KR20210044242A

KR20210044242A - 조직 괴사 치료 및 심장기능 개선에 사용되는 약물

Info

Publication number: KR20210044242A
Application number: KR1020217006661A
Authority: KR
Inventors: 진 치엔; 닝 순; 시앙 가오; 바이핑 추이; 위한 정
Original assignee: 저지앙 하이지언셀스 바이오메디컬 컴퍼니 리미티드
Priority date: 2018-08-10
Filing date: 2019-08-09
Publication date: 2021-04-22
Also published as: JP2021534235A; CN112566646A; EP3834834A4; CN110812369A; AU2019318661A1; US20210308191A1; CA3109199A1; EP3834834A1; WO2020030091A1

Abstract

본 발명은 혈액결핍과 산소 결핍으로 인한 조직괴사에 대해 사용하는 약물을 언급하였으며 그 약물에는 비인간동물에서 온 특히 가금과 비인간포유동물의 양수 또는 그 추출물과 임의로 선택한 약학에서 받아들일수 있는 매개물이 있다. 본 발명의 약물조합물은 세포의 생장을 촉진시키고 심근경색후의 심장기능을 높이고 심근경색후의 심장세포의 재생을 촉진시킨다.

Description

조직 괴사 치료 및 심장기능 개선에 사용되는 약물

본 발명은 조직 괴사 및 심장기능 개선에 사용되는 치료약물이다.

통상적으로 피가 부족하여 산소 결핍이 초래되면 부분적인 조직과 세포의 신진대사가 정지되며 그 기능은 전부 상실되고 세포는 핵농축, 핵파열 및 핵용해 등 변화가 나타나서 사망되며 결과는 조직괴사를 초래한다.

심근경색은 피가 부족하거나 산소 결핍으로 인한 조직 괴사의 사례중의 하나이며 관상동맥의 병리변화를 기준으로 하여 관상동맥의 혈액이 중단되어 이에 따른 심근이 심각하고 지속적인 급성출혈을 일으키도록 하며 최종적으로 급성, 지속성적인 혈액 결핍, 산소결핍(관상동맥 기능 부전)을 일으키는 심근괴사이다.

급성심근경색이 발병한 환자는 임상에서 자주 지속적인 흉골하의 심각한 통증, 발열, 백혈구 수치의 증가, 혈청 심기효소 상승 및 심전도에서 심근 급성손상으로 반영되고 혈액 결핍과 괴사 등 일련의 특징적 변천이 나타나며 부정맥, 쇼크와 심부전이 나타나며 관상동맥성심질환의 심각한 일종이며 부정맥. 쇼크 및 심부전 등 합병증이 동시에 나타나며 이는 자주 생명을 위급하게 한다.

본 발명은 의약조성물을 제공하는 것이며 본 의약조성물에 포함된 것으로는:

비인간동물의 양수 혹은 기타 추출물과 임의로 선택한 매개물；

그중에서도 하기 양수는 배년이 5-12일인 계란, 배년이 우선순위로 6-11일 되는 계란, 최우선순위로는 7-9일 되는 계란, 또는 발육시기가 상기 계란의 발육시기랑 상응한 닭이외의 기타 가금종류의 알이다; 혹은 배년이 8-20일 되는 우선순위로 8-14일인 설치류동물의 배태, 또는 발육시기와 태년이 8-20일, 우선순위로 8-14일된 설치류의 발육시기와 상응한 설치류이외의 기타 비인간 포유동물의 배태이다.

하나 또는 여러개의 실시방안속에서 상기 의약조합물은 -60℃이하에서 30 냉동보존한 양수 또는 기타 추출물의 냉동건조시약이다.

하나 또는 여러개의 실시 방안에서, 상기 약물조합물을 주사액으로 한다.

하나 또는 여러개의 실시 방안에서, 상기 약물의 조합물은 등장 생리 식염수, 주사용수 또는 포도당 주사액 등이 포함되어 있거나 불포함되어 있다.

하나 또는 여러개의 실시 방안에서, 상기 기타 가금류의 알의 태년은 5-20일된 가금류의 알이다.

하나 또는 여러개의 실시 방안에서, 상기 기타 가금류의 알은 태년이 6-15일된 가금류의 알이다.

하나 또는 여러개의 실시 방안에서, 상기 양수는 태년이 7일된 계란이다.

하나 또는 여러개의 실시 방안에서, 상기 기타 가금류의 알은 오리알, 거위알 또는 기타 조합이다.

본 발명은 양수 또는 그 추출물이 혈액 결핍과 산소 결핍에 대한 제조과정을 거친 치료중 일어난 조직괴사의 약물속에 사용된다. 그중에서 상기 양수는 태년이 5-12일된 계란에서, 우선순위로 태년이 6-11일된 계란, 최우선순위로 태년이 7-9일된 계란, 최우선순위로 태년이 7-8일된 계란, 또는 발육시기와 상기 태년의 계란의 발육시기와 상응된 닭이외의 기타 가금류의 알에서 사용되며 또는 태년이 8-20일이 되고 우선순위로 8-14일된 설치류 동물의 배태, 또는 발육시기와 태년이 8-20일 되고 우선순위로 8-14일된 설치류의 발육시기와 상응된, 설치류이외의 기타 비인간포유동물의 배태이다.

하나 또는 여러개의 실시 방안에서, 상기 조직괴사는 심근 혈약결핍괴사이다.

하나 또는 여러개의 실시 방안에서, 상기 조직괴사는 심근경색이다.

하나 또는 여러개의 실시 방안에서, 상기 기타 가금류의 알은 태년이 5-20일된 가금류의 알이다.

하나 또는 여러개의 실시 방안에서, 상기 가금류의 알은 태년이 6-15일된 가금류의 알이다.

하나 또는 여러개의 실시 방안에서, 상기 양수는 태년이 7일된 계란에서 채취하였다.

하나 또는 여러개의 실시 방안에서, 상기 가금류의 알은 오리알, 거위알 또는 기타 조합이다.

본 발명은 양수 또는 그 추출물이 제조되는 과정에서 심장기능을 개선하는 약물속에서 사용되며 그중에서 상기 양수는 태년이 5-12일된 계란에서 우선순위로 태년이 6-11일된 계란을 사용하며 최우선순위로 태년이 7-9일된 게란이며 최우선순위로 태년이 7-8일된 계란을 사용하거나 또는 발육시기가 상기 태년의 계란이 처한 발육시기랑 상응한 닭이외의 기타 가금류의 알이며 또는 태년이 8-20일되고 우선순위로 8-14일된 설치류동물의 배태 또는 발육시기와 태년이 8-20일되고 우선순위로 8-14일된 설치류동물의 발육시기와 상응된 기타 비인간포유동물의 배태이다.

하나 또는 여러개의 실시 방안에서, 상기 기타 가금류의 알은 태년이 5-20일된 기타 가금류의 알이다.

하나 또는 여러개의 실시 방안에서, 상기 기타 가금류의 알은 태년이 6-15일된 기타 가금류의 알이다.

하나 또는 여러개의 실시 방안에서, 상기양수 태년이 7일된 계란.

하나 또는 여러개의 실시 방안에서, 상기 약물은 심부전개선, 더우기는 노인성 심장기능 감퇴 또는 심장기능부전에 사용된다.

본 발명은 또한 하나의 혈액결핍과 산소 결핍으로 인한 조직괴사를 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법에는 필요한 대상치료 할당량의 양수 또는 그 추출물이 포함되며 그중에서도 상기 양수는 태년이 5-1일된 계란에서 추출, 우선순위로 태년이 6-11일된 계란, 최우선순위로 태년이 7-9일된 계란, 최우선순위로 태년이 7-8일된 계란 또는 발육시기와 상기 태년의 계란이 처한 발육시기와 상응한 기타 가금류의 알, 발육시기와 상기 태년의 계란의 발육시기와 상응한 닭이외의 기타 가금류의 알 또는 태년이 8-20일되고 우선순위로 8-14일된 설치류동물의 배태,또는 발육시기와 태년이 8-20일되고 우선순위로 8-14일된 설치류동물의 발육시기와 상응한 설치류동물이외의 기타 비인간포유동물의 배태이다.

하나 또는 여러개의 실시 방안에서, 상기 방법에는 상기 양수와 그 추출물의 약물제제로 된 정맥주사 또는 상기 양수와 그 추출물이 포함된 약물제제를 수액 또는 주사한다.

하나 또는 여러개의 실시 방안에서, 상기 양수는 태년이 7일된 계란에서 추출하였다.

본 발명은 하나의 심장기능을 개선하는 방법을 제공하며 상기 방법에는 필요한 대상 치료할당량의 양수와 그 추출물이 포함되며 그중에는 상기 양수가 태년이 5-12일된 계란, 우선순위로 태년이 6-11일된 계란, 최우선선위로 태년이 7-9일된 계란이며 최우선순위로 태년이 7-8일된 계란이며 또는 발육시기와 상기 태년의 계란의 발육시기와 상응된 닭이외의 기타 가금류의 알, 또는 태년이 8-20일되고 우선순위로 8-14일된 설치류동물의 배태 또는 발육시기와 태년이 8-20일되고 우선순위로 8-14일된 설치류동물의 발육시기와 상응한 설치류동물이외의 기타 비인간 포유동물의 배태이다.

하나 또는 여러개의 실시 방안에서, 상기 방법은 정맥주사에서 상기 양수와 기타 추출물의 약물제제를 포함하거나 또는 상기 양수 및 그 추출물의 약물제제를 수액하거나 주사한다.

하나 또는 여러개의 실시 방안에서, 상기양수는 태년이 7일된 계란에서 왔다.

하나 또는 여러개의 실시 방안에서,상기 심장기능을 개선하는 방법은 심부전을 개선하는 방법으로 특히 노인성심장기능감소 또는 심장기능부전을 개선하는 방법이다.

