压强，加热6小时；溶液进行过滤，滤液经HPD-450大孔树脂柱层析分离，先用水、30％稀乙醇洗脱，除去杂质，再用70％浓度的乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇至尽；浓缩液用葡聚糖凝胶LH-20层析柱分离，先用水、50％乙醇溶液洗脱，弃去洗脱液，再用95％乙醇溶液洗脱，回收乙醇至尽；浓缩液调PH值至5，经有机溶剂乙酸丙酯萃取，分离有机溶剂相，得含药溶液，浓缩，干燥或冷冻干燥，得丹参丹酚酸A，丹参丹酚酸A含量99.4％。
灯盏花素为现有技术制备，其中灯盏花素含量以灯盏花乙素计99.1％；
制剂制备：
药物组合为：丹参丹酚酸A100克，灯盏花素200克；
水针剂制备：
取丹参丹酚酸A和灯盏花素，按照水针剂的药剂学常规要求制备成水针剂1000支；
输液剂制备：
取丹参丹酚酸A和灯盏花素，按照输液剂的药剂学常规要求制备成输液剂1000瓶；
粉针剂制备：
取丹参丹酚酸A和灯盏花素，按照粉针剂的药剂学常规要求制备成粉针剂1000支；
单位剂量为900mg；
含有丹参丹酚酸A的注射药物组合物在制备治疗和/或预防心脑血管疾病、高血脂、肝损伤、痛风、肝纤维化、肺纤维化、肿瘤、衰老药物中的应用。
实施例3
丹参丹酚酸A的提取纯化：
丹参用65％乙醇溶液提取得到醇提取液，醇提液浓缩乙醇至尽，调PH值至5.5、115℃温度、表压0.07MPa压强，加热3小时；溶液进行过滤，滤液经1300-I大孔树脂柱层析分离，先用水、25％稀乙醇洗脱，除去杂质，再用65％浓度的乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇至尽；浓缩液用葡聚糖凝胶LH-20层析柱分离，先用水、45％乙醇溶液洗脱，弃去洗脱液，再用90％乙醇溶液洗脱，回收乙醇至尽；浓缩液调PH值至4.5，经有机溶剂乙酸丁酯萃取，分离有机溶剂相，得含药溶液，浓缩，干燥或冷冻干燥，得丹参丹酚酸A，含量为90.3％；
灯盏花素为现有技术制备，其中灯盏花素含量以灯盏花乙素计91.2％；
制剂制备：
药物组合为：丹参丹酚酸A10克，灯盏花素90克；
水针剂制备：
取丹参丹酚酸A和灯盏花素，按照水针剂的药剂学常规要求制备成水针剂1000支；
输液剂制备：
取丹参丹酚酸A和灯盏花素，按照输液剂的药剂学常规要求制备成输液剂1000瓶；
粉针剂制备：
取丹参丹酚酸A和灯盏花素，按照粉针剂的药剂学常规要求制备成粉针剂1000支；
单位剂量为1000mg；
含有丹参丹酚酸A的注射药物组合物在制备治疗和/或预防心脑血管疾病、高血脂、肝损伤、痛风、肝纤维化、肺纤维化、肿瘤、衰老药物中的应用。
实施例4
丹参丹酚酸A的提取纯化：
丹参用水提取得到水提取液，调PH值至4.0、125℃温度、表压0.14MPa压强，加热5.5小时；溶液进行过滤，滤液经AB-8大孔树脂柱层析分离，先用水、25％稀乙醇洗脱，除去杂质，再用65％浓度的乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇至尽；浓缩液用葡聚糖凝胶LH-20层析柱分离，先用水、30％乙醇溶液洗脱，弃去洗脱液，再用80％乙醇溶液洗脱，回收乙醇至尽；浓缩液调PH值至3.5，经有机溶剂正丁醇萃取，分离有机溶剂相，得含药溶液，浓缩，干燥或冷冻干燥，得丹参丹酚酸A，含量为94.7％；
灯盏花素为现有技术制备，其中灯盏花素含量以灯盏花乙素计95.1％；(市售)
制剂制备：
药物组合为：丹参丹酚酸A50克，灯盏花素120克；
水针剂制备：
