CN108379246A - 莽草酸在制备预防或治疗脱髓鞘疾病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了莽草酸在制备预防或治疗脱髓鞘疾病药物中的应用。本发明通过研究莽草酸在预防或治疗脱髓鞘疾病中的作用发现，莽草酸能减轻髓鞘少突胶质细胞糖蛋白诱导的炎症性小鼠脱髓鞘疾病模型的严重程度；并改善溶血卵磷脂诱导的局灶性小鼠脊髓脱髓鞘模型的脱髓鞘病变情况，莽草酸可以通过促进少突胶质前体细胞分化成为成熟的少突胶质细胞，从而加速髓鞘再生，减少脱髓鞘体积。以上均表明莽草酸对脱髓鞘疾病的临床治疗有巨大的应用前景。

Description

莽草酸在制备预防或治疗脱髓鞘疾病药物中的应用

技术领域

本发明属于生物工程和医学技术领域，具体地说，涉及莽草酸在制备预防或治疗脱髓鞘疾病药物中的应用。

背景技术

中枢神经系统的脱髓鞘损伤广泛存在于多种神经退行性疾病中，如果脱髓鞘损伤得不到及时、有效的修复，不仅影响正常的神经传导，还将进一步导致神经轴突的变性和神经元死亡，引发不可逆转的神经功能障碍。中枢脱髓鞘疾病目前尚无确切有效的治疗手段，寻找合适的治疗策略和靶点至关重要。

在中枢神经系统中，髓鞘指包围在有鞘神经纤维的鞘索状外膜。中枢髓鞘是由少突胶质细胞构成的维持正常神经功能的重要结构，具有促进神经冲动传导、保护轴突、轴突绝缘等功能。少突胶质前体细胞(Oligodendrocyte Progenitor Cells,OPCs)是中枢神经髓鞘形成的起始细胞，同时也是轴突脱髓鞘损伤后自发的再髓鞘化的细胞来源。在受到脱髓鞘损伤时，OPCs会迅速聚集到损伤部位，并增殖分化形成成熟的少突胶质细胞，包裹轴突形成新的髓鞘，从而及时有效地修复受损髓鞘，实现功能重建。然而，在慢性进展性脱髓鞘疾病，如MS中，髓鞘再生可以修复早期的脱髓鞘损伤，但随着疾病进展，髓鞘再生受到阻碍。研究认为，再髓鞘化失败可能是损伤部位OPCs分化为成熟的少突胶质细胞的数量不足导致的。鉴于此，促进OPCs分化成熟是治疗脱髓鞘疾病促进再髓鞘化的关键。

莽草酸(shikimic acid，SA)主要来源于木兰科植物八角的果实，在中药中用于治疗胃痛、呕吐、抑郁症、失眠。莽草酸是合成神经氨酶抑制剂Oseltamivir的主要原料，而Oseltamivir可以用来治疗禽流感病毒中的H5N1、A/H1N1类病毒。此外莽草酸和它的衍生物异亚丙基莽草酸(3,4-Oxo-isopropylidene-shikimic acid，ISA)能通过抑制花生四烯酸代谢途径中COX-1、COX-2的活性，来抑制血小板聚集，治疗动、静脉血栓和脑血栓以及修复由此引发的局部缺血损伤。异丙基莽草酸通过抑制花生四烯酸代谢和κBα抑制剂和NF-kB p65蛋白的表达发挥抗氧化和抗炎作用，抑制了三硝基苯磺酸诱导的实验性大鼠结肠炎模型的氧化酶活性，从而减轻结肠组织的损伤。莽草酸还能降低脂多糖诱导的细胞促炎细胞因子的表达并减轻小鼠的机械性痛觉过敏。

目前，莽草酸在脱髓鞘疾病中的应用未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种莽草酸在制备预防或治疗脱髓鞘疾病药物中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明的第一方面，提供了一种莽草酸在制备预防或治疗脱髓鞘疾病药物中的应用。