그림 1： 심근경색에 걸린 생쥐의 박출율이다. 심장 초음파를 통하여 생쥐의 박출율과 좌심실과 좌심실축단축단축율을 추산한다. 그림에서 양수(EE)의 치료는심근경색에 걸린 생쥐의 박출율을 현저하게 높이고 심장기능을 뚜렷하게 개선하는 것을 볼수 있다.
그림 2： 심근경색 생쥐의 좌심실 축단축단축율. 심장초음파를 통하여 생쥐의 박출율과 좌심실 축단축단축율을 추산할수 있다. 그림에서 양수(EE)의 치료는 심근경색 생쥐의 좌심실 축단축단축율을 뚜렷하게 높이고 심장기능을 눈에 띄게 개선하는 것을 볼수 있다.
그림 3： 심근경색 생쥐 심장의 마송 삼색 염색이다. 그림에서 심근경색 생쥐는 심각하게 섬유화되어 있으며 좌심실벽은 뚜렷하게 얇아져 있다. 양수(EE)치료후, 좌심실벽은 뚜렷하게 얇아지지 않았으며 섬유화는 뚜렷하게 감소되었다.
그림 4： 심근경색 생쥐 심장의 면역형광항체법(PH3,cTnT,DAPI)이다.
그림 5： 심근경색 생쥐 심장의 형광항체법(AuroraB,cTnT,DAPI). 그림에서 치료팀 생쥐 심장의 PH3 양성과 AuroraB 양성세포가 뚜렷하게 증가된 것을 볼수 있는데 이는 EE 치료가 심근경색 생쥐의 심장세포 재생을 뚜렷하게 유발하였다.
그림 6： 심근경색 생쥐의 심장 섬유화 면적은 양(EE) 치료후에 비치료팀(NS)보다 뚜렷하게 감소되었다.
그림 7： 태년이 7일된 계란 양수의 HPLC 검사결과이다.
그림 8： 태년이 11일된 계란 양수의 HPLC 추산결과이다.
그림 9： 태년이 13일된 계란의 양수의 HPLC 검사결과이다.
그림 10： 태년이 다른 계란의 항산화능력이다. 가로 좌표는 태년을 표시하고 세로 좌표는 소해율을 표시한다.
그림 11： 닭의 배태이 섬유세포가 되어 서로 다른 배양조건에서의 생장곡선이며 계란의 양수는 세포의 생장을 촉진한다
그림 12： 계란에서 온 양수는 사람의 탯줄정맥내피세포(HUVEC)의 생장활력과 이전능력의 영향을 받는다. 가로 좌표는 배양기를 표시하고 세로 좌표는 OD450수치를 표시한다.
그림 13： 오리알에서 온 양수는 닭 배태되어 섬유세포로 되는데 생장활력과 이전능력의 영향을 받는다. 가로 좌표는 배양기를 표시하고 세로좌표는 OD450치를 표시한다.
그림 14： 젤기둥 GE HiLoad 16/600 Superdex75 pg 분리 크로마토 그래피도.
그림 15： 세포활력추산 젤기둥 GE HiLoad 16/600 Superdex75 pg 분리분수.가로 좌표는 배양기를 표시한다,그중에서 FBS는 소태혈청을 가리키고 DMEM는 Dulbecco's Modified Eagle Medium이고； EE는 양수를 표시하고；“EE”는 동결건조 양수를 표시하며； S-200B는 B봉의 유분을 표시하며； Q UNBOUND는 음이온기둥이 유분과 결합하지 않은 것을 표시하며； 3-1부터 3-6는 각각 제3보순수화 중등체적의 유분 1-6을 표시한다
그림 16： 세포활력은 양이온 교환기둥 GE HiPrep SP와 음이온 교환기둥HiPrep Q이 분리하여 얻은 미결합유분을 추산한다. 가로 좌표는 배양기를 표시하고,그중에서 FBS는 소태혈청을 표시하고； DME는 Dulbecco's Modified Eagle Medium； EE는 양수를 표시하고； “EE”는 동결건조 양수를 표시하고； Hiprep SP-UN는 미결합 Hiprep SP 기둥의 유분을 표시하고； Hiprep Q-UN 표는 미결합 Hiprep Q기둥의 유분을 표시하고； Hiprep Q-Bound는 결합 Hiprep Q기둥의 유분을 표시한다.
그림 17： 계란에서 얻은 양수는 계란의 양수에서 1차심근세포의 생장을 촉진한다. 그중에서 가로 좌표는 배양기를 표시하고 세로 좌표는 OD450치를 표시한다.
그림 18： EE는 심근경색돼지의 심기능을 높이고 좌심실의 재건을 경감한다.
그림 19： EE는IR 돼지의 심장경색면적을 낮추며 활동시간을 연장한다.
그림 20： 생쥐로부터 온 양수는 AC16세포의 생장활력에 영향준다.

반드시 이해하여야 되는 것은 본 발명범위에서 본 발명의 상기 각 기술특징과 이하 (실시사례)에서 세부적으로 기술한 각 기술특징간에는 서로 조합할수 있으며 서로 조합함으로 우선적인 기술안을 구성한다.

본문에서 양수와 기타 추출물은 특별히 주석을 단 외에 EE로 통합한다. 본문에서 양수는 가금류의 알과 비인간 포유동물에서 온다. 가금알은 가금류의 알을 가리킨다. 우선적인 가금류는 가금인바 닭, 오리와 거위이다. 우선적인 것은 본 발명에서 사용한 태년이 5-20일이 된 우선순위로 6-15일된 기타 가금류의 알이다. 반드시 이해할 것은 다른 가금류의 알에서 적합한 태년이 서로 같지만은 않다. 예를 들면 계란을 사용시, 우선적으로 태년이 5-12일된 계란을 사용하고,최우선적으로 태년이 6-11일된 계란을 사하며 최우선적으로 태년이 7-9일된 계란을 사용하며 최우선적으로 태년이 7-8일이 된 계란을 사용한다. 기타 가금류의 알을 사용시 그 발육시기와 상기 계란의 발육시기와 상응한 알이다. 예를 들면 오리알을 사용시 태년이8-10일, 특히 8-9일된 오리알이 가장 적합할 것이다.

일반적인 방법으로 가금알 양수를 얻는다. 예를 들면 상응한 태년의 알의 둥근 면을 두드려서 껍데기를 깨어 껍데기에 직경이 2센티 정도 되는 구멍을 낸다. 그다음 핀셋으로 조심히 껍데기의 막과 난황막을 찢는다. 유의할 점은 양수막을 파열시키면 안된다. 배태를 싼 양수막과 연결된 조직은 껍데기에서 배양기안에 쏟아붇고 주사기로 양수막을 찔러 양수를 추출하여 내서 양수막이 배태에 꼭 붙어있도록 하며 이런 방식으로 본 발명 사용되는 양수를 얻는다.

본문에서 양수는 아직 비인간포유동물에서 얻을수 있다. 특히 설치류동물, 예를 들면 생쥐이다. 기타 비인간포유동물은 통상적으로 볼수 있는 가축이다. 예를 들면 소, 양, 개, 고양이, 돼지 등이다. 일부 실시안에서 양수는 태년이 8-20일되고 우선적으로 8-14일 되거나 또는 11-16일된, 최우선적으로 13-14일된 설치류동물의 배태 또는 그 발육시기와 태년이 8-20일되고 우선적으로 8-14일 되거나 1-16일된, 최우선적으로 13-14일된 설치류 동물의 발육시기가 상응한 비인간포유동물의 배태이다. 통상적인 방법으로 양수를 얻을수 있다. 예를 들면 수술가위로 임신한지 8-20일되고 우선적으로 8-14일 되거나 또는 11-16일 되고 최우선적으로 13-14일된 생쥐의 배를 가르고 조심히 꺼내서 자궁을 가르고 주사기를 양수에 꽂아 양수를 양수막이 배태에 딱 붙을때까지 추출한다. 이런 방법으로 본 발명에 사용하는 양수를 얻을수 있다.

반드시 이해하여야 할 점은 필요시 양수에 대하여 원심을 진행하여 가능하게 함유되어있는 잡질을 분리하는데 예를 들면 난황 등으로 가능한 순수한 양수를 얻는다. 원심후 얻은 상청액이 본 발명에서 사용하는 양수이다. 반드시 이해하여야 할 점은 모든 절차는 무균조건에서 진행하여야 한다. 그리고 본문에서 표시한 “양수”는 반드시 “순수한”양수를 가리킨다. 즉 가금알 또는 비인간포유동물배태에서 분리한 가금알내 또는 비인간포유동물배태내에 기타 성분이 함유되어있지 않고 외래물질에 감영되지 않은 양수이다. 순수한 양수는 -60℃이하의 냉장고에서 저장하며 해동후 사용한다.

일부 실시안에서 본 발명은 양수 추출물을 사용한다. 우선적으로 그 추출물은 pH 5.8-8.0사이에 이온과 기둥을 교환하여 결합하지 않으며 그 포함된 성분의 분자량은 500-1200 돌턴 범위내에 있다. 그러나 양수에서 분리된 분자량은 500-1200 돌턴의 중성유분이며 이로 인하여 상기 추출물을 얻는다. 본 영역에서 잘 아는 젤기둥과 이온교환기둥으로 본 안의 방법을 실시한다. 예를 들면 누구나 잘 아는 겔층 접기둥(이하 상기 각 겔층 접기둥)은 양수에서 분자량이 500-1200 돌턴인 유분을 분리하며 이온교환방법을 사용하여(이하 상기 이온교환기둥 사용)그 유분에서 중성유분을 분리한다. 또는 이온교환방법을 먼저 사용하여 양수에서 중성유분을 분리한후 겔층 접기둥(이하 상술한 각 겔층 접기둥)을 사용하여 그 중성유분에서 분자량이 500-1200 돌턴범위내의 유분을 분리한다.

일부 실시한 안에서 먼저 양수중에서 분리하여 분자량이 500-2000 돌턴되는 중성유분을 얻으며 그다음 거기에서 분리하여 분자량이 500-1200 돌턴범위내의 유분을 얻는다. 세부적으로 한다면 그 방법은 이하 절차를 포함한다：

(1) 양수에서 분리하여 얻은 분자량이 500-2000 돌턴되는 중성유분과

(2) 그 분자량이 500-2000 돌턴되는 중성유분에서 분리하여 얻은 분자량이500-1200 돌턴되는 중성유분이다.

