CN108324703B - 用于保护缺血心肌的注射剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于保护缺血心肌的注射剂及其制备方法，按质量份数计，该注射用乳剂包含：N‑辛二酰苯胺异羟肟酸1～5份；乳化剂0.2～12.5份；注射用油2～100份；增溶剂0.02～5份；油酸0.03～0.4份；甘油0.4～12.5份，以及注射用水余量。该注射用乳剂可有效地用于提高心脏介入手术前N‑辛二酰苯胺异羟肟酸在心血管等亲脂性器官和/或组织的局部药物浓度，提高N‑辛二酰苯胺异羟肟酸的生物利用度，降低其全身性副作用，实现在缺血或再灌注损伤状态下对心肌的有效保护，减少或避免心急梗死的发生。同时，该注射用乳剂也为N‑辛二酰苯胺异羟肟酸在治疗癌症的应用中提供一种新的可供选择的剂型。

Description

用于保护缺血心肌的注射剂及其制备方法
技术领域
本发明属于药物制剂领域，涉及一种用于保护缺血心肌的注射剂及其制备方法，具体涉及一种包含N-辛二酰苯胺异羟肟酸的用于保护缺血心肌的注射用乳剂及其制备方法。
背景技术
组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitor，HDACI)是一类具有干扰组蛋白去乙酰化酶的功能的化合物，已有大量的关于其在治疗HIV、恶性肿瘤或慢性纤维化性疾病等方面的研究报道。
已知N-辛二酰苯胺异羟肟酸(suberoylanilide hydroxamic acid，SAHA，化学结构见下式I)作为一种组蛋白去乙酰酶(HDAC)抑制剂，能够通过诱导细胞分化、阻断细胞周期、诱导细胞调控而发挥治疗作用。体外研究表明，N-辛二酰苯胺异羟肟酸以纳摩尔级浓度(IC50<86nmol/L)即可抑制HDAC 1、HDAC 2和HDAC 3(I型)以及HDAC 6(II型)酶的活性。在某些癌细胞内，抑制过量的HDAC酶可激活正常细胞。因此，N-辛二酰苯胺异羟肟酸通过降低HDAC活性有助于减缓或中止某些癌细胞生长基因的激活。
Figure BDA0001559689680000011
目前，N-辛二酰苯胺异羟肟酸已经经美国食品药品监督管理局批准上市，商品名为伏立诺他(vorinostat)，用于治疗加重、持续和复发，或用两种全身性药物治疗后无效的皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL，一种影响皮肤的白血细胞类型的T细胞癌)。
最新的研究还表明，N-辛二酰苯胺异羟肟酸可以在临床上相关的再灌注的情况下经递送来降低大型动物模型的心肌梗死面积。在缺血/再灌注期间，N-辛二酰苯胺异羟肟酸至少部分通过诱导自噬流(autophagic flux)产生心脏保护作用(Min Xie et al.,Histone Deacetylase Inhibition Blunts Ischemia/Reperfusion Injury by InducingCardiomyocyte Autophagy,Circulation.2014；129:1139-1151)。因此，N-辛二酰苯胺异羟肟酸对于缺血或再灌注损伤状态下的心肌保护，例如减少心脏介入手术期间心肌梗死的发生具有重要的临床应用价值。
然而，目前上市的N-辛二酰苯胺异羟肟酸制剂仅限于抗肿瘤的口服剂型。由于N-辛二酰苯胺异羟肟酸的水溶性差，而且口服N-辛二酰苯胺异羟肟酸还存在明显的首过代谢消除，导致其口服生物利用度很低，无法在心血管等亲脂性组织中形成有效的治疗浓度。另外，N-辛二酰苯胺异羟肟酸只有作为原型才能起到治疗作用，而其代谢产物均无活性，因此不能通过化学衍生化的方式来提高其口服生物利用度。此外，如果在心脏介入手术前，口服N-辛二酰苯胺异羟肟酸还会导致全身性副作用。
现有技术中存在的上述问题极大地限制了N-辛二酰苯胺异羟肟酸的临床应用，特别是其在缺血/再灌注期间对心肌保护的应用，因为不能在心脏介入手术前在心脏组织中实现有效的局部药物浓度。因此，急需开发一种新的N-辛二酰苯胺异羟肟酸的药物剂型以解决N-辛二酰苯胺异羟肟酸在缺血心肌保护的过程中出现的心脏组织中局部药物浓度过低的问题。
发明内容
为了克服现有技术的上述缺陷，本发明的目的在于提供一种用于保护缺血心肌的注射用乳剂及其制备方法。该注射用乳剂可有效地用于心脏介入手术前提高N-辛二酰苯胺异羟肟酸在心血管等亲脂性器官和/或组织的局部药物浓度，提高N-辛二酰苯胺异羟肟酸的生物利用度，降低其全身性副作用，实现在缺血或再灌注损伤状态下对心肌的有效保护，减少或避免心急梗死的发生。同时，该注射用乳剂也为N-辛二酰苯胺异羟肟酸在治疗癌症等方面的应用提供了一种新的可供选择的剂型。
用于实现上述目的的技术方案如下：
一种用于保护缺血心肌的注射用乳剂，按质量份数计，其包含：
N-辛二酰苯胺异羟肟酸1～5份；
乳化剂0.2～12.5份；
注射用油2～100份；
增溶剂0.02～5份；
油酸0.03～0.4份；
甘油0.4～12.5份，以及
注射用水余量。
优选地，按质量份数计，所述注射用乳剂包含：
N-辛二酰苯胺异羟肟酸3份；
乳化剂0.5～5份；
注射用油5～40份；
增溶剂0.05～2份；
油酸0.03～0.3份；
甘油1.0～5份，以及
注射用水余量。