所述预防或治疗脱髓鞘疾病药物是以莽草酸为唯一的活性成份，或包含莽草酸的药物组合物。

所述包含莽草酸的药物组合物是指莽草酸与药学上允许的一种或多种辅料构成的药物组合物。

所述脱髓鞘疾病药物中莽草酸的含量为0.1～99wt％。

所述辅料为稀释剂、赋形剂、香味剂、甜味剂中的至少一种。

所述莽草酸可以和药剂学上的常规药用辅料制成药物制剂。

所述药物制剂是胶囊剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂或注射剂中的至少一种。

所述药物制剂的给药方式为口服、注射。

所述脱髓鞘疾病药物为促进髓鞘再生的药物。

所述脱髓鞘疾病药物为促进少突胶质前体细胞的分化成熟或促进髓鞘相关蛋白表达的药物。

所述脱髓鞘疾病为多发性硬化症或阿尔兹海默症。

由于采用上述技术方案，本发明具有以下优点和有益效果：

本发明的莽草酸在制备预防或治疗脱髓鞘疾病药物中的应用，提供了莽草酸能够特异性地促进少突胶质前体细胞的分化成熟，不影响少突胶质前体细胞的增殖和迁移，能够治疗脱髓鞘疾病，解决脱髓鞘损伤后的髓鞘再生失败的问题。

本发明通过研究莽草酸在预防或治疗脱髓鞘疾病模型中的作用发现，莽草酸能缓解髓鞘少突胶质细胞糖蛋白诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠的病情，改善溶血卵磷脂诱导的局灶性小鼠脊髓脱髓鞘模型的脱髓鞘严重程度。莽草酸可以通过促进OPCs分化成为成熟的少突胶质细胞，从而加速髓鞘再生，减少脱髓鞘体积。以上均表明莽草酸对脱髓鞘疾病的临床治疗有巨大的应用前景。

附图说明

图1是莽草酸对OPCs分化的促进作用的示意图；其中，图1A是莽草酸的分子结构示意图；图1B是不同浓度的莽草酸对OPCs中MBP蛋白表达的作用示意图，actin是肌动蛋白，MBP是髓鞘碱性蛋白，Ctrl为对照组；图1C是100μg/ml的莽草酸对MBP⁺的少突胶质细胞的作用示意图，Ctrl为对照组，SA为莽草酸，T3为阳性对照药物，Hoechst为核染料，Merge为Hoechst与MBP合并；图1D是不同浓度的莽草酸作用下的OPCs中MBP蛋白的表达水平(relative MBP protein level)的统计图，图1E是100μg/ml的莽草酸与对照组的MBP⁺/Hoechst⁺比值(MBP⁺/Hoechst⁺cell)的统计图。

图2是莽草酸对OPCs的增殖和凋亡的作用示意图，其中，图2A是BrdU结合实验来研究莽草酸对OPCs的增殖作用示意图；图2B是TUNEL实验来研究莽草酸对OPCs凋亡的作用示意图；图2C是莽草酸与对照组的Brdu⁺/Hoechst⁺细胞比值的统计图；图2D是莽草酸与对照组的Tunel⁺/Hoechst⁺细胞比例的统计图；Ctrl为对照组，SA为莽草酸。

图3是EAE行为学评分统计结果示意图。其中，vehicle是腹腔注射的PBS对照组。

图4是莽草酸抑制中枢神经系统(CNS)的脱髓鞘与炎症的示意图，其中，图4A是不同剂量的莽草酸处理组的EAE小鼠CNS脊髓切片的Fluoromyelin染色示意图；图4B是不同剂量的莽草酸处理组的EAE小鼠CNS脊髓切片的快蓝染色的示意图，LFB是快蓝染料，即luxolfast blue；图4C是不同剂量的莽草酸处理组的脊髓切片的H&E染色的示意图；图4D是不同浓度的莽草酸处理组的CNS白质脱髓鞘面积比例的统计图，纵坐标为白质脱髓鞘比例(Demyelinated total WM(％))；图4E是不同浓度的莽草酸与每平方毫米浸润细胞数的统计图，纵坐标是每平方毫米浸润细胞数(Number of infiltrating cells/mm²)。

图5是莽草酸促进溶血卵磷脂诱导的脱髓鞘模型的髓鞘再生示意图；其中，图5A是溶血卵磷脂(LPC)模型示意图，lysolecithin是溶血卵磷脂；图5B是不同剂量的莽草酸处理组的LPC小鼠在7dpi和14dpi时的脊髓切片的Fluoromyelin染色示意图，vehicle是腹腔注射PBS的对照组；图5C是不同剂量的莽草酸处理组的LPC小鼠在7dpi和14dpi时的脊髓切片的快蓝染色示意图，图5D是LPC小鼠在7dpi和14dpi时的病变体积(图中纵坐标volumn ofLPC lesion)统计图。