取丹参丹酚酸A和灯盏花素，按照水针剂的药剂学常规要求制备成水针剂1000支；
输液剂制备：
取丹参丹酚酸A和灯盏花素，按照输液剂的药剂学常规要求制备成输液剂1000瓶；
粉针剂制备：
取丹参丹酚酸A和灯盏花素，按照粉针剂的药剂学常规要求制备成粉针剂1000支；
单位剂量为170mg；
含有丹参丹酚酸A的注射药物组合物在制备治疗和/或预防心脑血管疾病、高血脂、肝损伤、痛风、肝纤维化、肺纤维化、肿瘤、衰老药物中的应用。
实施例5
丹参丹酚酸A的提取纯化：
丹参50％乙醇溶液提取得到醇提取液，醇提液浓缩乙醇至尽，调PH值至4.5、125℃温度、表压0.14MPa压强，加热6小时；溶液进行过滤，滤液经HPD-100大孔树脂柱层析分离，先用水、15％稀乙醇洗脱，除去杂质，再用65％浓度的乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇至尽；浓缩液用葡聚糖凝胶LH-20层析柱分离，先用水、35％乙醇溶液洗脱，弃去洗脱液，再用60％乙醇溶液洗脱，回收乙醇至尽；浓缩液调PH值至2.5，经有机溶剂异丙醇萃取，分离有机溶剂相，得含药溶液，浓缩，干燥或冷冻干燥，得丹参丹酚酸A，含量91.2％；
灯盏花素为现有技术制备，其中灯盏花素含量以灯盏花乙素计91.9％；(文献方法“从灯盏花提取野黄芩苷的工艺研究”《中成药》2004年26卷10期，855-856。)
制剂制备：
药物组合为：丹参丹酚酸A50克，灯盏花素10克；
水针剂制备：
取丹参丹酚酸A和灯盏花素，按照水针剂的药剂学常规要求制备成水针剂1000支；
输液剂制备：
取丹参丹酚酸A和灯盏花素，按照输液剂的药剂学常规要求制备成输液剂1000瓶；
粉针剂制备：
取丹参丹酚酸A和灯盏花素，按照粉针剂的药剂学常规要求制备成粉针剂1000支；
单位剂量为600mg。
含有丹参丹酚酸A的注射药物组合物在制备治疗和/或预防心脑血管疾病、高血脂、肝损伤、痛风、肝纤维化、肺纤维化、肿瘤、衰老药物中的应用。
实施例6
丹参丹酚酸A的提取纯化：
丹参用水提取得到水提取液，调PH值至4.0、130℃温度、表压0.17MPa压强，加热5.5小时；溶液进行过滤，滤液经1400大孔树脂柱层析分离，先用水、25％稀乙醇洗脱，除去杂质，再用65％浓度的乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇至尽；浓缩液用葡聚糖凝胶LH-20层析柱分离，先用水、30％乙醇溶液洗脱，弃去洗脱液，再用80％乙醇溶液洗脱，回收乙醇至尽；浓缩液调PH值至3.5，经有机溶剂正丁醇萃取，分离有机溶剂相，得含药溶液，浓缩，干燥或冷冻干燥，得丹参丹酚酸A，含量为94.7％；
灯盏花素为现有技术制备，其中灯盏花素含量以灯盏花乙素计95.2％
制剂制备：
药物组合为：丹参丹酚酸A10克，灯盏花素120克；
水针剂制备：
取丹参丹酚酸A和灯盏花素，按照水针剂的药剂学常规要求制备成水针剂
1000支；
输液剂制备：
取丹参丹酚酸A和灯盏花素，按照输液剂的药剂学常规要求制备成输液剂1000瓶；
粉针剂制备：
取丹参丹酚酸A和灯盏花素，按照粉针剂的药剂学常规要求制备成粉针剂1000支；
单位剂量为130mg；
含有丹参丹酚酸A的注射药物组合物在制备治疗和/或预防心脑血管疾病、高血脂、肝损伤、痛风、肝纤维化、肺纤维化、肿瘤、衰老药物中的应用。
实施例7
丹参丹酚酸A的提取纯化：