更优选地，按质量份数计，所述注射用乳剂包含：
N-辛二酰苯胺异羟肟酸3份；
乳化剂1.0～2.5份；
注射用油10～20份；
增溶剂0.1～1份；
油酸0.05～0.15份；
甘油2.0～2.5份，以及
注射用水余量。
进一步优选地，按质量份数计，所述注射用乳剂包含：N-辛二酰苯胺异羟肟酸3份；
乳化剂1.0～2.5份；
注射用油10～20份；
增溶剂0.6份；
油酸0.05～0.15份；
甘油2.0～2.5份，以及
注射用水余量。
再优选地，按质量份数计，所述注射用乳剂包含：
N-辛二酰苯胺异羟肟酸3份；
乳化剂2份；
注射用油20份；
增溶剂0.6份；
油酸0.1份；
甘油2.5份，以及
注射用水余量。
在上述注射用乳剂中，所述乳化剂优选为磷脂；更优选地，所述磷脂选自大豆磷脂、卵磷脂、氢化大豆磷脂或氢化卵磷脂中的一种或多种；进一步优选地，所述磷脂为大豆磷脂和/或卵磷脂。
在上述注射用乳剂中，所述注射用油可以选自注射用大豆油、注射用红花油、注射用棉籽油、注射用芝麻油、注射用茶油、注射用橄榄油或注射用中链油中的一种或多种；优选地，所述注射用油为注射用大豆油。
在上述注射用乳剂中，所述增溶剂可以选自吐温-80、丙二醇、泊洛沙姆188或聚乙二醇15羟硬脂酸酯(Solutol HS 15)中的一种或多种；优选地，所述增溶剂为吐温-80和/或丙二醇。
根据本发明的一个具体实施方案，按质量份数计，所述注射用乳剂包含：
N-辛二酰苯胺异羟肟酸3份；
大豆磷脂或卵磷脂2份；
注射用大豆油20份；
吐温-80或丙二醇0.6份；
油酸0.1份；
甘油2.5份，以及
注射用水余量。
本发明还提供了所述注射用乳剂的制备方法，该制备方法包括以下步骤：
(1)向N-辛二酰苯胺异羟肟酸加入增溶剂和甘油，加热，再加注射用水至N-辛二酰苯胺异羟肟酸溶解；
(2)向步骤(1)得到的溶液加入乳化剂，混匀，制得水相；
(3)将油酸与注射用油混匀，制得油相；
(4)将水相和油相在加热下高速剪切混合，制得初乳；
(5)将初乳在加压条件下进行均质化。
在所述制备方法的步骤(1)中，优选地，所述加热至50～90℃，更优选至70～80℃。
在所述制备方法的步骤(2)中，优选地，所述混匀采用剪切混合；优选地，所述剪切混合的速度为3000～10000转/分；更优选地，所述剪切混合的速度为5000～6000转/分。
在所述制备方法的步骤(4)中，优选地，所述加热至70℃～80℃且所述高速剪切混合的剪切速度为3000～10000转/分，优选为5000～6000转/分；优选地，所述高速剪切混合进行10～40分钟，更优选进行25～40分钟，最优选进行30分钟。
在所述制备方法的步骤(5)中，优选地，所述加压条件为400～1200巴，更优选为700～900巴；所述均质化可以进行1-6次，优选进行5～6次。
优选地，所述制备方法还包括以下步骤：
(6)封装；
(7)灭菌。
优选地，所述灭菌的条件为115℃下30分钟。
另一方面，本发明提供了所述的注射用乳剂在制备用于保护缺血心肌的药物、用于治疗心肌缺血再灌注损伤的药物或用于治疗心肌梗死的药物中的用途。
本发明人经过大量研究发现，注射用乳剂可以作为一种有效提高N-辛二酰苯胺异羟肟酸在心血管等亲脂性器官和/或组织中的生物利用度的有效手段。然而，N-辛二酰苯胺异羟肟酸(伏立诺他)是一种油水均难溶的药物，本发明人在实验过程中发现使用传统注射用处方制备的乳剂稳定性很差，均质化完毕后出现明显的药物析出，高速离心后还能看到明显的药物粉末层，因此需要考虑加入增溶剂和稳定剂来改善所述注射用乳剂的稳定性，从而确保实现其提高N-辛二酰苯胺异羟肟酸在心脏组织中的有效浓度和生物利用度的效果。
重要的是，本发明人发现对于这种特殊的难溶性药物而言并非加入任何增溶剂和/或稳定剂均可以有效改善所得到的注射用乳剂的稳定性，而在本发明选择的增溶剂和稳定剂的存在下，可以获得稳定最佳的注射用乳剂。此外，本发明人还注意到注射用乳剂中各种组成成分的配比也对注射用乳剂的稳定性存在显著的影响。为此，本发明人对包含N-辛二酰苯胺异羟肟酸的注射用乳剂的处方进行了大量研究、筛选和优化，最终获得了如本发明所述的具有优异稳定性的注射用乳剂及其制备方法。
实验表明，本发明所述注射用乳剂可有效提高N-辛二酰苯胺异羟肟酸在心血管等亲脂性器官和/或组织的局部有效浓度，改善了N-辛二酰苯胺异羟肟酸的生物利用度，有利于实现在缺血或再灌注损伤状态下对心肌的有效保护，减少或避免了心脏介入手术过程中心肌梗死的发生。同时，由于成功地提高了N-辛二酰苯胺异羟肟酸在心脏等组织的局部药物浓度，降低或避免了其全身性副作用，也改善了该药物对肿瘤等其他疾病的治疗效果。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：Sham oral表示假手术口服灌胃组；Sham i.v表示假手术静脉注射组；I/R oral Pre表示缺血再灌注一次口服灌胃组；I/R i.v Pre表示缺血再灌注一次静脉注射组；I/R oral Pre+Reperfusion表示缺血再灌注分次口服灌胃组；I/R i.v Pre+Reperfusion表示缺血再灌注分次静脉注射组；MI oral表示心肌梗死口服灌胃组；MI i.v表示心肌梗死静脉注射组。