图6是莽草酸促进OPCs分化的机制研究的示意图，其中，图6A是在OPCs中加入莽草酸与mTOR抑制剂Rap或Erk1/2的抑制剂U0126时，MBP蛋白表达的WB示意图，actin是肌动蛋白，MBP是髓鞘碱性蛋白，Control为对照组，SA是莽草酸组，SA+Rap是莽草酸与雷帕霉素组，Rap是雷帕霉素组，SA+U0126是莽草酸+抑制剂U0126组，U0126是抑制剂U0126组；图6B是图6A各处理组的MBP蛋白的表达水平的统计分析图；图6C是莽草酸、莽草酸与雷帕霉素、雷帕霉素作用下的OPCs中的MBP⁺细胞的免疫荧光示意图，Control为空白组，SA是莽草酸组，Rap是雷帕霉素组，SA+Rap是莽草酸与雷帕霉素组；图6D是图6C中各组的MBP⁺/Hoechst⁺的比值(MBP⁺/Hoechst⁺cells)的统计分析图；图6E是莽草酸对OPCs作用1h或2h后的p-mTOR与mTOR蛋白的WB示意图，SA是莽草酸组，Rap是雷帕霉素组，p-mTOR是磷酸化的mTOR蛋白，m-TOR是哺乳动物雷帕霉素靶蛋白，actin是肌动蛋白组；图6F是p-mTOR蛋白相对表达(relativelevel of p-mTOR)的统计分析图。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，物质的百分比和份数均按重量计算。

本实施例所用的莽草酸全部购自于Sigma公司。

实施例1

莽草酸(SA)对少突胶质前体细胞(OPCs)分化的促进作用。

一、实验方法：

为了研究证实莽草酸对OPCs分化的作用，利用qRT-PCR、Western blot、免疫细胞化学的方法分别从mRNA水平、蛋白水平和形态学水平证实莽草酸可以促进OPCs分化和成熟。

1.实验用细胞：原代培养的少突胶质前体细胞(OPCs)。

2.实验动物：本实验中所用Sprague-Dawley大鼠、C57BL/6J小鼠均购自上海西普尔必凯实验动物有限公司。

3.实验常用试剂和耗材：DMEM细胞培养液、Neurobasal/B27培养液，购自于美国Gibco公司；胎牛血清FBS购自于澳大利亚PAA公司；0.25％Trypsin胰酶、左旋多聚赖氨酸(poly-L-lysine,PLL)购自于美国Sigma公司。其他实验室常规试剂材料均购自于上海国药集团，细胞培养皿及板材购自于康宁公司。

4.实验用药物和抗体：

本发明药物：莽草酸(Sigma公司)

阴性对照药物：PBS

阳性对照药物：T3(Gibco公司)

Anti-MBP(Abcam公司)

Hoechst 33342(Sigma公司)