절차 (1)은 겔층 접기둥와 이온교환방법으로 실현할수 있다. 겔층 접기둥이 양수에서 분리한 분자량은 500-2000 돌턴의 성분이며 이온교환을 통하여 전하가 없는 (중성)유분이다.

본문에는 각 종류의 시중에 유통되는 겔층 접기둥기둥을 통하여 겔층 접기둥를 실시하며, 이런 유형의 겔층 접기둥은 이하를 포함 및 여기에만 한정되지 않는다: GE 회사의 SephacrylS-100. SephacrylS-200. SephacrylS-300. SephacrylS-400. Superose 12. Superose 6. Superdex 12와 Superdex 6 등이다. 반드시 이해하여야 할 것은 분리범위가 500-10000 돌턴인 기타 임의의 겔층 접기둥충전재를 사용할수 있다. 통상적으로 겔층 접기둥을 사용시 ddH₂O 평형 겔층 접기둥, 유속은 실제상황에 따라 확인할수 있다. 예를 들면 일부 실시안에서 유속은 0.5-50ml/min일수 있으며, 예를 들면 1ml/min이다. 일반적으로 자외흡수가 200-300nm 사이이면 예를 들면 280nm이다. 자외흡수곡선이 평온하고 기준선에 회구하면 평형을 끝낸다. 평형이 끝나면 사용적재할수 있다. 사용적재 유속은 실제 제작상황에 따라 확정한다. 사용 적재 완료후, 탈기 ddH₂O을 사용하여 조제품의 용출을 진행한다. 분자량이 500-2000 돌턴사이의 유분. 필요시, 겔층 접기둥의 분리횟수를 반복하여 매번 분리시 동일 출봉시간간의 유분과 혼합한다.

본문에서는 본 영역에서 알고 있는 방법으로 전하를 띤 성분과 전하를 띠지 않은 성분을 분리시킬수 있다. 예를 들면 이온교환방법으로 실현한다. 음이온교환과 양이온교환은 전부 본 발명방법에 사용할수 있다. 예를 들면 이온교환방법을 사용하여 실현한다. 음이온교환과 양이온교환은 전부 본 발명방법에 사용할수 있다.일부 실시안에서 본문은 음이온교환법을 사용한다. 시중에 유통되는 음이온교환기둥을 사용할수 있으며 이하를 포함 및 여기에만 한정되지 않는다: GE 회사의 DEAE Sepharose.ANX Sepharose.Q Sepharose.Capto DEAE.Capto Q.Mono Q와와 Mini Q 등이다. 반드시 이해하여야 할것은 기타 브랜드의 음이온을 사용하여 충전재로 교환할수 있다. 또는 시중에 유통되는 양이온을 교환기둥으로 사용할수 있으며 이는 이하를 포함하지만 이하에만 한정되지 않는다: CM Sepharose.SP Sepharose.Capto S.Mono S와 Mini S 등이다.

통상적으로 이온교환 실시시 먼저 완충용액으로 이온교환기둥을 평형시킨다.완충용액은 본 영역에서 통상적으로 사용하는 완충용액을 사용하여도 된다. 예를 들면 인산염 완충용액, 특히는 인산나트륨완충용액이다. 완충용액의 pH는 사용하고 있는 이온교환기둥에 근거 확인할수 있다. 예를 들면, 음이온교환기둥 사용시, pH가 7.5~8.5이고 우선순위로 7.5~8.0인 완충용액을 사용하여 음이온교환기둥을 평형시키고 양이온교환기둥 사용시, pH가 5.8~7.0이고 우선순위로 5.8~6.5인 완충용액을 사용하여 양이온교환기둥을 평형시킨다. 일부 실시안에서 그 인산나트륨완충용액에 함유된 Na₂HPO₄와 NaH₂PO_4,pH는 대략 5.8 또는 8.0이다. 본 발명은 우선순위로 음이온교환기둥을 사용하여 분리시킨다. 유속은 실제상황에 따라 확정할수 있다. 예를 들면,일부 실시안에서 유속은 0.5-50ml/min일수 있다. 예를 들면 1ml/min이다. 일반적으로 280nm 자외흡수곡선이 평온해지고 기준선에 회귀후 평형을 완료한다. 평형 완료후 적재를 사용하여 유출부분을 수집한다(즉 기둥과 결합하지 않은 부분). 사용 적재유속은 실제제작상황에 따라 확정한다.

절차(1)에서 언저 겔층 접기둥를 진행하여 분자량이 500-2000 돌턴인 유분을 분리한후 다시 이온교환을 진행하여 중성유분을 분리시키거나 또는 먼저 이온교환을 진행하여 양수속의 유분을 분리후 다시 겔층 접기둥에서 중성유분속의 분자량이 500-2000 돌턴범위내의 활성성분을 분리시켜 분자량이 500-2000 돌턴사이의 중성유분을 얻는다.

절차(2)속의 주요목적은 절차 (1)에서 얻은 중성유분에 대하여 진일보로 분리시켜 분자량의 크기가 500-1200 돌턴범위내의 활성성분을 얻는다. 본문에서는 시중에 유통되는 겔층 접기둥을 사용하여 분리해서 얻은 분자량이 500-1200 돌턴범위내의 유분이다. 적합한 겔층 접기둥은 이하 포함 및 여기에만 한정되지 않는다: GE회사의 HiLoad Superdex 16/600 Superdex75 pg.Superdex Peptide.Superdex 200와 Superdex 30 등이다. 반드시 알아둬야 할것은,분리범위가 500-10000 돌턴인 기타 브랜드의 겔층 접기둥충전재를 사용할수 있다.

통상적으로 ddH₂O을 사용하여 젤기둥을 평형시키고 유속은 실제상황에 따라 확정할수 있다. 예를 들면, 일부 실시안에서 유속은 0.5-50ml/min일수 있다, 예를 들면 1ml/min이다. 일반적으로 280nm 자외흡수곡선이 평온하기를 기다려서 기준선에 회귀후 평형을 완료시킨다. 평형 완료후 적재를 사용할수 있다. 사용 적재유속은 실제제작상황에 따라 확정한다. 사용 적재완료후 탈기 ddH₂O을 이용하여 조제품의 용출을 진행한다., 유분을 수집하여 그 성분을 함유한 분자량이 500-1200 돌턴범위내의 유분을 얻으면 본문에서 말한 추출물이다.

상기 방법으로 얻은 추출물을 사용하여 pH가 5.8-8.0인 용액을 조제후 여러가지 이온교환기둥(DEAE Sepharose, Sepharose,Mono Q,CM Sepharose.SP Sepharose와 Mono S 포함)을 통화시킨후 그 활성성분은 전부 이러한 이온교환기둥과 결합하지 않는다.

본문은 본문의 양수와 그 추출물이 세포의 생장(심근경색후 심장세포의 재생 촉진 포함하지만 여기에만 한정되지 않은다, 이를테면 심근세포)을 촉진하고 심장기능을 높이거나 개선한다는 것을 발견하였다.

때문에 본문에서는 양수와 그 추출물로 혈액결핍과 산소 결핍이 일으킨 조직괴사를 치료한다. 조직은 인체 또는 동물의 각종 조직이며 연골조직, 반월판조직, 인대조직, 근건조직, 추간 연골조직, 치주조직, 피부조직, 혈관조직, 근육조직, 근막조직, 골막조직, 눈조직, 심낭조직, 폐조직, 활막조직, 신경조직, 신장조직, 골수, 비뇨생식조직, 장내조직, 간조직, 췌장조직, 비방조직과 지방조직 가운데 임의의 하나 또는 여러조직을 포함하지만 여기에만 한정되지 않는다. 일부 실시안에서, 혈액결핍과 산소 결핍으로 인한 조직괴사는 심근허혈괴사이다. 일부 실시안에서, 그 조직괴사는 급겅, 지속성혈액결핍과 산소 결핍이 일으킨 심근괴사, 즉 심근경색이다. 본문의 양수와 그 추출물은 심장기능을 개선하는데 사용할수도 있다; 심부전환자의 심장기능을 개선시킬수 있다. 일부 실시안에서,본문의 양수와 그 추출물은 노인성 심장기능감퇴 또는 심장기능부전환자의 심장기능을 개선하여 심장기능을 높일수 있다. 본문에서 심장기능감퇴 또는 심기능부전은 각종 원인이 만든 심근의 수축기능 하강인바 심장전향성배혈의 감소를 일으켜 혈액이 체순환이거나 폐순환에 정체되어 발생된 증상이다.

본문에서 서술한 양수와 그 추출물을 사용하여 본문에서 서술한 용도에 사용시 필요한 상대에 줄수 있다. 투약방식은 위장외투약을 할수도 있고 정맥주사방식으로 투약 또는 심방에 주사할수 있다. 일부 실시안에서, 치료 유효량의 양수 또는 그 추출물과 적당향의 주사용 생리식염수, 주사용수 또는 포도당주사약을 잘 섞은다음, 예를 들면 정맥내수액 또는 주사 및 심방주사투약을 할수 있다.

투약의 조제량과 횟수는 구체적인 병상황, 그리고 환자의 연령과 성별 등 상황에 따라 의무진이 확정한다. 일반적으로 특정된 병에 대한 치료에서 치료유효량은 질병과 관련된 증상을 감소하거나 개선할수 있는 약량이. 이러한 약량은 단일한 조제량에 따라 사용하거나 또는 유효한 치료안에 따라 투약할수 있다. 투약량은 질병을 치료할수 있지만 투약은 일반적으로 질병의 증상을 개선한다. 통상적으로 반복적인 투약으로 필요한 증상의 개선을 실현한다. 예를 들면,투약인에 대한 조제량은 1-200ml/차로 할수 있으며 매일이거나 매주 주사투약할수 있다. 일부 실시안에서,투약차수는 매 2일, 매 3일, 매 4일, 매 5일 또는 매 6일에 한번씩 투약하거나 매 15일에 한번씩 투약한다.