图1为采用心脏超声检测经口服灌胃和静脉注射给予N-辛二酰苯胺异羟肟酸对缺血再灌注(I/R)组小鼠的影响的照片(24h)。
图2显示采用心脏超声检测经口服灌胃和静脉注射给予N-辛二酰苯胺异羟肟酸对缺血再灌注(I/R)组小鼠的影响的分析结果(24h)；其中，*P<0.05，与Sham oral相比；#P<0.05，与I/R oral Pre相比；+P<0.05，与I/R oral Pre+Reperfusion相比；n.s.，无显著性差异。
图3为采用心脏超声检测经口服灌胃和静脉注射给予N-辛二酰苯胺异羟肟酸对心肌梗死(MI)组小鼠的影响的照片(7天、14天、28天)。
图4显示采用心脏超声检测经口服灌胃和静脉注射给予N-辛二酰苯胺异羟肟酸对心肌梗死(MI)组小鼠的影响的分析结果(7天、14天、28天)；其中，*P<0.05，与Sham oral相比；#P<0.05，与MI oral相比。
图5为采用Evans blue和TTC双染色检测经口服灌胃和静脉注射给予N-辛二酰苯胺异羟肟酸对缺血再灌注组小鼠的影响的照片(24小时)；其中，深灰色显示非缺血区；浅灰色显示缺血危险区(实线圈出区域)；白色显示缺血后梗死区(虚线圈出区域)。
图6显示采用Evans blue和TTC双染色检测经口服灌胃和静脉注射给予N-辛二酰苯胺异羟肟酸对缺血再灌注组小鼠的影响的心脏组织双染色面积量化分析结果(24h)；其中，*P<0.05，与Sham oral相比；#P<0.05，与I/R oral Pre相比；+P<0.05，与I/R oral Pre+Reperfusion相比；n.s.，无显著性差异。
图7显示采用Masson染色检测经口服灌胃和静脉注射给予N-辛二酰苯胺异羟肟酸对心肌梗死组小鼠的影响的照片(28天)；其中，深灰色为正常心肌组织，浅灰色为纤维组织(实线圈出区域)。
图8显示采用Masson染色检测经口服灌胃和静脉注射给予N-辛二酰苯胺异羟肟酸对心肌梗死组小鼠的影响分析结果(28天)；其中，#P<0.05，与MI oral相比。
图9显示采用Western blot检测经口服灌胃和静脉注射给予N-辛二酰苯胺异羟肟酸对缺血再灌注组小鼠心脏组织组蛋白H3和H4乙酰化水平的影响的照片和分析结果；其中，*P<0.05，与Sham oral相比；#P<0.05，与I/R oral Pre相比；+P<0.05，与I/R oral Pre+Reperfusion相比；n.s.，无显著性差异。
图10显示采用Western blot检测经口服灌胃和静脉注射给予N-辛二酰苯胺异羟肟酸对心肌梗死组小鼠心脏组织组蛋白H3和H4乙酰化水平的影响的照片和分析结果；其中，*P<0.05，与Sham oral相比；#P<0.05，与MI oral相比。
图11为采用超声检测不同处方的注射用乳剂对缺血再灌注(I/R)组小鼠的影响的照片(24h)。
图12显示采用超声检测不同处方的注射用乳剂对缺血再灌注(I/R)组小鼠的影响的分析结果(24h)；其中，*P<0.05，处方1-6与处方7-8相比。
图13为采用超声检测不同处方的注射用乳剂对缺血再灌注(I/R)组小鼠的影响的照片(7天、14天、28天)。
图14显示采用超声检测不同处方的注射用乳剂对缺血再灌注(I/R)组小鼠的影响的分析结果(7天)；其中，*P<0.05，处方1-6与处方7-8相比。
图15显示采用超声检测不同处方的注射用乳剂对缺血再灌注(I/R)组小鼠的影响的分析结果(14天)；其中，*P<0.05，处方1-6与处方7-8相比。
图16显示采用超声检测不同处方的注射用乳剂对缺血再灌注(I/R)组小鼠的影响的分析结果(28天)；其中，*P<0.05，处方1-6与处方7-8相比。
图17为采用Evans blue和TTC双染色检测不同处方的注射用乳剂对缺血再灌注(I/R)组小鼠的影响的照片(24h)；其中，深灰色显示非缺血区；浅灰色显示缺血危险区(实线圈出区域)；白色显示缺血后梗死区(虚线圈出区域)。
图18显示采用Evans blue和TTC双染色检测不同处方的注射用乳剂对缺血再灌注(I/R)组小鼠的影响的心脏组织双染色面积量分析结果(24h)；其中，*P<0.05，处方1-6与处方7-8相比。
图19为采用Masson染色检测不同处方的注射用乳剂对心肌梗死(MI)组小鼠的影响的照片(28天)；其中，深灰色为正常心脏组织区域，浅灰色为梗死后形成的纤维组织区(实线圈出区域)。
图20显示采用Masson染色检测不同处方的注射用乳剂对心肌梗死(MI)组小鼠的影响的分析结果(28天)；其中，*P<0.05，处方1-6与处方7-8相比。
图21显示采用Western blot检测不同处方的注射用乳剂对缺血再灌注(I/R)组小鼠心脏组织组蛋白H3和H4乙酰化水平的影响的照片和分析结果；其中，*P<0.05，处方1-6与处方7-8相比。
图22显示采用Western blot检测不同处方的注射用乳剂对心肌梗死(MI)组小鼠心脏组织组蛋白H3和H4乙酰化水平的影响的照片和分析结果；其中，*P<0.05，处方1-6与处方7-8相比。
具体实施方式
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
实施例1
一、处方1
原辅料名称 处方量(g)
N-辛二酰苯胺异羟肟酸 15