5.原代细胞培养：

(1)T75培养瓶提前一天在37℃过夜包被左旋多聚赖氨酸(Polylysine，PLL)，做原代前先用双蒸水清洗T75培养瓶2次后，置于超净台用风机吹干。

(2)无菌条件下从新生的SD大鼠分离出大脑，在解剖液中去除小脑和中脑，剥离出大脑皮层，并仔细剥去血管和软脑膜。

(3)将大脑皮层移入新的解剖液中，用眼科剪把大脑皮层脑组织剪碎，约至1mm×1mm大小的组织块。

(4)加入等体积的0.25％Trypsin胰酶后，置于37℃、5％CO₂的细胞孵箱中消化30分钟。

(5)加入含10％FBS的DMEM细胞培养液终止消化，移至无菌离心管中1000rpm，离心5min，弃上清液。

(6)加入含10％FBS的DMEM细胞培养液重悬，用玻璃吸管吹打数次(100下内)，使组织悬液分散，室温下静置5min。

(7)取悬液种于吹干的无菌T75培养瓶中，放在37℃、5％CO₂的细胞孵箱中培养。

(8)第二天换新鲜培养基，此后每3天更换一次新鲜培养液。

(9)培养至10天时可在摇床上摇下原代胶质细胞，先在37℃、180rpm摇1h，换新鲜的培养基，以除去小胶质细胞。

(10)在37℃摇床上以200rpm摇16h，收集细胞悬液种于未包被PLL的培养皿中贴壁30min，2次。

(11)吸取细胞上清液即为90％左右纯度的OPCs细胞悬液，按照5000～50000细胞/cm²种于提前涂布PLL的孔板中。

6.OPCs分化实验：

(1)细胞培养板与玻片提前包被PLL，清洗后吹干。

(2)将OPC按照5000-50000cells/cm²密度种植到玻片或者培养板中，在37℃、5％CO₂的孵箱中培养6h。

(3)待OPCs完全贴壁后，将培养基更换成含有2％B27培养液的Neurobasal分化培养基。在研究莽草酸对OPCs分化的影响实验时，更换培养基后立即加入莽草酸，阳性对照加入40ng/ml的T3，阴性对照加入磷酸盐缓冲液(PBS)。

7.蛋白印迹分析：

不同处理组的OPCs在分化培养基中培养3天后，冷的PBS润洗2遍后加入细胞裂解液PIPA(PMSF)，在冰上进行裂解10min。收集细胞裂解液，置于4℃摇床上震荡30min后，在低温离心机中12000rpm离心12分钟。吸取蛋白上清液加入5xloading buffer上样缓冲液后，100℃加热10min。

MBP在12％的SDS-PAGE中分离。电泳上样时，分别加入蛋白marker与适量的样品上样液，先在80V电压下，电泳30min左右，当蛋白marker分离出红色条带后，就可以把电泳仪电压调至120V进行电泳约60min，loading buffer会跑掉，密切关注电泳情况，直至跑到相应位置就关掉电泳机器。

电泳完成后，用20％甲醇的转膜液300mA转膜90min。用10％牛奶封闭2小时后，加入一抗4℃过夜孵育。然后，TBST洗膜3次，每次5分钟，加入HRP偶联的二抗室温孵育2h。TBST洗膜3次，每次10分钟。最后用化学发光试剂ECL液用image-Lab进行图像分析。

8.免疫荧光实验：

细胞玻片首先用PBS清洗两遍后，用4％的多聚甲醛在室温下固定15min，用PBS清洗3次，每次5分钟，用0.3％的Triton X-100打孔15min，PBS清洗后，加入一抗MBP，4℃孵育过夜。一抗孵育完成后，用PBS缓冲液清洗5min，重复三次后，加入一抗来源的二抗，室温下避光孵育1h，然后用PBS清洗3×5min，染核Hoechst33342十分钟，50％甘油封片，最后在连有CCD的电脑控制的荧光显微镜(DXM1200，Nikon)下观察拍照，并用专业软件image-proPLUS(Media cybernetics)进行图像分析。

二、实验结果：

如图1所示，图1是莽草酸对OPCs分化的促进作用的示意图；其中，图1A是莽草酸的分子结构示意图；图1B是不同浓度的莽草酸对OPCs中MBP蛋白表达的作用示意图，actin是肌动蛋白，MBP是髓鞘碱性蛋白，Ctrl为对照组；图1C是100μg/ml的莽草酸对MBP⁺的少突胶质细胞的作用示意图，Ctrl为对照组，SA为莽草酸，T3为阳性对照药物，Hoechst为核染料，Merge为Hoechst与MBP合并；图1D是不同浓度的莽草酸作用下的OPCs中MBP蛋白的表达水平(relative MBP protein level)的统计图，图1E是100μg/ml的莽草酸与对照组的MBP⁺/Hoechst⁺比值(MBP⁺/Hoechst+cell)的统计图。图1B、D说明不同浓度的莽草酸均可以促进体外原代培养的OPCs分化成熟，其表达的成熟少突胶质细胞的髓鞘相关蛋白(MBP)水平升高，并呈现出一定的剂量依赖性，且在100μg/ml时效果最好(如图1B和图1C所示)；图1C、E说明100μg/ml的莽草酸可以明显增加MBP阳性成熟少突胶质细胞数目的比例。由此得出结论：莽草酸可以促进OPCs分化成熟。