때문에, 일부 실시안에서, 본문에는 혈액결핍과 산소 결핍으로 인한 조직괴사를 치료하는 방법을 제공하는 바, 그 방법은 필요한 대상에게 치료에 유효량의 본문에서 서술한 양수 또는 그 추출물의 약물조합물의 절차이다 .

일부 실시안에서, 본문은 또한 하나의 대상심장기능의 방법을 제공하는데 상기 방법은 필요한 대상에게 유효량의 본문에서 서술한 양수 또는 그 추출물 또는 상기 양수 또는 그 추출물 약물조합물의 절차이다.

본문에서,“대상”은 일반적으로 동물을 가리키며, 포유동물 특히 사람을 가리킨다.

특히 본문에서 제공하는 하나의 심근허혈괴사(특히 심근경색)를 치료하는 방법 및 대상심부전(특히 노인성 심장기능감소 또는 심장기능부전)을 개선하는 방법에는 필요한 대상유효량의 본문에서 서술한 양수 또는 그 추출물 또는 상기 양수 또는 그 추출물을 포함한 약물조합물, 특히 가금류의 알양수 또는 그 추출물, 또는 상기 가금류의 알의 양수 또는 그 추출물을 포함한 약물조합물의 절차이다. 우선적으로 상기 가금류의 알 또는 본문의 임의의 실시안이다.

일부 실시안에서, 가금류의 알은 가금류의 알인데 특히는 태년이 5-12일이고 최우선순위로 6-11일되고 최우선순위로 6-9일되고 최우선순위로 7-8일된 가금류의 알 특히는 계란이다.

기타 실시안에서, 양수 또는 그 추출물은 본문에서 서술한 임신한지 8-20일되고 우선순위로 8-14일 되거나 11-16일 되고 최우선순위로 13-14일된 설치류의 양수 또는 그 추출물이다.

일부 실시안에서,본문은 본문에서 서술한 양수 또는 그 추출물이 혈액결핍과 산소 결핍이 일으킨 조직괴사를 치료하는 약물을 제작하는데 응용된다. 또 제공하는 것은 혈액결핍과 산소 결핍이 일으킨 조직괴사를 치료하는데 사용하는 본문에서 서술한 양수 또는 그 추출물이다.

일부 실시안에서,본문에서 제공하는 상기 양수 또는 그 추출물은 심장기능용 약물을 제작하는데 응용된다. 또 제공하는 것은 심장기능을 개선하는데 사용하는 상기의 양수 또는 그 추출물이다.

본문은 하나의 약물조합물을 제공하는데 그 약물조합물은 본문의 상기 양수 또는 그 추출물, 특히 가금의 알중의 양수 또는 그 추출물은 최우선순위로 태년이 5-12일되고 최우선순위로 6-11일되고 최우선순위로 6-9일고 최우선순위로 7-8일된 계란의 양수 또는 그 추출물이다. 일부 실시안에서 양수 또는 그 추출물은 본문에서 서술한 임신한지 8-20일되고 우선순위로 8-14일되거나 11-16일되고 최우선순위로 13-14일된 설치류동물의 양수 또는 그 추출물이다. 약물조합물은 -60℃이하 냉동저장한 양수 또는 그 추출물 또는 그 동결건조시약이다. 예를 들면 동결건조 양수 또는 그 추출물이다. 약물조합물에는 기타 약학에서 수락할수 있는 매개물 또는 부형약이다. 예를 들면 주사용 생리식염수, 주사용수 또는 포도당주사액 등이다.

본문은 세부적인 실시사례를 서술하는 방식으로 본 발명을 기술한다. 반드시 알아둬야 할것은,이러한 실시사례는 서술성이며 본 발명의 범위를 한정하려는 의도는 없다. 실시사례에서 사용한 방법, 시약과 의기는 별도로 설명하지 않은 한 본 영역에서 사용하는 통상적인 방법, 시약과 의기이다

실시 사례 1

1. 재료

a) 의기와 도구

마이크로 컴퓨터 전자동부화기(정따™ZF880), 청정배양기, 1.0ml 주사기(강서홍달™), 70％알코올 소독한 핀셋, 스테인리스 체, 무균원심관(Axygen® # SCT-50ML-25-S)과 저속냉동원심기(중지아KDC-2046).

b) 시약과 생물재료

태년 7일된 계란이다.

2. 실험 프로세스

계란을 꺼내어 위로 향하여 놓은 좀 편평한 끝부분을 두드려 계란껍데기를 두드려 깬 다음 계란껍데기를 벗기고 직경이 2센티정도 되는 틈을 만들고 옆은 될수 있는한 평평하게 한다. 핀셋으로 조심히 계란막과 난황막을 벗기고 그 양막을 파괴하지 않는다. 배태발육상황을 관찰하고 발육이 양호하고 대응단계의 기준에 부합되는 추출할수 있는 배태만 양수를 추출할수 있다.

배태를 감싸고 있는 양막과 연결조직을 껍데기에서 배양기안에 붓고 주사기로 양막을 찔러 양수를 추출하며 주사침의 경사면은 반드시 배태를 등지고 양막이 배태에 달라붙을 때까지 추출한후 맑고 투명하고 이물질이 없는 양수를 아이스박스안의 원심관안에 주입한다.

핀셋으로 양막안의 배태를 꺼내어 얼음우의 스테인리스채안에 붓고 매 한시간마다 수집한 배태를 믹서기로 균질화하여 무균 플라스틱용기안에 밀봉하여 기울어지게 -80℃ 냉장고안에 넣는다. 냉동후 세워서 놓을수 있다.

메포다™1800 자외선 스펙트럼 광도계로 수집한 양수추출액을 추산한다. 광도계 가이드라인은 사용자매뉴얼을 참조로 하고 합격되면 혼합, 균형시킨다.

양수 추출액을 수집한 원심관이 균형후 중지아™KDC-2046 저속냉동원심 분리기후 5℃, 3500rpm 원심 21분(원심 분리기 기준 작동프로세스는 사용자매뉴얼을 참조로 함). 위의 액체를 청정 플라스틱용기에 밀봉후 -80℃의 냉장고에 넣는다. 매번 5ml 샘플을 남겨 그다음 테스트에 사용한다.

모든 절차는 전부 무균조건에서 진행한다.

실시 사례 2

1. 재료

상용 일반 시약, 예를 들면 수산화나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 수합인산나트륨, 이인산나트륨, 중탄산나트륨, 탄산나트륨, 염화마그네슘, 아세톤, 농유산, 농염산, 크실렌, 무수에탄올, 파라핀과 자당 등 국약그룹화학시약유한회사에서 구매한 시；로링황산나트륨과 에틸아민 등 미국 Sigma회사； Triton X-100와 헤파린은 북경딩구어회사； Tween-20는 미국 Thermo Fisher회사； 포수크로랄은 북경 수어바우라이과기유한회사； 파라포름알데히드와 Masson Masson 삼색염 시약박스는 구글생물과기회사； OCT 매립제는 일본 사쿠라회사； 형광추출물봉평제는 미국 Vector회사에서 구매했다.

토끼 항사람/쥐 Aurora B 항체는 미국 Sigma Aldrich회사；토끼 항사람/쥐 인산화히스톤백 H3 다항은 독일 Merck Millipore회사； 토끼 항사람/쥐 cTnT 다클론부조화는 영국 Abcam회사； Alexa Fluor 594 표기산양항토끼 IgG.Alexa Fluor 488표기산양항토끼 IgG.Alexa Fluor 594 표기산양항쥐 IgG와 Alexa Fluor 488 표기산양항쥐 IgG는 미국 ife Technologies회사； DAPI미국 Sigma Aldrich회사에서； 산양혈청업무액은 무한 박사생물공정유한회사에서 구매하였다.

Trizol는 미국 Invitrogen 회사； 염산아드리아마이신은 상해생물공정주식유한회사에서 구매하였다.

실험동물은 수컷 C57BL/6J 생쥐이고, 상해 스라이커실험동물유한회사에서 구매하였다.

Leica Dmi8 형광현미경과 Leica IM50 디지털화상수집시스템은 독일 Leica회사； 소동물 초음파 진단의기는 캐나다 VisualSonics회사에서 구매하였다.

0.1mol/L 인산염완충용액(1×PBS)의 조제： NaCl 8.0g, KCl 0.2g, Na₂PO₄·H₂O 3.58g, KH₂PO₄ 0.24,pH 수치를 7.4로, 이온수를 1000ml로 정용, 고압멸균, 4℃에 저장한다.

0.5% Triton X-100의 조제： Triton X-100 원액 5ml, 1×PBS 995ml.

2. 실험방법

(1) 면역형광

(a) 실험요구에 따라 세포클라이밍 슬라이스 또는 냉동슬라이스를 잘 처리하여 PBS 세척, 5min×3번 한다.

(b) 0.5% Triton X-100 실온에서 5 min, PBS 세척, 5min×3회 진행한다.

(c) 염소 혈청 37℃ 밀봉 30min.

(d) 혈청을 폐기, 1항안을 적당한 비율로 희석하여 조직에 떨구어 덮어주어 4℃ 젖은 박스에서 하루밤 지낸다.

(e) 젖은 박스를 꺼내, 37℃ 반복온도 30 min, PBS 슬라스이스 또는 조직슬라이스를 세척, 5min×3 次.

(f) 이항안 적당한 비율로 희석하여 조직에 떨구어 덮고, 37℃ 부화시키고 30 min~60min.

(g) PBS 3번 세탁, 매번 5min,DAPI 염핵 10 min.

(h) PBS 3번 세탁, 매번 5min,정화 방지 폐쇄제 밀봉후 형광현미경아래서 관찰하고 분석한다.

(2) H&E 염색

(a) 4μm 두께로 슬라이스하고, 42℃ 꺼내어, 60℃ 구워서 하룻밤 지내고 상온에서 저장한다.

(b) 파라핀슬라이스를 탈랍하여 물에 넣는다： 크실렌 3번, 매번 20min； 구배알코올(100%, 95%, 95%, 90%, 80%)에서 수화한다, 각： 2min, 2min, 2min, 1min, 1min, 수돗물로 5min 세척한다.