丹参用65％乙醇溶液提取得到醇提取液，醇提液浓缩乙醇至尽，调PH值至5.5、110℃温度、表压0.05MPa压强，加热3小时；溶液进行过滤，滤液经D101大孔树脂柱层析分离，先用水、25％稀乙醇洗脱，除去杂质，再用65％浓度的乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇至尽；浓缩液用葡聚糖凝胶LH-20层析柱分离，先用水、45％乙醇溶液洗脱，弃去洗脱液，再用90％乙醇溶液洗脱，回收乙醇至尽；浓缩液调PH值至4.5，经有机溶剂乙酸丁酯萃取，分离有机溶剂相，得含药溶液，浓缩，干燥或冷冻干燥，得丹参丹酚酸A，含量为90.3％；
灯盏花素为现有技术制备，其中灯盏花素含量以灯盏花乙素计91.2％；
制剂制备：
药物组合为：丹参丹酚酸A100克，灯盏花素10克；
水针剂制备：
取丹参丹酚酸A和灯盏花素，按照水针剂的药剂学常规要求制备成水针剂1000支；
输液剂制备：
取丹参丹酚酸A和灯盏花素，按照输液剂的药剂学常规要求制备成输液剂1000瓶；
粉针剂制备：
取丹参丹酚酸A和灯盏花素，按照粉针剂的药剂学常规要求制备成粉针剂1000支；
单位剂量为110mg；
含有丹参丹酚酸A的注射药物组合物在制备治疗和/或预防心脑血管疾病、高血脂、肝损伤、痛风、肝纤维化、肺纤维化、肿瘤、衰老药物中的应用。
实施例8
丹参丹酚酸A的提取纯化：
丹参50％乙醇溶液提取得到醇提取液，醇提液浓缩乙醇至尽，调PH值至4.5、125℃温度、表压0.14MPa压强，加热6小时；溶液进行过滤，滤液经HPD-100A大孔树脂柱层析分离，先用水、15％稀乙醇洗脱，除去杂质，再用65％浓度的乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇至尽；浓缩液用葡聚糖凝胶LH-20层析柱分离，先用水、35％乙醇溶液洗脱，弃去洗脱液，再用60％乙醇溶液洗脱，回收乙醇至尽；浓缩液调PH值至2.5，经有机溶剂异丙醇萃取，分离有机溶剂相，得含药溶液，浓缩，干燥或冷冻干燥，得丹参丹酚酸A，含量91.2％；
灯盏花素为现有技术制备，其中灯盏花素含量以灯盏花乙素计大于98.7％；
制剂制备：
药物组合为：丹参丹酚酸A2克，灯盏花素18克；
水针剂制备：
取丹参丹酚酸A和灯盏花素，按照水针剂的药剂学常规要求制备成水针剂1000支；
输液剂制备：
取丹参丹酚酸A和灯盏花素，按照输液剂的药剂学常规要求制备成输液剂1000瓶；
粉针剂制备：
取丹参丹酚酸A和灯盏花素，按照粉针剂的药剂学常规要求制备成粉针剂1000支；
单位剂量为20mg；
含有丹参丹酚酸A的注射药物组合物在制备治疗和/或预防心脑血管疾病、高血脂、肝损伤、痛风、肝纤维化、肺纤维化、肿瘤、衰老药物中的应用。
实施例9
丹参丹酚酸A的提取纯化：
丹参用65％乙醇溶液提取得到醇提取液，醇提液浓缩乙醇至尽，调PH值至5.5、110℃温度、表压0.05MPa压强，加热3小时；溶液进行过滤，滤液经HPD-400大孔树脂柱层析分离，先用水、25％稀乙醇洗脱，除去杂质，再用65％浓度的乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇至尽；浓缩液用葡聚糖凝胶LH-20层析柱分离，先用水、45％乙醇溶液洗脱，弃去洗脱液，再用90％乙醇溶液洗脱，回收乙醇至尽；浓缩液调PH值至4.5，经有机溶剂乙酸丁酯萃取，分离有机溶剂相，得含药溶液，浓缩，干燥或冷冻干燥，得丹参丹酚酸A，含量为91.7％；
灯盏花素为现有技术制备，其中灯盏花素含量以灯盏花乙素计95.0％；
制剂制备：
药物组合为：丹参丹酚酸A80克，灯盏花素170克；
水针剂制备：
取丹参丹酚酸A和灯盏花素，按照水针剂的药剂学常规要求制备成水针剂1000支；
输液剂制备：