实施例2

莽草酸不影响体外培养的OPCs的增殖和凋亡

一、实验方法：

为了验证莽草酸在促进OPCs分化的同时不会影响细胞的其他变化，分别用了BrdU结合实验和TUNEL实验研究细胞的增殖和凋亡，从两个指标反映药物对细胞的影响。

1.实验用细胞：原代培养的少突胶质前体细胞(OPCs)。

2.实验试剂、耗材和仪器：DMEM培养液、Neurobasal/B27购自于美国Gibco公司；胎牛血清FBS购自于澳大利亚PAA公司；0.25％Trypsin胰酶、左旋多聚赖氨酸(poly-L-lysine,PLL)购自于美国Sigma公司。其他实验室常规试剂材料均购自于上海国药集团，细胞培养皿及板材购自于康宁公司。

3.实验用药：

本发明药物：莽草酸(Sigma-Aldrich公司)

阴性对照药物：PBS

4.细胞增殖实验：

Brdu中文名为5-溴脱氧尿嘧啶核苷，可以代替细胞增殖期的胸腺嘧啶，因此可以标记增殖的细胞。在OPCs培养过程中，莽草酸在OPCs种植贴壁4-6h后换成NB培养基时加入。细胞玻片在孵箱中培养48h后收集进行免疫组化染色，收集前6h加入Brdu(1:1000)。收集时，先弃掉培液，经PBS清洗后，4％PFA固定约20min。固定后用PBS清洗5分钟，清洗3次。0.3％Triton打孔10min，用PBS清洗3次后，加入2N HCl 37℃处理30min进行变性处理，暴露抗原。然后用0.1mol/L的硼氢化钠溶液中和20分钟，分为两次，然后用PBS润洗5分钟，3次。5％的BSA封闭30min后，细胞玻片放在湿盒中，进行Brdu一抗染色，4度避光孵育过夜。PBS润洗3次玻片，每次5min，然后用TRITC偶联IgG二抗与Hoechst室温孵育一小时，PBS润洗三次。玻片风干后，甘油封片。

5.细胞凋亡实验：

细胞玻片弃掉培液后，用PBS清洗。然后用4％PFA进行固定20min。PBS清洗残留的固定液3次后，0.1％Triton打孔15min。打孔后再用PBS清洗5min×3次，然后用5％BSA封闭20min。最后用凋亡试剂盒In Situ Cell Death Detection Kit(Roche)染色。

实验结果：

如图2所示，图2是莽草酸对OPCs的增殖和凋亡的作用示意图，其中，图2A是BrdU结合实验来研究莽草酸对OPCs的增殖作用示意图；图2B是TUNEL实验来研究莽草酸对OPCs凋亡的作用示意图；图2C是莽草酸与对照组的Brdu⁺/Hoechst⁺细胞比值的统计图；图2D是莽草酸与对照组的Tunel⁺/Hoechst⁺细胞比例的统计图；Ctrl为对照组，SA为莽草酸。莽草酸处理组和对照组BrdU阳性的细胞比值无明显差异(如图2A所示)，TUNEL阳性的细胞比例也无明显差异(如图2B所示)。图2C、2D得出莽草酸既不影响OPCs的增殖，也不影响OPCs的凋亡。由此得出结论：莽草酸能够特异性地促进OPCs分化，不影响细胞的增殖和凋亡。

实施例3

莽草酸减轻EAE小鼠的病情

一、实验方法：

为了进一步验证莽草酸对于脱髓鞘疾病的治疗作用，采用MOG_33-55诱导的EAE小鼠模型，并采取治疗性给药方式，在造模后第15天开始腹腔给药，每天一次。造模后每天观察小鼠情况直至造模后25天。

1.实验用动物：C57BL/6J成年雌性小鼠购自于上海斯莱克公司。所有动物实验操作都符合中国人民解放军海军军医大学动物管理委员会实验动物管理条令和伦理要求。

2.实验试剂：MOG_35-55(GL Biochem公司)，MTB(H37Ra strain；Difco公司)，IFA(Incomplete Freund’s adjuvant；Sigma-Aldrich公司)，PTX(pertussis toxin；Difcolaboratories公司)。

3.实验用药：

本发明药物：莽草酸(Sigma-Aldrich公司)

阴性对照药物：PBS

4.动物实验EAE的诱导

MOG_35–55(吉尔生化，051716)

热灭活的结合菌素(MTB，Difco，231141)