(c) PBS 3번 세척하고, 매번 5min.

(d) 헤마토실린 염색 5min.

(e) 수돗물로 10min 세척한다.

(f) 1％ 염산알코올로 2번 분화하고 수돗물 5 min 세척한다.

(g) 1% 암모니아수 파란색 2min, 수돗물로 5분 세척한다.

(h) 이홍염색 1-5min.

(i) 각자 80%, 90%, 95%, 95%, 100% 알코올로 탈수, 시간은 1min, 2min, 2min, 2min, 2min이다.

(j) 크실렌 투명 3번, 매번 2min.

(k) 중성생고무로 밀봉, 현미경하에서 관찰한다.

(3) 마송 삼색 염색

(a) 파라핀슬라이스 탈랍하여 물.

(b) 크로마이징 처리(중크롬산칼륨으로 하룻밤 지냄).

(c) 순서에 따라 수돗물과 증류수로 세척.

(d) Harris 헤마토실린 염색액 또는 Weigert 헤마토실린액 염색 핵 1-2min.

(e) 충분하게 물로 세척하고 염색이 지나치면 염산알코올로 2-3s 분화한다.

(f) 암모니아수로 파란색으로 돌아오게 한다 2min.

(g) Masson후천홍산홍화용액 5-10min.

(h) 1% 인산화물 욕액 3-5min 분화한다.

(i) 1% 아닐린블루 또는 연두 염색 5min한다.

(j) 1% 빙초산 수용액으로 몇초간 분화시킨다.

(k) 95% 알코올. 무수 알코올. 크실렌투명. 중성 생고무로 밀봉고정시킨다.

결과： 콜라겐섬유. 점액. 연골은 파란색을 띠고 (연두색액으로 녹색으로 염색한다), 생리양수. 근육. 섬유소. 신경교는 붉은색을 띠고 세포핵은 흑남색을 띤다.

(4) 생쥐심근경색모듈의 건립

8주된 C57BL/6J 수컷 생쥐를 유인박스서 이소플루오로헥산가스로 마취한후 호흡기 빈도는 115次/min, 호흡비율은 1:1, 습기량은 1.5ml이다. 20g 정맥소켓 플라스틱관으로 입기관에 호스를 박고 소동물의 호흡기에 연결한다. 2.5% 이소플루오로헥산의 순수 산소로 지속적인 마취를 진행한다. 비피후, 3-4번째 늑골간에 개복하고 심장을 보이게 하고 7-0 prolene라인 좌전방에 항지결찰하고, 심장끝부분이 하얗게 변화하는 것을 볼수있다. 늑골간을 봉합하고 가죽을 봉합하고 소독한다. 마취약을 끊고 지속적으로 산소를 공급하여 생쥐가 소생하게 한다.

(5) 생쥐심부전모듈의 건립

8주된 C57BL/6J 수컷 생쥐 7일마다 아드리아마이신(5mg/kg)을 주사하고, 총 4번 주사한뒤 생쥐는 심부전을 일으키고 심장 초음파로 검증한다.

(6) 재료 수집, 고정과 슬라이스

(a) 수술후 1주일과 8주일 치료하고 생쥐의 복강에 10%의 포수크로랄(200mg/kg)을 주사하여 죽인후 심장을 꺼내어 1주일후 재료를 꺼내는데 간과 신장을 포함하며, OCT나 파라핀으로 묻는다.

(b) 냉동슬라이스는 면역형광 =파라핀슬라이스를 제작하는데 사용하고 H&E와 마송 삼색 염색을 한다.

(c) 표본이 마송 삼색 염색후 Image J 영상분석 소프트웨어로 심근경색크기를 분석한다. 심근경색면적 계산공식은：

매 표본은 5개 단면을 취하고 평균치를 계산한다.

3. 통계분석

모든 실험결과는 전부 Mean ±SEM로 표시한다. 두개 팀 간에 대조하여 Two-tailed tailed t를 사용하여 검증하며 각 팀간에는 대조하여 일원 분산 분석 (one way ANOVA)을 사용한다. P<0.05는 식별력 통계학차이의 기준이다. 모든 실험결과는 GraphPad Prism 5 (Software, Inc.)와 Image J 소프트웨어를 사용하여 그림을 만들고 분석한다.

4. 실험결과

(I) 상기 (4)에서 서술한 상기의 방법으로 생쥐심근경색모듈을 건립한다. 건립한 생쥐심근경색모듈은 대조팀(NS)과 닭 배태양수(EE) 치료팀(매 팀 6마리)으로 나눈다. EE 치료팀은 매일 미정맥주사 100마이크로 리터 실시 사례 1의 제작으로 얻은 EE, 제3주 21일 되는 날에 도합 10번 주사하였다. 대조팀은 같은 방식으로 생리식염수 100마이크로 리터를 10회 주사한다.

좌심실박출율(LVEF)은 좌심실기능의 중요한 기준지표이다. 좌심실박출율의 제고는 생쥐가 심근경색후의 심장기능이 높아진것을 보여준다. 심장 초음파로 생쥐의 박출율을 추산하며, 결과는 그림 1과 같다. 그림 1에서 볼수 있다 싶이 제3주시EE의 치료는 뚜렷하게 심근경색 생쥐의 좌심실박출율을 높였으며, EE의 치료가 생쥐 심근경색후의 심장기능을 뚜렷하게 높여준 것을 보여준다.

심장 초음파로 추산해낸 각 팀의 생쥐의 좌심실축단축단축율(LVFS)의 결과는 그림 2와 같다. 그림 2에서 보다싶이 제3주시 EE의 치료는 심근경색 생쥐의 LVFS을 뚜렷하게 높여주고, 생쥐 심근경색후의 심장기능도 높여주었다.

마송 삼색염색은 심장경색조직과 섬유조직을 판단하는 기본적인 방법이다. 21일된 처리한후의 각 팀의 생쥐를 죽인후 제작팀은 심근경색조직의 파라핀슬라이스, 상기 제(3)에 따라 염색한다, 결과는 그림 3과 같다. 그림 3에서 파란색은 경색 섬유화조직이고 빨간색은 근육조직이다. 그림에서 보다싶이 심근경색 생쥐는 엄중한 섬유화로 되었으며 EE치료호 섬유화는 뚜렷하게 감소되었는바 EE의 치료가 생쥐 심근경색후의 섬유화를 방지한 것을 설명한다. 그리고 좌심실강의 크기는 심근경색후에 심실확대유무를 판단하는 의거이며 심실확대는 심장기능이 내려가는 중요한 표지이다. 그림 3에서 보다싶이 대조팀 심근경색 생쥐 심실강은 엄중하게 확대되었으며 EE 3주 치료를 거친후 치료팀 생쥐 좌심실강은 뚜렷하게 확대되지 않았다.

PH3 염색은 심장내 세포 재생상황의 지표이다. 21일 처리후 죽인 각팀의 생쥐로 심근조직의 냉동슬리이스를 제작하여 상기 제(1)의 상기 방법으로 PH3 염색을 진행한 결과는 그림 4와 같다. 그림 4에서 잘 보여지다 싶이 EE 치료팀 생쥐 심장 조직에서 PH3 염색양성(녹색 형광점, 화살표가 가리킨다) 세포가 뚜렷하게 증가되었으며 이는 EE의 치료가 심장조직내 세포의 재생을 촉진하였음을 의미한다. AuroraB 염색은 심장내 세포 재생상황을 판단하는 지표이다. 상기 (1)의 상기 방법으로 AuroraB 염색을 진행한 결과는 이하 그림 5와 같으며 그림 5에서 뚜렷하게 EE 치료팀 생쥐심장조직의 AuroraB 염색양성(녹색 형광점, 화살표가 가리킨다) 세포가 뚜렷하게 증가되었다는 것은 EE 치료가 심장조직내 세포의 재생을 촉진하였음을 나타낸다.

(II) 상기 방법 (5)를 참조로 생쥐심부전모듈을 건립한다. 건립한 생쥐심부전모듈은 대조팀과 닭 배태성분 추출물(EE) 치료팀(매팀 6개). EE 치료팀은 매 2일마다 미정맥주사 100 마이크로리터 실시 사례 제작으로 EE를 얻은후, 제3주 21일 되는 날에 도합 10번 주사한다. 대조팀은 같은 방식으로 생리식염수를 10번 주사한다. 대조팀은 같은 방식으로 생리식염수 100마이크로리터 10번 주사한다.

좌실 박출율(LVEF)은 좌심실 기능의 중요한 기준지표이며 좌심실 박출율의 제고는 생쥐심부전후의 심장기능이 높아진것을 보여준다. 심장 초음파후 생쥐의 박출율을 추산해보면 결과는 그림 6과 같다. 그림 6에서 보면 3주가 되었을때 EE의 치료는 심장쇠약 생쥐의 좌심실 박출율을 현저하게 높이며 EE의 치료는 현저하게 심부전생쥐의 심장기능을 높여준다. 좌심실 섬유화면적은 뚜렷하게 내려갔다.

실시 사례 3

본 실시 사례히다찌 Primaide형 고효능 액체 그로마토 크래프로 서로 다른 태년의 계란의 양수성분을 검사한다. 그로마토 크래프의 사용 매뉴얼에 따라 검사한다, 그중에서 검사 시작전에 먼저 100% 아세토 니트릴에 30분간 세탁하며, 유속시간은 0.8mL/min, 그다음 물로 30분간 평형시키며, 유속은 0.8mL/min시간이다. 25μL 샘플을 추출하고 기포를 제거한후 그로마토 크래프를 클릭하여 자체 소프트웨어의 “데이터 수집”버튼을 클릭하고,“방법 2”를 선택하고,화면 하단의 “단분석 시작”을 클릭하고 시스템에 “샘플 입고 대기”가 나타나면 샘플을 주사하고 주사는 빨리 하여야 하며 주사 완료후 밸브를 바꾼다. 그 방법 2는 이하와 같다：

본 실시 사례는 태년이 7일, 11일, 13일 된 양수를 검사하며 결과는 이하 7－9와 같다.