大豆磷脂 10
注射用大豆油 100
吐温-80 3
油酸 0.5
甘油 12.5
注射用水 适量
制成500ml。
二、工艺：
称取处方量的N-辛二酰苯胺异羟肟酸，加入吐温-80和甘油，加热至80℃，加水约100ml，至原料药溶解，加入大豆磷脂，剪切(6000rpm)混合均匀，制成水相；称取油酸和注射用大豆油，混合均匀，制成油相；油水两相在70℃条件下，高速剪切混合(6000rpm)30分钟，制成初乳。将初乳在800bar压力下进行均质化，循环6遍，装入安瓿，封口，115℃下灭菌30分钟即得。
实施例2
一、处方2
原辅料名称 处方量(g)
N-辛二酰苯胺异羟肟酸 15
大豆磷脂 5
注射用大豆油 75
泊洛沙姆188 3
油酸 0.75
甘油 12.5
注射用水 适量
制成500ml。
二、工艺：
称取处方量的N-辛二酰苯胺异羟肟酸，加入泊洛沙姆188和甘油，加热至80℃，加水约100ml，至原料药溶解，加入大豆磷脂，剪切(6000rpm)混合均匀，制成水相；称取油酸和注射用大豆油，混合均匀，制成油相；油水两相在80℃条件下，高速剪切混合(5000rpm)40分钟，制成初乳。将初乳在700bar压力下进行均质化，循环6遍，装入安瓿，封口，115℃下灭菌30分钟即得。
实施例3
一、处方3
原辅料名称 处方量(g)
N-辛二酰苯胺异羟肟酸 15
大豆磷脂 12.5
注射用大豆油 50
聚乙二醇15羟硬脂酸酯 5
油酸 0.25
甘油 11.5
注射用水 适量
制成500ml
二、工艺：
称取处方量的N-辛二酰苯胺异羟肟酸，加入聚乙二醇15羟硬脂酸酯和甘油，加热至80℃，加水约100ml，至原料药溶解，加入大豆磷脂，剪切(5000rpm)混合均匀，制成水相；称取油酸和注射用大豆油，混合均匀，制成油相；油水两相在80℃条件下，高压剪切混合(6000rpm)40分钟，制成初乳。将初乳在800bar压力下进行均质化，循环6遍，装入安瓿，封口，115℃下灭菌30分钟即得。
实施例4
一、处方4
原辅料名称 处方量(g)
N-辛二酰苯胺异羟肟酸 15
大豆磷脂 11.5
注射用橄榄油 85
吐温-80 3
油酸 0.6
甘油 10
注射用水 适量
制成500ml
二、工艺：
称取处方量的N-辛二酰苯胺异羟肟酸，加入吐温-80和甘油，加热至70℃，加水约100ml，至原料药溶解，加入大豆磷脂，剪切(6000rpm)混合均匀，制成水相；称取油酸和注射用橄榄油，混合均匀，制成油相；油水两相在70℃条件下，高速剪切混合(6000rpm)25分钟，制成初乳。将初乳在800bar压力下进行均质化，循环6遍，装入安瓿，封口，115℃下灭菌30分钟即得。
实施例5
一、处方5
原辅料名称 处方量(g)
N-辛二酰苯胺异羟肟酸 15
卵磷脂 10
注射用中链油 100
吐温-80 0.5
油酸 0.5
甘油 12.5
注射用水 适量
制成500ml
二、工艺：
称取处方量的N-辛二酰苯胺异羟肟酸，加入吐温-80和甘油，加热至80℃，加水约100ml，至原料药溶解，加入卵磷脂，剪切(5000rpm)混合均匀，制成水相；称取油酸和注射用中链油，混合均匀，制成油相；油水两相在70℃条件下，高速剪切混合(6000rpm)30分钟，制成初乳。将初乳在900bar压力下进行均质化，循环5遍，装入安瓿，封口，115℃下灭菌30分钟即得。
实施例6
一、处方6
原辅料名称 处方量(g)
N-辛二酰苯胺异羟肟酸 15
大豆磷脂 10
注射用大豆油 100
丙二醇 3
油酸 0.5
甘油 12.5
注射用水 适量
制成500ml
二、工艺：
称取处方量的N-辛二酰苯胺异羟肟酸，加入甘油和丙二醇，加热至70℃，加水约100ml，至原料药溶解，加入大豆磷脂，剪切(6000rpm)混合均匀，制成水相；称取油酸和注射用大豆油，混合均匀，制成油相；油水两相在70℃条件下，高速剪切混合(5000rpm)30分钟，制成初乳。将初乳在800bar压力下进行均质化，循环6遍，装入安瓿，封口，115℃下灭菌30分钟即得。
对比例1
一、处方7
原辅料名称 处方量(g)
N-辛二酰苯胺异羟肟酸 15
大豆磷脂 10
注射用大豆油 100
吐温-80 3
维生素E 0.5
甘油 12.5
注射用水 适量
制成500ml
二、工艺：
称取处方量的N-辛二酰苯胺异羟肟酸，加入甘油和吐温-80，加热至80℃，加水约100ml，至原料药溶解，加入大豆磷脂，剪切(6000rpm)混合均匀，制成水相；称取维生素E和注射用大豆油，混合均匀，制成油相；油水两相在70℃条件下，高速剪切混合(6000rpm)30分钟，制成初乳。将初乳在800bar压力下进行均质化，循环6遍，装入安瓿，封口，115℃下灭菌30分钟即得。
对比例2
一、处方8
原辅料名称 处方量(g)
N-辛二酰苯胺异羟肟酸 15
大豆磷脂 10
注射用大豆油 100
吐温-80 3
聚氧乙烯氢化蓖麻油 0.5
甘油 12.5
注射用水 适量
制成500ml
二、工艺：
称取处方量的N-辛二酰苯胺异羟肟酸，加入吐温-80和甘油，加热至80℃，加水约100ml，至原料药溶解，加入大豆磷脂，剪切(6000rpm)混合均匀，制成水相；称取聚氧乙烯氢化蓖麻油和注射用大豆油，混合均匀，制成油相；油水两相在70℃条件下，高速剪切混合(6000rpm)30分钟，制成初乳。将初乳在800bar压力下进行均质化，循环6遍，装入安瓿，封口，115℃下灭菌30分钟即得。