取丹参丹酚酸A和灯盏花素，按照输液剂的药剂学常规要求制备成输液剂1000瓶；
粉针剂制备：
取丹参丹酚酸A和灯盏花素，按照粉针剂的药剂学常规要求制备成粉针剂1000支；
单位剂量为500mg；
含有丹参丹酚酸A的注射药物组合物在制备治疗和/或预防心脑血管疾病、高血脂、肝损伤、痛风、肝纤维化、肺纤维化、肿瘤、衰老药物中的应用。
实施例10
丹参丹酚酸A的提取纯化：
丹参用水提取得到水提取液，调PH值至4.0、125℃温度、表压0.14MPa压强，加热5.5小时；溶液进行过滤，滤液经HPD-450A大孔树脂柱层析分离，先用水、25％稀乙醇洗脱，除去杂质，再用65％浓度的乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇至尽；浓缩液用葡聚糖凝胶LH-20层析柱分离，先用水、30％乙醇溶液洗脱，弃去洗脱液，再用80％乙醇溶液洗脱，回收乙醇至尽；浓缩液调PH值至3.5，经有机溶剂正丁醇萃取，分离有机溶剂相，得含药溶液，浓缩，干燥或冷冻干燥，得丹参丹酚酸A，含量为94.4％；
灯盏花素为现有技术制备，其中灯盏花素含量以灯盏花乙素计96.7％；
制剂制备：
药物组合为：丹参丹酚酸A40克，灯盏花素110克；
水针剂制备：
取丹参丹酚酸A和灯盏花素，按照水针剂的药剂学常规要求制备成水针剂1000支；
输液剂制备：
取丹参丹酚酸A和灯盏花素，按照输液剂的药剂学常规要求制备成输液剂1000瓶；
粉针剂制备：
取丹参丹酚酸A和灯盏花素，按照粉针剂的药剂学常规要求制备成粉针剂1000支；
单位剂量为300mg。
含有丹参丹酚酸A的注射药物组合物在制备治疗和/或预防心脑血管疾病、高血脂、肝损伤、痛风、肝纤维化、肺纤维化、肿瘤、衰老药物中的应用。
注：本发明所要求保护的具体技术方案，不限于上述实施例所表达的技术方案的具体组合。
Claims (9)
1.一种含有丹参丹酚酸A的注射药物组合物，其特征在于：丹参丹酚酸A1-10重量份，灯盏花素1-20重量份。
2.根据权利要求1所述的一种含有丹参丹酚酸A的注射药物组合物，其中丹参丹酚酸A1-5重量份，灯盏花素1-12重量份。
3.根据权利要求1或2所述的一种含有丹参丹酚酸A的注射药物组合物，其中灯盏花素含量以灯盏花乙素计大于等于90％且小于100％。
4.根据权利要求1或2所述的一种含有丹参丹酚酸A的注射药物组合物，其中丹参丹酚酸A的含量大于等于90％且小于100％。
5.根据权利要求1或2所述的一种含有丹参丹酚酸A的注射药物组合物，其中药物组合物制备成单位剂量的水针剂、输液剂、粉针剂。
6.根据权利要求5所述的一种含有丹参丹酚酸A的注射药物组合物，其中单位剂量为5mg-1000mg。
7.根据权利要求5所述的一种含有丹参丹酚酸A的注射药物组合物，其中单位剂量为20-500mg。
8.根据权利要求5所述的一种含有丹参丹酚酸A的注射药物组合物，其中水针剂、输液剂、粉针剂的原料药包括灯盏花素，其制备方法为：
丹参丹酚酸A的提取纯化：
丹参用水或乙醇溶液提取得到水提取液或醇提取液，醇提液浓缩乙醇至尽，调PH值至7.5-9.0、30-80℃温度、加热1-6小时或调PH值至3.5-6.0、110-130℃温度、表压0.05MPa-0.17MPa压强，加热1-6小时；溶液进行过滤，滤液经非极性或弱极性大孔树脂柱层析分离，所述大孔树脂柱为HPD-100、HPD-100A、HPD-300、HPD-400、HPD-400A、HPD-450、D101、1300-I、1400或AB-8，先用水、10-30％稀乙醇洗脱，除去杂质，再用30-70％浓度的乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇至尽；浓缩液用葡聚糖凝胶LH-20或聚酰胺层析柱分离，先用水、20-50％乙醇溶液洗脱，弃去洗脱液，再用50-95％乙醇溶液，洗脱液回收乙醇至尽；浓缩液调PH值至2-5，经有机溶剂萃取，有机溶剂选自乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、正丁醇、异丙醇中的一种，分离有机溶剂相，得含药溶液，浓缩，干燥或冷冻干燥，得丹参丹酚酸A；
制剂制备：
水针剂制备：
取丹参丹酚酸A和灯盏花素，按照水针剂的药剂学常规要求制备成水针剂；
输液剂制备：
取丹参丹酚酸A和灯盏花素，按照输液剂的药剂学常规要求制备成输液剂；
粉针剂制备：
取丹参丹酚酸A和灯盏花素，按照粉针剂的药剂学常规要求制备成粉针剂。
9.根据权利要求1、2、8任一项所述的一种含有丹参丹酚酸A的注射药物组合物，其特征在于检测分析方法：
(1)丹参丹酚酸A检测分析方法：
色谱柱：C18反相色谱柱，NUCLEODUR，250*4.6mm，ODS；
色谱条件与系统适用性实验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流速1.0ml/min；柱温35℃；检测波长286nm；理论板数按丹酚酸A计应不低于60000；以乙腈-0.2％醋酸水溶液为流动相，按下述梯度洗脱条件进行梯度洗脱，运行90分钟；
0-15分钟时，乙腈的比例由10％升至20％，0.2％醋酸水溶液的比例由90％降至80％；15-55分钟时，乙腈的比例由20％升至30％，0.2％醋酸水溶液的比例由80％降至70％；55-65分钟时，乙腈的比例由30％升至50％，0.2％醋酸水溶液的比例由70％降至50％；65-72分钟时，乙腈的比例由50％升至80％，0.2％醋酸水溶液的比例由50％降至20％；72-77分钟时，乙腈的比例80％，0.2％醋酸水溶液的比例20％；77-80分钟时，乙腈的比例由80％降至10％，0.2％醋酸水溶液的比例由20％升至90％；80-90分钟时，保持乙腈-0.2％醋酸水溶液以10∶90的比例进行洗脱；
对照品溶液的配制：精密称取丹酚酸A对照品到容量瓶中，加甲醇溶解摇匀，并稀释至刻度；
样品溶液的配制：精密称取丹酚酸A样品，加入甲醇溶解摇匀，并稀释至刻度；或精密量取或称取制剂，加甲醇溶解摇匀，并稀释至刻度；
测定法：分别精密吸取对照品溶液和样品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，采用外标法以峰面积计算，即得；
(2)灯盏花素检测分析：
色谱条件与系统适用性实验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流速1.0ml/min；柱温30℃；检测波长335nm；理论板数按灯盏花乙素计不低于2000；以体积比甲醇∶冰醋酸∶水为32∶2∶66溶液为流动相；
对照品溶液的制备：精密称取灯盏花乙素对照品，加甲醇溶解摇匀，并稀释至刻度；
供试品溶液的制备：精密称取灯盏花素，加甲醇溶解摇匀，并稀释至刻度；或精密称取或量取制剂，加甲醇溶解摇匀，并稀释至刻度；
测定法：分别精密吸取对照品溶液和样品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，采用外标法以峰面积计算，即得。
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