실시 사례 4

DPPH 즉 1,1-디페닐-2-히드라진 자유기, 구조는 이하와 같다:

DPPH의 분자에서 여러개의 전자를 흡수하는-NO₂와 벤젠고리, 대 π 버튼이 존재하기에, 때문에 질소자유기는 안정된 존재이다.

DPPH 자유기가 제거되면 최대 흡수파장이 519nm 되는 흡광도 A 수치가 따라서 감소된다. DPPH 이러한 안정된 자유기는 자유기 활성을 제거하는 검사에 하나의 이상적이고 간단한 약리모듈을 제공하여준다. 본 실시사례는 DPPH로 닭배태 양수의 항자유기능력을 검사한다.

0.8mg 되는 DPPH를 취하여, 20mL 용액의 메탄올에 용해시키고 초음파 5min,충분하게 흔들어서 상하각 부분이 골고루 섞이게 한다. 1mL 되는 그 DPPH 용액을 취하여 519nm에서 A₀수치를 측정한다, A＝0.5-0.7. 그 DPPH 용액은 빛을 피하여 저장하며 3.5시간내에 사용완료하여야 한다.

실시 사례 1 상기의 방법을 이용하여 각각 태년이 6일, 7일, 8일, 9일, 10일된 닭이 배태한 양수를 얻어서 원심후 4℃ 냉장고에서 사용대기한다.

비타민 C를 정대조로 하여 기준곡선을 측정한다. 각기 다른 체적의 0.04mg/ml Vc 샘플에 0.6ml의 DPPH를 넣고 무수에탄올을 보충하여 1ml까지 되게 하고 혼합시키고 메탄올을 대조로 0으로 조정하며 519 nm파장하의 흡광치를 측정한다. 3번 반복하여 데이터를 얻은후 그림을 만든다.

서로 다른 태년의 양수 400μl를 시험관에 넣은후 600μl에 넣어 제작해 놓은 DPPH 메탄올 용액에 넣고 잘 섞어서 반응 10min 하여 기포가 다시 발생하지 않게 한다(측정전에 미리 혼합한다). 메탄올을 대조로 0으로 조정하고 519 nm의 흡광도를 측정한다.

각 팀의 샘플정보는 이하와 같다：

이하 회사의 크레아틴소해율(억제율)：

소해율(％)＝(A₀-A)/A₀×100％.

결과는 그림 10와 같다.

실시 사례 5

본 실시 사례 테스트 실시 사례 1의 계란양수(EE)가 닭 배태 성섬유세포가 서로 다른 배양조건에서의 생장에 대한 영향이다. 본 실시 사례에서 사용한 DMEM 배양기의 조성은 이하와 같다： Gibco® #Cat. 11960077, 加入 1% L-글루타민(Solarbio® #G0200)와 5% FBS(Gibco® #Cat.10099141)), 0.25% 판크레아틴(항주커이생물™ #CY003), PBS(BI™ #02-024-1ACS), 0.4% 탁상판 블루염색제(BBI™ #72-57-1).

1. 닭배태성섬유세포의 획득과 배양

태년 7일된 계란의 배태를 취하여 PBS로 배태의 표면을 세척하고 액체를 피펫 건으로 깨끗하게 흡수한다. 배태 내장을 꺼내고 기타 조직을 잘라서 육안으로 볼수 있는 0.25% 판크레아틴으로 피켓건으로 조직을 혼합하여 세스펜션을 흡수하여15ml 원심관에 넣는다. 1ml 되는 0.25% 판크레아틴으로 배양기를 세척하고, 세스펜션을 동일한 15ml 원심관에 흡입한다. 원심관을 37℃ 물에 넣어 수욕하고 5-7분 소화한후 8ml 되는 DMEM 배양기(PBS포함)에서 판크레아틴을 중화시킨다. 원심관을 원심 분리기에 넣고 5-10초후 원심관을 꺼내고 상청액을 수집한다. 2000rpm 원심이 그 원심액을 2min 돌린다. 그 상청액을 폐기하고 4ml의 DMEM 배양기에 넣은후 창끝으로 세포를 중현한다. 1ml 되는 세포를 세스펜션으로 10cm 세포배양기에 주입후, 다시 10ml의 DMEM 배양기안에 넣는다. 십자방향으로 배양기를 흔들어 매 방향으로 적어도 20회 흔든후 세포분포를 골고루 시킨다. 37℃. 5％ CO₂ 조건에서 배양한다.세포가 70%-90%의 배양기의 밑부분을 덮을때 세포를 계대한다.

배양기를 배육박스로부터 꺼내고 원유의 배양기를 수집하여 원심관중에 설치한다. 조심스럽게 5ml의 PBS로 세포를 세척한다. 그다음 500μl. 0.25% 판크레아틴을 넣고 배양기를 배육박스안에 넣고 1분간 소화시킨다. 배양기옆을 살살 두드려서 소화과정을 빠르게 시킨후 세포단을 빠르게 분해시키고 대부분의 세포는 떠있는 상태로 된다. 빠르게 9.5ml의 회수한 원래의 배양기에서 핀크레아틴판크레아틴을 중화시킨다. 이액관으로 배양기 밑바닥을 불어 두드린후 가능한 많은 세포세스펜션을 15ml 원심관속에 수집하여, 2000rpm에서 3min 원심한다. 상청을 폐기한후 4ml를 DMEM 배양기에 넣고, 창끝으로 세포를 중현한다. 각각 1ml 세포세스펜션에 10ml 를 함유하고 각기 다른 체적비율의 양수를 함유한 신선한 배양기 10cm 세포배양기안에 주입한다. 십자방향으로 배양기를 흔들고 매개 방향으로 적어도 20회를 흔들어서 세포를 골고루 분포시킨후 37℃. 5％ CO₂ 조건에서 배양한다.

생장이 양호한 닭 배태 성섬유세포를 꺼내어 원래의 배양기를 수집하여 원심관에 넣는다. 조심스럽게 5ml 되는 PBS에서 세포를 세척한다, 주의할 점은 세포층이 파손되게 하면 안된다. 살살 흔든후 PBS를 도태시킨다. 100μl를 넣은후 0.25% 판크레아틴으로 2-5분간(24공판) 소화시킨후, 100μl로 배양기에서 중화시킨다. 창끝으로 단세포 세스펜션으로 되게 한다. 일정한 배수로 단세포 세스펜션을 희석한후, 같은 양의 0.4% 대망남염액을 넣어 염색하고, 배수를 희석한후 세포수는 20-200사이에 있는것이 좋다. 적당량의(15μl) 세포 세스펜션을 흡취하여, 유리덮개에서 상하옆으로부터 샘플을 넣어서 혈구 계수판에서 현미경 아래에서 살아있는 세포수를 계산한다. 살아있는 세포총수를 계산하고 세포농도를 조정하여 1×10⁵개 세포/ml에 도달하게 한다. 매 24시간마다 샘플을 한번씩 취하고 매번마다 3개의 공세포를 취하여 통상적으로 판크레아틴 소화, 단세포 세스펜션 제작. 현미경으로 계산한다. 시간(일)을 가로축으로 한후 세포농도를 세로 축으로 그려서 생장곡선을 그린다. 세포갯수=세포 총수/4×10⁴×희석배수, 세포농도=그 세포갯수/ml.

결과는 그림 11와 같다. 그림 11이 표시하다싶이,총 96시간을 배육후 EE의 실험팀에서 닭 배태성섬유세포의 세포수량은 뚜렷하게 미첨가 EE한 대조세포보다 많다.

실시 사례 6

사용과 실시 사례 1과 동등한 방법으로 태년이 8일된 오리알의 양수를 얻는다. 흔적실험을 사용하여 양수가 계란양수가 닭 배태 성세포와 오리알 양수가 사람탯줄정맥내피세포(HUVEC)의 생장활력과 이전능력에 대한 영향을 테스트한다. 오리알 양수는 태년 8일된 오리알에서 채취하며 실시사례 1의 방법으로 얻는다. 닭 배태 성세포는 실시사례 5의 상기의 방법으로 얻으며 인간탯줄정맥내피세포는 시중에 유통되는 경로로부터 얻는다.

본 실시 사례에서 사용하는 DMEM 배양기의 조성은 이하와 같다：Gibco® #Cat. 11960077, 1% L-글루타민(Solarbio® #G0200)와 5% FBS(Gibco® #Cat.10099141)), 0.25% 판크레아틴(항저우커이생물™ #CY003), PBS(BI™ #02-024-1ACS), 0.4% 대망남염제(BBI™ #72-57-1).

실험 하루전에 6공판을 준비하고 유성펜으로 6공판 뒷면에 직선자로 5-6개의 균일하게 분포된 가로선을 그어서 구멍을 가로 지나간다. 그다음 중간선 위치에서 수직된 세로선을 그어 흔적위치를 지시한다. 매개 구멍에는 대략 5×10⁵개의 대수생장기의 세포이며 원칙적으로 접종후 하룻밤 지나면 용합율이 90%에 미친다.

실험 당일, 창끝으로 직선자를 비교하며 유성펜 세로선을 따라 6공판 밑판에 수직되게 선을 긋는다. 가능한 기울어지지 않고 휘지 않고 서로 다른 구멍간에 가장 좋기는 같은 창으로 넓이는 1000-2000μm로 하는 것이 좋다. 매 구멍은 2ml PBS로 3번씩 세탁하여 흔적의 세포를 씻어버린다. 매 구멍마다 각각 2ml의 서로 다른 함량의 EE의 배양기에 넣으며 통상적으로 매 48시간마다 액체를 바꾼다. 흔적부터 계산해서 0h, 매 24시간마다 사진을 찍고 흔적 양측의 세포간 거리를 측량한다. 매 구멍안의 세포 생장상황을 관찰하며 시간을(일) 가로축으로 하고 매 구멍의 흔적간의 거리를 세로 축으로 그림을 그리며 매 구멍안의 흔적이 유합되는 속도를 계산한다.