药理实验例
1.动物模型的建立
1.1实验材料：
眼科直剪和弯剪各1把，带齿弯镊和直镊各1把，无齿弯镊和直镊各1把，蚊式血管钳1把，6号带针缝线若干，弯盘，纱布和无菌棉签若干，生理盐水，吸入式气体麻醉机，10ml和50ml注射器，小鼠灌胃针，小鼠手术台，保温垫，1.5ml离心管，15ml冻存管，细胞培养皿，手术刀片，手术刀柄，2％异氟烷。
1.2假手术(Sham)和缺血再灌注小鼠模型(I/R)的建立
小鼠接受2％异氟烷吸入麻醉后，术者在其左侧前胸壁上切开一个1.2cm左右的皮肤切口，并预留置一荷包缝合。在荷包内钝性分离胸部肌肉组织后，暴露左胸第四肋间隙。接下来，在该荷包内使用蚊式血管钳在第四肋间隙的位置轻柔而迅速地撑开胸膜腔和心包腔，挤出心脏。使用6号带针缝线于心脏左冠状动脉前降支处结扎一活结，肉眼观察相应区域心肌组织颜色转为灰白，确认结扎成功。其后，迅速将心脏放置回胸腔内，排净腔内空气，收紧荷包关闭胸腔，肌肉和皮肤，并留置结扎左前降支的活结的线头于胸外。将小鼠置于空气流通的环境中，监控其复苏情况。缺血45分钟后，通过轻柔平缓地拖拽胸外留置的线头松解结扎前降支的滑结，心肌组织获得血流再灌注。对照的假手术小鼠除了不于前降支处结扎活结外，其余操作同缺血再灌注小鼠。
1.3假手术(Sham)和心梗小鼠模型(MI)的建立
小鼠接受2％异氟烷吸入麻醉后，术者在其左侧前胸壁上切开一个1.2cm左右的皮肤切口，并预留置一荷包缝合。在荷包内钝性分离胸部肌肉组织后，暴露左胸第四肋间隙。接下来，在该荷包内使用蚊式血管钳在第四肋间隙的位置轻柔而迅速地撑开胸膜腔和心包腔，挤出心脏。使用6号带针缝线直接结扎心脏左冠状动脉前降支，肉眼观察相应区域的心肌组织颜色转为灰白，确认结扎成功。其后，迅速将心脏放置回胸腔内，排净腔内空气，通过收紧荷包关闭胸腔，肌肉和皮肤。对照的假手术小鼠除了不结扎前降支外，其余操作同心梗小鼠。
2.检测方法
2.1心脏功能的超声检测
缺血再灌注组小鼠：术后24小时后再次吸入2％异氟烷麻醉，应用小动物超声波影像诊断仪(Vevo Rolling Imaging Cart，Canada，Vevo 770)分别沿小鼠心脏短轴和长轴采图，其后测定各项心脏超声指标(包括：射血分数(EF％)、缩短分数(FS％)、左室舒张末期内径(LVIDd)、左心室收缩末期内径(LVIDs)、左室舒张末期容积(LV volume；d)、左室收缩末期容积(LVvolume；s)等)
心梗组小鼠：分别于术后7天、14天、28天进行心脏超声检查，麻醉和超声测定步骤同上所述。
2.2 Evans blue和TTC双染色检测
1％戊巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉小鼠后，打开胸腔暴露心脏，将造模时结扎的左冠状动脉前降支部位再次结扎左冠状动脉前降支。以5％酞菁蓝染色液沿升主动脉根部逆行注射，之后摘取小鼠心脏，置于冻存管中于-80℃冰箱冻存20分钟。其后，取出冰冻的心脏，从结扎部位起向下，迅速将心脏切为1-2cm厚的切片。将切片置于2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)的磷酸盐缓冲溶液中，在37℃的水浴箱中避光孵育30分钟。之后将心脏切片用甲醛浸泡4小时固定后用体视仪采图。经过上述步骤，在展示的病理图中，LV的非缺血区域为深灰色，缺血危险区域为浅灰色(实线圈出区域)，缺血后梗死区域为白色(虚线圈出区域)。图像使用Image J软件进行量化分析，定量梗死区域(IF)、缺血危险区(AAR)和左室面积(LV)并计算其比值。
2.3 Masson染色检测
1％戊巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉处死小鼠后摘取小鼠心脏。心脏在多聚甲醛(4℃)中处理24小时，然后在流动水中冲洗1小时。将处理后的心脏标本组织包埋并切片。将切片放置于烤箱中，烘烤50分钟。标本脱蜡后置于磷钼酸及重铬酸钾混合液中过夜。标本经蒸馏水冲洗后，在苏木素染液中染4分钟，其后充分水洗，再酒精分化3秒。标本经立春红染色5分钟。1％磷钼酸水溶液分化3-5分钟，后用1％苯胺蓝处理15秒。标本经充分冲洗后，用95％酒精、无水酒精、二甲苯顺序浸泡3秒，后用中性树胶封固。显微镜下观察并拍照。应用ImageJ软件量化分析图像，定量小鼠心肌梗死区面积(IF)和左心室总面积(LV)并计算其比值。
2.4 Western blot
1％戊巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉处死小鼠，取材小鼠心脏，使用眼科剪剪碎心肌组织后再进行充分研磨。其后，应用组蛋白提取试剂盒提取组蛋白，检测各组的组蛋白浓度，并调整蛋白上样量为50μg。通过15％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后转至0.22μm的PVDF膜上，封闭液稀释一抗(1:1000)，4℃孵育15h，洗膜后封闭液稀释二抗(1:5000)，温室孵育2h。再次洗膜后化学发光成像。应用Image J软件分析并定量蛋白条带上乙酰化组蛋白3、总组蛋白3、乙酰化组蛋白4和总组蛋白4的灰度值，计算比值并进行统计学分析。