不完全弗氏佐剂(CFA，Sigma-Aldrich，F5506)

百日咳毒素(Pertussis toxin，PTX，Calbiochem，516562)

首先，称取适量的MTB于冰上的EP管中，并逐渐滴加IFA，在超声下溶解为A液。再称取适量的MOG_35–55溶于PBS，使浓度为2mg/ml，为B液，放置于冰上。A液、B液以1:1的比例混合配成最终溶液。MOG的最终浓度为1mg/ml。MTB的最终浓度为4-5mg/ml。混合A液、B液用玻璃注射器分别吸取A液、B液，然后连接三通管，在冰上通过不断推动两支注射管来混合A液、B液。直至推动突然阻力增大，难以推动为止，即可用来注射造模。

造模时，先剃去小鼠臀部鼠毛，酒精消毒后，用1ml注射器在其臀部分三点皮下注射0.2ml的药物。造模当日为D0，D0与D2分别给每只小鼠腹腔注射0.2ml的百日咳毒素溶液(用PBS溶解200ng百日咳毒素，配成浓度为1ug/ml的液体)。造模后EAE小鼠一般在10-12天开始出现病症，在第10天进行双盲评分，评评分标准如下：0分：小鼠未发病；0.5分：小鼠尾尖无力，下垂；1分：小鼠全尾无力；1.5分：小鼠臀部有着地倾向，行走时尾部摇摆；2分：小鼠臀部坐地行走；2.5分：小鼠臀部坐地，且一条后肢瘫痪；3分：小鼠臀部坐地行走，两条后肢瘫痪；3.5分：小鼠臀部坐地，两条后肢与一条前肢均瘫痪；4分：小鼠臀部坐地，两条后肢与两条前肢均瘫痪；5分：小鼠死亡。

二、实验结果

如图3所示，图3是EAE行为学评分统计结果示意图。EAE行为学评分统计结果表明，在100mg/kg和200mg/kg的莽草酸药物治疗组，动物均表现出明显的行为学改善。而50mg/kg的莽草酸药物治疗组的效果不明显。结论：莽草酸对于EAE小鼠的病情具有改善作用。

实施例4

莽草酸抑制中枢神经系统(CNS)的脱髓鞘与炎症

一、实验方法：

为了研究莽草酸对EAE小鼠CNS炎症浸润情况与脱髓鞘情况的影响。利用Fluoromyelin染色与LFB染色来观察脱髓鞘情况，利用H&E染色技术来观察炎症浸润情况。

1.实验用药：

本发明药物：莽草酸(Sigma-Aldrich公司)

阴性对照药物：PBS

2.快蓝染色

冰冻切片先进行室温复温处理，石蜡切片先进行脱蜡处理，再进行快蓝染色。切片先在无水乙醇中预平衡5min，再放入盛有0.1％的LFB染液缸中，于57℃水浴锅中过夜处理14h。然后从快蓝染液中取出的切片先在95％乙醇中浸泡5min，洗去多余的快蓝染液。后进行脱色处理：0.05％的Li₂CO₃分化30s，70％乙醇分化30s，蒸馏水浸泡。脱色处理步骤可多次重复直至脊髓的白质灰质界限分明，脱髓鞘与未脱髓鞘部位区分明显。脱色操作及时在显微镜下观察脱色情况。然后，组织切片逐次在70％、85％、95％、100％浓度梯度的酒精中进行脱水处理，再用二甲苯透明，最后用中性树脂封片。

3.苏木精-伊红染色(H&E染色)