그림 12와 13. 그림 12는 계란의 양수가 인간탯줄정맥내피세포(HUVEC)의 생장활력과 이전능력에 대한 영향이며 5％(체적대비)를 추가한 양수는 뚜렷하게 HUVEC의 유합에 대하여 아주 뚜렷한 촉진작용을 한다. 그림 13은 오리알의 양수가 닭 배태 성섬유세포의 생장활력과 이전능력에 대한 영향, 양수의 첨가가 닭 배태 성섬유세포의 유합에도 아주 뚜렷한 촉진작용을 나타내고 있다. 닭배태성섬유세포의 생장활력과 이전능력에 대한 영향은 양수의 첨가가 닭배태성섬유세포의 유합에도 아주 뚜렷한 촉진작용을 하고 있음을 나타낸다.

실시 사례 7

본 실시 사례의 목적은 분석기둥 젤기둥 SephacrylS-200. 음이온교환기둥HiPrep Q. 탈염주 HiPrep 26/10 Desalting.HiLoad 16/600 Superdex75 pg을 통하여 점차 닭배태 양수 가운데 생물활성을 갖고 있는 화합물을 순화시킨다.

1. 재료

1.1 순화 샘플：신선한 태년이 7일된 계란양수, 50ml.

1.2 주요한 실험설비 및 소모품

1) GE AKTA purifier；

2) 젤기둥 GE Sephacryl S-200；

3) 음이온교환기둥 GEHiPrep Q；

4) 탈염기둥 GEHiPrep 26/10 Desalting；

5) 젤기둥 GEHiLoad 16/600 Superdex75pg；

6) Superloop 10 ml.

2. 방법

2.1 용약제작

인산나트륨완충용액 A(50 mM Na₂HPO₄+NaH₂PO_4,pH 8.0)의 제작： 46.6ml 1mol/l Na₂HPO₄

3.4 ml 1mol/l NaH₂PO₄ 혼합, ddH₂O을 넣어 정용하여 1L까지 만든다.

2.2 실험방법

2.2.2 샘플처리：신선한 양수 50ml, 적당량의 에탄을 넣어 2500rpm. 4℃ 원심 20 min, 수상을 얻고, 0.22μm 여과막으로 여과시킨다.

2.2.3 샘플순화

제1보： 젤기둥 GE Sephacryl S-200

ddH₂O 젤기둥 평형： 유속 2ml/min, 280nm 자외흡수곡선이 평온하고 기준선에 회귀할때까지；

사용 적재： 유속 1ml/min, 사용 적재량 10 ml；

용리： 탈기 ddH₂O 조제품의 용출을 진행한다. 유속 2ml/min,은 체적으로 유분을 수집한다, 3ml/관이다. 2기둥체적(240ml) 용리；

반복적으로 순화원심 5회를 진행하고 매번 같은 정상시간의 부분을 충분하게 혼합한다.

제2보： 음이온교환기둥 GE HiPrep Q

인산나트륨완충용액 A(50 mM Na₂HPO₄+NaH₂PO_4,pH 8.0)음이온교환기둥을 평형하고：유속 2 ml/min, 80 nm 자외흡수곡선이 안정되고 기준선에 회귀할때까지.

사용 적재： 제1보 순화한후 생물활성을 가지고 있는 부분을 취하여 펌프를 사용하여 적재유속 1.5ml/min, 사용 적재량 250 ml, 동시에 동등한 체적으로 음이온기둥이 결합하지 않은 부분, 2 ml/관이다；

탈염： 이온기둥에서 결합과 결합하지 않은 유분을 각각 GE HiPrep 26/10 Desalting으로 바꿔서 탈기 ddH₂O안에, 탈염뒤의 부분을 수집한다；

제3보： 젤기둥 GE HiLoad 16/600 Superdex75pg

ddH₂O 젤기둥 평형： 유속 1 ml/min, 80nm 자외흡수곡선이 안정되고 기준선에 회귀할때까지；

사용 적재： 유속 1ml/min, 사용 적재양 10ml；

용리： 탈기 ddH₂O로 샘플 용리, 유속 1ml/min, 같은 체적으로 유분을 수집, 2ml/관. 용리 1.5 기둥체적(240ml)；

세포활성 측량：생장이 비교적 좋은 AC16가 소화후, 96 공판에 펴서, 8000개/구멍, 한개 팀 마다 5개 복공이 있도록 한다. 구멍을 메우고 5% CO₂포화습도가 37℃인 배양박스에서 2시간을 배양하면 세포는 벽에 붙는다. 배양기 DMEM로 24시간 기아배양후, 10% FBS의 DMEM.DMEM로 교환하고 20%(체적비)유분의 배양기를 첨가한다. 24시간 배양후 매개 구멍마다 10μl CCK-8시약을 넣는다. 2시간 부화한후 마이크로 플레이트 리더로 450nm 흡수치를 검측한다.

3. 실험결과

젤기둥 GE HiLoad 16/600 Superdex75 pg이 분리한 미결합부분의 색보도는 이하 그림 14와 같다. 세포활력 검측추종은 생물활성을 지닌 성장 인자군락까지 하였으며 결과는 이하 그림 15와 같다.

실시 사례 8

사례 7과 같은 방법을 사용실시하여 이하 원심순화를 실시한다：

1. 활성성분 원심 순화

제1보： 젤기둥 GE Sephacryl S-200

ddH₂O 젤기둥 평형： 유속 2ml/min, 280nm 자외흡수곡선이 안정되고 기준선에 회귀할때까지；

사용 적재： 유속 1ml/min, 사용 적재양 10 ml；

용리： 탈기 ddH₂O 조제품의 용출을 진행한다. 유속 2ml/min, 분자량이 500-2000 돌턴 범위내의 유분수집；

반복 원심 순화 5회, 매회중 같은 출봉시간의 부분을 충분히 혼합한다.

제2보： 양온교환기둥 GE HiPrep SP

인산나트륨완충용액 A(50 mM Na₂HPO₄+NaH₂PO_4,pH 5.8) 양이온교환기둥 평형： 유속 2 ml/min, 280 nm 자외흡수곡선이 안정되고 기준선에 회귀할때까지；

사용 적재： 제1보에서 얻은 분자량이 500-2000 돌턴범위내의 유분, 펌프 사용 적재유속 1.5ml/min, 사용 적재양양 50 ml, 양이온교환기둥 미결합부분 수집；

제3보： 젤기둥 GE HiLoad 16/600 Superdex75pg

ddH₂O 젤기둥평형： 유속 1 ml/min, 280nm 자외흡수곡선이 안정되고 기준선에 회귀할때까지；

사용 적재： 제2보에서 얻은 미결합부분사용 적재, 유속 1ml/min, 사용 적재양양 0ml；

용리： 탈기 ddH₂O로 용리샘플, 유속 1ml/min, 분자량이 500-1200 돌턴범위내의 유분 수집.

2. 활성성분 검츨

성장이 기교적 좋은 AC16 소화후, 96공판에 펴놓고, 8000개/구멍, 매 팀이 5개 구멍을 메우고 이 있게 한다. 在 5% CO₂포화 습도가 37℃인 배양박스에서 2시간 배양하여 세포가 벽에 붙게 한다. 배양기 DMEM 기아배양 24시간후 10% FBS의 DMEM.DMEM로 교환하고 20%(체적대비)유분을 첨가한 배양기. 24시간 배양한후 매 구멍마다 10μl CCK-8 시약을 넣는다, 부화 ]2시간후, 마이크로 플레이트 리더는 450nm에서 흡수치를 검측한다. 음이온교환기둥 GE HiPrep SP 처리후 불결합구역의 세포활력은 아래 그림 16과 같다.

실시 사례 9

사용과 실시 사례 7과 같은 방법으로 이하 원심순화한다：

1. 활성성분 원심순화

제1보： 이온교환기둥, 음이온이온교환기둥 HiPrep Q을 사용하여 용액의 pH를 각각 5.8와 8.0, 그다음 각각 적재와 이온교환기둥을 사용하고, 유속 2 ml/min, 280 nm 자외흡수곡선이 안정되고 기준선에 회귀할때까지；

사용 적재： 양수를 취하고 펌프를 사용하여 적재유속 1.5ml/min, 사용 적재량 50 ml, 이온기둥과 미결합유분 수집；

제2보： 젤기둥 GE Sephacryl S-200

사용 적재： 샘플은 제1보 미결합유분, 유속 1ml/min, 사용 적재량 10 ml；

용리： 탈기 ddH₂O로 조제품의 용출을 진행한다., 유속 2ml/min, 분자량이 500-2000 돌턴범위내의 유분을 수집한다；

제3보： 젤기둥 GEHiLoad 16/600 Superdex75pg

ddH₂O 젤기둥 평형： 유속 1 ml/min,280nm 자외흡수곡선이 안정되고 기준선에 회귀할때까지；

사용 적재： 제2보에서 얻은 500-2000 돌턴범위내의 유분사용 적재, 유속1ml/min,사용 적재량 10ml；

용리： 탈기 ddH₂O 용리샘플, 유속 1ml/min로 분자량 500-1200 돌턴 범위내의 유분을 수집한다.

2. 활성성분 검측

성장이 비교적 좋은 AC16 소화후, 96공판에 펴바른후 8000개/구멍, 매팀은 5개 구멍을 메우고 이다. 5% CO₂포화습도가 37℃인 배양박스에서 2시간 배양한후 세포는 벽에 붙는다. 배양기 DMEM 기아배양 24시간후 10% FBS의 DMEM.DMEM로 교체하고 20%(체적대비)유분의 배양기를 첨가한다. 24시간 배양한후 매개 구멍마다 10μl CCK-8 시약을 넣는다. 2시간 부화한후 마이크로 플레이트 리더로 450nm 흡수치를 검측한다. 음이온교환기둥 GE HiPrep Q 처리후 부결합구역의 세포활력은 그림 16과 같다.

실시 사례 10

1. 1차심근세포(VM)이심

갓난 생쥐의 심실을 예랭 PBS에서 세척후 DMEM/F12속에서 심장조직을 잘게 자른다. 37℃ 수욕진당, 0.04％ 콜라게나아제 Ⅱ ＋ 0.08％ 판크레아틴으로 소화한다. 채로 이미 소화해낸 세포를 여과원심하고, 1000r/min,10min. 15％ FBS 세포배양액을 첨가하여 펴바른후 5％CO₂포화 습도가 37℃인 배양박스에서 배양한다.