3.检测结果
3.1注射给药与口服给药的比较
3.1.1待测药剂在缺血再灌注模型中的作用
分别设置缺血再灌注小鼠一次给药组(附图中标注为I/R Pre)和缺血再灌注小鼠分次给药组(附图中标注为I/R Pre+Reperfusion)。其中，对于缺血再灌注小鼠一次给药组，待测药剂按照50mg/kg的剂量通过口服灌胃(附图中标注为I/R oral)或尾静脉注射(附图中标注为I/R i.v)的方式给予I/R小鼠，于手术操作一小时前一次给予所有药物。对于缺血再灌注小鼠分次给药组，待测药剂通过口服灌胃(附图中标注为I/R oral)或尾静脉注射(附图中标注为I/R i.v)的方式给予I/R小鼠，在手术操作一小时前和心肌再灌注操作时分别给予25mg/kg剂量的药物(总量与一次给药组相同)。
另外，待测药剂按照50mg/kg的剂量通过口服灌胃(附图中标注为oral)或尾静脉注射(附图中标注为i.v)的方式给予Sham小鼠。
上述待测药剂均按照实施例1的处方1和工艺制备。
超声检测结果见图1和2。图1为选取展示的Sham和I/R组小鼠的心脏超声结果。图2为对心脏超声结果的量化分析。图2A和2B显示，相比Sham组，I/R操作后小鼠心脏射血分数百分比(EF％)和短轴缩短率(FS％)明显下降。尾静脉注射给药的I/R小鼠的EF％和FS％(I/R i.v Pre和I/R i.v Pre+Reperfusion组)要明显高于口服灌胃给药的I/R小鼠(I/R oralPre和I/R oral Pre+Reperfusion组)。但EF％和FS％值在I/R i.v Pre组和I/R i.v Pre+Reperfusion组之间并未表现出统计学差异，说明一次给药和分次给药对小鼠心脏射血功能的影响没有差异。图2C-2G显示，左室舒张末期内径(LVIDd)、左室收缩末期内径(LVIDs)、左室舒张末期容积(LV volume；d)、左室收缩末期容积(LV volume；s)和左室质量(LVmass)这些指标在尾静脉给药组和口服灌胃给药组之间并未出现有统计学意义的差异。此外，不同给药途径对Sham小鼠的EF％和FS％值并未产生不同的影响。
Evans blue和TTC双染色的病理结果见图5。图5显示，相比口服灌胃组，尾静脉注射组的心脏组织中浅灰色区域(缺血危险区，实线圈出区域)和白色区域(缺血后梗死区，虚线圈出区域)的面积较小。图6为病理染色图片的量化分析结果。图6A-C显示，尾静脉注射组(I/R i.v Pre和I/R i.v Pre+Reperfusion组)的危险区和左室面积的比值(AAR/LV％)、梗死区和危险区面积比值(IF/AAR％)、梗死区和左室面积比值(IF/LV％)要明显低于对应的口服灌胃组(I/R oral Pre和I/R oral Pre+Reperfusion组)，说明相比口服灌胃给药，尾静脉注射给药能进一步缩小梗死区域和缺血损伤区域，显著减轻缺血和再灌注损伤。同心脏超声指标结果一致，一次给药和分次给药对梗死和缺血区域的面积未有差异的影响。
Western blot结果见图9。图9A为western blot蛋白条带。图9B和C为定量分析结果。图9B和C显示，乙酰化的组蛋白3和4与总组蛋白3和4的比值在I/R损伤后降低。尾静脉注射组(I/R i.v Pre和I/R i.v Pre+Reperfusion组)的组蛋白3和4的乙酰化水平要高于对应的口服灌胃组(I/R oral Pre和I/R oral Pre+Reperfusion组)，说明相比口服灌胃，尾静脉用药对HDAC的抑制作用更强，从而进一步提高组蛋白的乙酰化水平。
3.1.2待测药剂在心梗动物模型中的作用
待测药剂按照50mg/kg的剂量通过口服灌胃(附图中标注为oral)或尾静脉注射(附图中标注为i.v)的方式分别给予Sham和MI小鼠。
待测药剂均按照实施例1的处方1和工艺制备。
超声检测结果见图3和4。图3为选取展示的Sham和MI组小鼠7天、14天和28天的心脏超声结果。图4为心脏超声结果的量化分析。图4A-F显示，相比Sham小鼠，MI小鼠的心功能明显下降，并且随着时间的推移进一步下降。在第7天、14天和28天，尾静脉注射用药的MI小鼠的心脏射血分数百分比(EF％)和短轴缩短率(FS％)都要显著高于口服灌胃用药的MI小鼠。而左室舒张末期内径(LVIDd)、左室收缩末期内径(LVIDs)、左室舒张末期容积(LVvolume；d)和左室收缩末期容积(LV volume；s)等值要低于口服灌胃组。同样地，不同给药途径对Sham小鼠的心功能并未出现有差异的影响。
Masson病理染色结果参见图7。图7显示MI i.v组小鼠心脏组织中梗死后形成的纤维组织(浅灰色，实线圈出区域)要明显少于MI oral组小鼠。图8为Masson染色图片的量化分析结果，结果显示MI i.v组的梗死区和左室面积的比值(IF/LV％)要明显低于MI oral组，说明相比口服灌胃，尾静脉注射给药具有更强的缩小缺血后梗死面积的作用。
Western blot结果见图10。图10A为western blot蛋白条带。图10B和C定量分析结果。图10B和C显示，乙酰化的组蛋白3和4与总组蛋白3和4的比值在MI损伤后降低。MI i.v组的组蛋白3和4的乙酰化水平要高于对应的MI oral组，说明相比口服灌胃，尾静脉用药对HDAC的抑制作用更强，从而进一步提高组蛋白的乙酰化水平。
3.2不同注射用乳剂处方的比较
3.2.1待测药剂在缺血再灌注动物模型中的作用
待测药剂按照50mg/kg的剂量通过尾静脉注射的方式给予MI小鼠。
超声结果见图11和12，图11为选取展示的小鼠心脏超声结果。图12为各超声结果的量化分析。图12A和图12B显示应用静脉处方1-6的IR小鼠的射血分数(EF％)和短轴缩短率(FS％)要明显高于应用静脉处方7和8的IR小鼠。图12C-12G显示，左室舒张末期内径(LVIDd)、左室收缩末期内径(LVIDs)、左室舒张末期容积(LV volume；d)、左室收缩期末容积(LV volume；s)、左室质量(LV mass)这些指标在各静脉剂型处方间未出现有统计学意义的差异。
Evans blue和TTC双染色的病理结果见图17。图17显示应用静脉处方1-6组的I/R小鼠的心脏组织中浅灰色区域(缺血危险区，实线圈出区域)和白色区域(缺血后梗死区，虚线圈出区域)的面积较小。图18为病理染色图片的量化结果。图18A和图18B图显示应用静脉处方1-6的I/R小鼠心脏的梗死区和危险区面积比值(IF/AAR％)、梗死区和左室面积比值(IF/LV％)要明显低于应用静脉处方7和8的I/R小鼠，说明对比处方7和8，处方1-6能进一步缩小梗死和缺血损伤区域，显著减少缺血再灌注损伤。
Western blot结果见图21。图21A为western blot蛋白条带。图21B和图21C为定量分析结果。图21B和C显示应用静脉处方1-6的I/R小鼠心肌组织的乙酰化组蛋白3和4与总组蛋白3和4的比值要明显高于应用静脉处方7和8的I/R小鼠。说明处方1-6对HDAC的抑制作用更强，从而进一步提高组蛋白的乙酰化水平。
3.2.2待测药剂在心梗动物模型中的作用
待测药剂按照50mg/kg的剂量通过尾静脉注射的方式给予MI小鼠。
超声检测结果见图13-16，图13为选取展示的MI小鼠7天、14天、28天心脏超声结果。图14、图15、图16分别为MI小鼠7天、14天、28天超声结果的量化分析。图14-16中A和B显示，应用静脉处方1-6的MI小鼠的心脏射血分数(EF％)和短轴缩短率(FS％)在7天、14天、28天均要明显高于应用静脉处方7和8对应的MI小鼠。各图中C-F显示应用静脉处方1-6的MI小鼠的左室舒张末期内径(LVIDd)、左室收缩末期内径(LVIDs)、左室舒张末期容积(LVvolume；d)、左室收缩期末容积(LV volume；s)在7天、14天、28天均要明显低于应用静脉处方7和8的MI小鼠。
Masson的病理结果见图19。图19显示，应用静脉处方1-6的MI小鼠心脏组织中的梗死后纤维组织(浅灰色，实线圈出区域)要明显少于应用静脉处方7和8的MI小鼠。图20为Masson染色的量化分析结果，结果显示应用静脉处方1-6的MI小鼠心脏组织的梗死区和左心室面积比值(IF/LV％)要明显低于应用静脉处方7和8的MI小鼠，说明相比静脉处方7和8，静脉处方1-6具有更强的缩小缺血后梗死面积的作用。
Western blot结果见图22。图22A为western blot蛋白条带。图22B和图22C为定量分析结果。图22B和图22C显示应用静脉处方1-6的MI小鼠心肌组织的乙酰化组蛋白3和4与总组蛋白3和4的比值要明显高于应用静脉处方7和8的MI小鼠。说明处方1-6对HDAC的抑制作用更强，从而进一步提高组蛋白的乙酰化水平。
稳定性实验例
采用以下表1所示的各个处方制备注射用乳剂样品并进行稳定性比较：
表1进行稳定性实验的处方
处方A 处方B 处方C 处方1
N-辛二酰苯胺异羟肟酸(g) 15 15 15 15
大豆磷脂(g) 10 10 10 10
注射用大豆油(g) 100 100 100 100
吐温-80(增溶剂)(g) 0 3 3 3
油酸(稳定剂)(g) 0 0.1 2.5 0.5
甘油(g) 12.5 12.5 12.5 12.5
注射用水 适量 适量 适量 适量
对上述四种处方按照实施例1的制备工艺制成的样品(处方A、处方B、处方C和处方1的样品在下表2中分别显示为样品A、样品B、样品C和样品1)进行了6个月的稳定性考察，即室温条件下，分别在0个月、1个月、3个月和6个月对样品的外观、平均粒径、Zata电位、包封率(含量)进行持续考察，其中平均粒径和zata电位采用激光粒径仪测定，包封率采用超速离心法将油相、乳化层和水相分开，通过测定水相中伏立诺他的含量计算包封率，伏立诺他含量测定方法采用反相高效液相色谱法，色谱条件为：C18色谱柱(250mm*4.6μm*5μm)，流动相为乙腈-0.1％磷酸水(30:70)(用三乙胺调pH至3.0)；检测波长为241nm，流速为1.0ml/min。稳定性考察的结果如下表2：
表2稳定性考察的结果
Figure BDA0001559689680000211