2. 세포활력검측

1차심근세포 소화후, 96공판에 펴바르고, 6000개/구멍, 매팀은 5개 구멍을 메우고 이 있다. 5％ CO₂ 포화 습도가 37℃인 배양박스에서 24시간 배양한후, 각각 배양기 DMEM/F12. 10％ FBS의 DMEM/F12 포함하고 10％ FBS와 5％ EE(실시 사례 1에서 제작하여 얻은 양수, 체적대비)인 DMEM/F12로 원래 배양기 15％ FBS인 DMEM/F12을 얻는다. 48시간 배양후, 매 구멍마다 10μl CCK-8 시약을 넣는다. 2시간 부화한후 마이크로 플레이트 리더로 450nm 흡수치를 검측한다.

결과는 그림 17과 같다.

실시 사례 11

실험용 흰돼지로 피부동맥도관(PCI)으로 심장 관상동맥앞에 항지에어포켓막힘을 50분간 진행후 제거하고 흰돼지의 심장허혈재수송모듈을 구축하고 수술후 즉시에 정맥주사를 실시한다. 사례 1의 상기 방법으로 얻은 닭 EE(1ml/kg)에 치료료를 진행한다. 수술전에 기초적인 심장기능을 측정한다. 결과는 그림 18과 19과 같다.

그림 18에서 표시하다싶이 닭 EE로 심근경색 흰돼지를 치료하면 심근경색 흰돼지의 좌심실박출율과 축단축단축율, 수술화 대조팀 흰돼지의 심장기능은 점차 하강세를 보여주고 EE 치료팀과 좌심실기능은 일정하게 회복되었으며, 수술후 2주. 4주와 8주된 EF와 FS는 뚜렷하게 대조팀(그림 18,A와 C)보다 높아진다. 수술전 기초수치의 계차에 대하여 ΔEF와 ΔFS통계를 진행하며, EE치료후 1주에 뚜렷하게 EF와 FS 수술전보다 하강수치를 나타내고, 치료팀 2주. 4주와 8주의 하강수치는 뚜렷하게 대조팀(그림 18,B와 D)보다 낮다. 치료팀의 매 박 수출량은 수술후의 1-8주가 뚜렷하게 대조팀(그림 18, E)보다 높다. 대조한 좌심실 수푹말기의 용적과 직경이 상승세를 취하며 치료팀은 대조팀보다 낮고(그림 18, F와 I), EE가 좌심실 수출력을 제고한것을 보여준다. 대조한 좌심실 심장이완 말기의 용적과 직경은 상승세를 취하며 투약팀은 먼저 상승하고 그후에 하강하는 추세(그림 18, G와 H)를 나타낸다, EE은 부분적인 심근경색(myocardialinfarction,MI)이 초래한 심실재구성을 역전시킨다.

흰돼지 허혈재수송(IR) 모듈후, 투약팀은 즉시에 닭 EE로 치료하며, 대조팀은 5% 포도당주사를 투약한다. 사육시 관찰과 영상 단속 시스템을 통하여 발견하다싶이 대조팀 흰돼지 활동시간은 적고 피곤해보인다, 수술후 1주, 통계에 따르면 치료팀 흰돼지의 일상활동시간이 대조팀(그림 19, D)보다 뚜렷하게 많다. EE 치료후 8주에 재료를 취하여 심장층절후 염화삼둔기테트라졸(TTC) 염색후 발견하다싶이 대조팀의 심첨부터 전벽까지의 심근이 뚜렷하게 얇아지는 동시에 대조팀 심장조직가운데 지방조직이 증가하였다(그림 19, A), 통계에 따르면 치료팀 TTC 염색후 경색이 백색을 띤 면적이 대조팀보다 뚜렷하게 낮은것을 발견하였다.(그림 19, B).

경색구역 좌심실전벽조직을 취하여 마송 삼색 염색하면서 발견하다싶이, 대조팀이 투벽성경색사를 나타내고 심실벽이 얇아지고 EE 치료팀의 심장섬유화는 심근사이에 끼어있고 실벽은 뚜렷하게 얇아지지 않았다.(그림 19, C).

상기 결과가 보여주다싶이, EE는 뚜렷하게 허혈재수송 흰돼지의 좌심박출율과 매 박 수출율을 높이고 심근경색이 초래한 좌심실 재구성을 경감시키고 허혈 재수송돼지의 폐어혈을 경감시키고 매일 활동량을 높인다. 이외에 TTC 염색결과가 나타내다싶이, EE 치료팀 심장경색면적은 대조팀에 비하여 뚜렷하게 낮아지고 조직마송 염색결과가 보여주다싶이 대조팀 흰돼지의 좌심전벽에는 투벽성경색이 나타나고 섬유화면적이 EE 치료팀보다 뚜렷하게 높으며； 형광염색결과가 나타내다싶이, EE는 흰돼지의 경색구역의 혈관의 신생을 증가한다.

실시참조 사례 1, 상기의 방법으로 생쥐 13-14일 태년의 양수를 얻고, 추출액의 원심관 균형후 중지아™KDC-2046 저속냉동원심 분리기로 5℃, 3500rpm 원심 21분간(원심 분리기 기준 사용 프로세스는 사용자 매뉴얼을 참조로 한다). 청액을 기울여 이전하여 청정한 플라스틱용기에 밀봉하여 -80℃ 냉장고안에 넣는다. 매번 5ml 샘플을 남겨 이후의 테스트에 사용하도록 한다. 모든 절차는 무균조건에서 진행한다.

세포활성화 테스트： 생장세가 좋은 AC16 소화후, 96공판에 펴바르고 공판중에서 8000개/구멍, 매팀은 5개 구멍을 메우고 이 있다. 5% CO₂ 포화습도가 37℃인 배양박스에서 2시간 배양후 세포가 벽에 붙는다. 배양기 DMEM 기아배양 24시간후 10% FBS의 DMEM.DMEM로 바꾸고 각각 2.5%. 5%. 10%와 20%(체적대비)를 생쥐 EE의 배양기안에 첨가한다. 24시간 배양한후 매 구멍마다 10μl CCK-8 시약을 넣는다. 2시간 부화후 마이크로 플레이트 리더는 450nm 흡수치를 검측한다.

결과는 그림 20과 같다.

Claims

일종의 약물조합물의 특징은 상기 약물의 조합물이 이하 물질을 함유하고 있다：
비인간 동물의 양수 또는 그 추출물과 임의로 선택한 약학에서 수락 가능한 매개물；
그중에서, 상기 양수는 태년이 5-12일된 계란, 우선순로 태년이 6-11일된 계란, 최우선순위로 태년이 7-9일된 계란, 최우선순위로 태년이 7-8일된 계란, 또는 발육시기와 상기 태년이 계란이 처한 발육시기와 상응한 닭이외의 기타 가금류의 알이거나 태년이 8-20일되고 우선순위로 8-14일된 설치류동물의 배태, 또는 발육시기와 태년이 8-20일 되고 우선순위로 8-14일된 설치류동물의 발육시기와 상응한 설치류동물이외의 기타 비인간포유동물의 배태이다.
만약 권리 요구에 따라 1 상기의 약물조합물의 그 특징은 상기 약물조합물이 냉동저장한 양수 또는 그 추출물 또는 그 양수 또는 그 추출물의 동결건조시약이다.
만약 권리 요구에 따라 1 상기의 약물 조합물의 그 특징은 상기 약물조합물은 수액과 주사액이다.
만약 권리 요구에 따라 3 상기의 약물조합물의 특징은 상기 약물조합물이 주사용 생리식염수, 주사용수 또는 포도당주사액을 함유하거나 함유하지 않는다.
만약 권리 요구에 따라 1-4 가운데 임의의 상기 약물조합물을 사용하며 그 특징은
상기 양수는 계란. 오리알, 거위알 또는 기타 조합에서 오거나 또는
상기 양수는 임신한지 10-14일된 설치류동물.
만약 권리 요구에 따라 1-5 중의 임의의 상기 약물조합물의 특징은 상기 추출물이 pH 5.8-8.0 사이에서 불화 이온교환기둥과 결합하고 그 함유한 성분의 분자량은 500-1200 돌턴범위내에 있다.
양수 또는 그 추출물이 혈액결핍과 산소 결핍이 일으킨 조직괴사를 치료하는 약물의 제작에 대한 약물의 응용 또는 심장기능을 개선하는 약물중의 응용이다；
그중에서 양수는 태년이 5-12일된 계란에서 채취하고, 우선순위로 태년이 6-11일된 계란, 최우선순위로 태년이 7-9일된 계란, 최우선순위로 태년이 7-8일된 계란 또는 발육시기가 상기 태년의 계란이 처한 발육시기랑 상응한 닭이외의 기타 가금류의 알이나 또는 태년이 8-20일되고 우선순위로 8-14일된 설치류동물의 배태 또는 발율시기와 태년이 8-20일되고 우선 순위로 8-14일된 설치류동물의 발육시기와 상응한 설치류동물이외의 기타 비인간포유동물의 배태이다.
만약 권리 요구에 따라 7 상기의 특징은 상기 약물을 심근허혈괴사를 치료하는 데 사용하거나, 예를 들면 심근경색, 또는 상기약물을 심부전을 개선하는데 사용하거나 노인성 심장기능감퇴 또는 심장기능부전에 사용한다.
만약 권리 요구에 따라 7-8 가운데 임의의 하나의 상기 응용을 사용한다면 그 특징은
상기 양수는 계란. 오리알, 거위알 또는 기타 조합이다.； 또는
상기 양수는 임신한지 10-14일된 설치류동물에서 왔다.
만약 권리요구에 따라 7-9 가운데 임의의 하나의 상기 응용을 하면 특징은 상기 추출물이 pH 5.8-8.0 사이에서 이온불화 이온기둥과 결합하고, 그 성분을 함유한 분자량은 500-1200 돌턴범위내에 있다.