由上述数据可以看到，样品A有药物析出，未能成乳；样品B初制时各项指标良好，但产品的稳定性随后呈明显下降趋势，6个月时，产品的包封率已经低于80％，不能满足用药需求；相比较下，样品1稳定性一直保持良好。处方1相对处方B而言，增加了稳定剂的比例，使产品达到更好的稳定性。但是，尽管处方C中的稳定剂比例更高，样品C的稳定性相对样品1还是有所下降。
N-辛二酰苯胺异羟肟酸是一种油水均难溶的药物，使用传统的乳剂处方A制备的样品A稳定性较差，均质化完毕后有明显的药物析出，高速离心后，还能看到明显的药物粉末层。因此考虑加入增溶剂和稳定剂。
使用乳剂处方B仅解决药物溶解问题，制成相对稳定的乳剂，但是制备的样品B的长期稳定性不佳，有待于改善。处方1采用适合比例的稳定剂，其与增溶剂一起对乳剂的稳定性有显著改善。相比之下，使用乳剂处方C加大了稳定剂的加入比例，但是并未使得乳剂的稳定性如所预期那样得到进一步改善，反而使乳剂的稳定性有所下降，且生产成本增加。

Claims (20)

1.一种用于保护缺血心肌的注射用乳剂，按质量份数计，其包含：
N-辛二酰苯胺异羟肟酸 3份；
乳化剂 1.0～2.5份；
注射用油 10～20份；
增溶剂 0.1～1份；
油酸 0.05～0.15份；
甘油 2.0～2.5份，以及
注射用水 余量；
其中所述乳化剂为磷脂，所述磷脂为大豆磷脂和/或卵磷脂；所述注射用油选自注射用大豆油、注射用橄榄油或注射用中链油中的一种或多种，以及所述增溶剂选自吐温-80、丙二醇、泊洛沙姆188或聚乙二醇15羟硬脂酸酯(SolutolHS 15)中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的注射用乳剂，其中，按质量份数计，所述注射用乳剂包含：
N-辛二酰苯胺异羟肟酸 3份；
乳化剂 1.0～2.5份；
注射用油 10～20份；
增溶剂 0.6份；
油酸 0.05～0.15份；
甘油 2.0～2.5份，以及
注射用水 余量；
3.根据权利要求1所述的注射用乳剂，其中，按质量份数计，所述注射用乳剂包含：
N-辛二酰苯胺异羟肟酸 3份；
乳化剂 2份；
注射用油 20份；
增溶剂 0.6份；
油酸 0.1份；
甘油 2.5份，以及
注射用水 余量。
4.根据权利要求1至3中任一项的注射用乳剂，其中，所述注射用油为注射用大豆油。
5.根据权利要求1至3中任一项的注射用乳剂，其中，所述增溶剂为吐温-80和/或丙二醇。
6.根据权利要求1至3中任一项所述的注射用乳剂，其中，按质量份数计，所述注射用乳剂包含：
N-辛二酰苯胺异羟肟酸 3份；
大豆磷脂或卵磷脂 2份；
注射用大豆油 20份；
吐温-80或丙二醇 0.6份；
油酸 0.1份；
甘油 2.5份，以及
注射用水 余量。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的注射用乳剂的制备方法，该制备方法包括以下步骤：
(1)向N-辛二酰苯胺异羟肟酸加入增溶剂和甘油，加热，再加注射用水至N-辛二酰苯胺异羟肟酸溶解；
(2)向步骤(1)得到的溶液加入乳化剂，混匀，制得水相；
(3)将油酸与注射用油混匀，制得油相；
(4)将水相和油相在加热下高速剪切混合，制得初乳，其中所述高速剪切混合的速度为3000～10000转/分；
(5)将初乳在加压条件下进行均质化。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其中，在步骤(1)中，所述加热至50～90℃；
在步骤(2)中，所述混匀采用剪切混合；
在步骤(4)中，所述加热至70℃～80℃且所述高速剪切混合的速度为3000～10000转/分；
在步骤(5)中，所述加压条件为400～1200巴；所述均质化进行1～6次。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其中，在步骤(1)中，所述加热至70～80℃。
10.根据权利要求8所述的制备方法，其中，在步骤(2)中，所述剪切混合的速度为3000～10000转/分。
11.根据权利要求10所述的制备方法，其中，在步骤(2)中，所述剪切混合的速度为5000～6000转/分。
12.根据权利要求8所述的制备方法，其中，在步骤(4)中，所述高速剪切混合的速度为5000～6000转/分。
13.根据权利要求8所述的制备方法，其中，在步骤(4)中，所述高速剪切混合进行10～40分钟。
14.根据权利要求13所述的制备方法，其中，在步骤(4)中，所述高速剪切混合进行25～40分钟。
15.根据权利要求14所述的制备方法，其中，在步骤(4)中，所述高速剪切混合进行30分钟。
16.根据权利要求8所述的制备方法，其中，在步骤(5)中，所述加压条件为700～900巴。
17.根据权利要求8所述的制备方法，其中，在步骤(5)中，所述均质化进行5～6次。
18.根据权利要求7所述的制备方法，其中，所述制备方法还包括以下步骤：
(6)封装；
(7)灭菌；
19.根据权利要求18所述的制备方法，其中，所述灭菌的条件为115℃下30分钟。
20.根据权利要求1至6中任一项所述的注射用乳剂或根据权利要求7至19中任一项所述的制备方法制备的注射用乳剂在制备用于缺血心肌保护的药物、用于治疗心肌缺血再灌注损伤的药物或用于治疗心肌梗死的药物中的用途。
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