3.1冰冻切片先进行室温放置复温，石蜡切片先进行脱蜡处理。

3.2组织切片放入苏木素染液中染核3-5min，若室温较低，可适当延长染色时间，然后自来水洗3-5min。

3.3组织切片用1％的盐酸酒精处理30秒。

3.4把组织切片放入1％的氨水溶液的染缸中返蓝30秒。

3.5组织切片放入伊红染液浸染2-3min。

3.6脱水处理：组织切片依次进行无水乙醇5min×2次，二甲苯5min×2次，风干后用中性树脂封片。

二、实验结果：

如图4所示，图4是莽草酸抑制中枢神经系统(CNS)的脱髓鞘与炎症的示意图，其中，图4A是不同剂量的莽草酸处理组的EAE小鼠CNS脊髓切片的Fluoromyelin染色示意图；图4B是不同剂量的莽草酸处理组的EAE小鼠CNS脊髓切片的快蓝染色的示意图，LFB是快蓝染料，即luxol fast blue；图4C是不同剂量的莽草酸处理组的脊髓切片的H&E染色的示意图；图4D是不同浓度的莽草酸处理组的CNS白质脱髓鞘面积比例的统计图，纵坐标为白质脱髓鞘比例(Demyelinated total WM(％))；图4E是不同浓度的莽草酸与每平方毫米浸润细胞数的统计图，纵坐标是每平方毫米浸润细胞数(Number of infiltrating cells/mm²)。结果显示，100mg/kg与200mg/kg剂量的莽草酸与对照组小鼠相比，脱髓鞘程度变小，炎症细胞浸润也降低。而50mg/kg的莽草酸与对照组相比，无明显差异。综上所述，莽草酸可以显著抑制EAE小鼠的脱髓鞘程度与炎症细胞浸润。

实施例5

莽草酸促进溶血卵磷脂诱导的脱髓鞘模型的髓鞘再生

一、实验方法：

为了排除免疫反应对髓鞘再生的影响，采用LPC诱导的局灶性脱髓鞘模型研究松属素对体内髓鞘再生的作用，在造模后第3天给予药物和空白溶剂处理，在第7天和第14天时，行Fluoromyelin与LFB染色观察背侧白质区脱髓鞘病灶体积。

1.实验动物：C57BL/6J成年小鼠购自于上海斯莱克公司。所有动物实验操作都符合中国人民解放军海军军医大学动物管理委员会实验动物管理条令和伦理要求。

2.实验试剂、耗材和仪器：溶血卵磷脂(LPC；Lysophosphatidylcholine；SigmaAldrich公司)，2.5μl显微注射器，立体定位仪。

3.实验用药：

本发明药物：莽草酸(Sigma-Aldrich公司)

阴性对照药物：PBS

4.LPC模型：

8-10周的雌性C57小鼠腹腔注射3.6％的水合氯醛，数分钟后用镊子夹其后肢观察麻醉效果，至后肢无反应即可开始手术。用刮毛器刮除小鼠背部鼠毛，剪开背部皮肤，剥开肌肉，椎板术剔除T10-T11节段的骨骼组织，暴露出脊髓，可明显看到脊髓中央大血管。微量注射器吸取1％的LPC(溶于0.9％生理盐水)1μl，固定在立体定位仪上。微量注射器针头正对小鼠脊髓背部中央血管，垂直进针约1mm深。在5分钟内缓慢地把LPC注射到小鼠脊髓中，然后静置3分钟后慢慢拔出注射器。最后使用缝合针缝合小鼠皮肤。LPC注射当天为0dpi，收集7dpi和14dpi的小鼠脊髓进行切片观察。

5.组织切片技术

按照10μl/g的剂量对小鼠进行腹腔注射3.6％的水合氯醛。小鼠麻醉之后，固定其四肢，腹部朝上。剪刀从腹部切入，向上剪开胸腔，暴露出心脏后止血钳固定住胸腔肌肉组织。静脉采血针插入左心室(针尖插入，勿深插)，剪开右心耳。先用20ml左右的0.01M的PBS进行灌流，冲净血液至液体近无色，小鼠舌头与肝脏均发白，然后换成4％PFA进行灌流20ml，此时可见小鼠四肢抽搐、尾巴颤动、身体抖动并逐渐变僵硬。然后取出小鼠的脊柱放到4％PFA中过夜进行后固定。后固定完成后，剥去外部骨骼，脊髓在吸水纸上吸干后放入20％的蔗糖中进行脱水。待脊髓脱水完成即沉底后，倒掉蔗糖溶液，换成新的30％的蔗糖再次脱水。待脊髓再次沉底后，即为脱水完成。包埋时，先吸干脊髓外面沾的蔗糖，然后包埋剂浸湿脊髓。随后把脊髓放入包埋剂中，在-80℃冰箱中冻存。

冷冻切片机先预冷，切片机小室降温后，再进行刀头降温。降温完成后，小鼠脊髓固定到底座上。先用刀片快切，切出顶部的包埋剂，至脊髓到腰膨大位置时，把切片厚度调为14μm，可进行连续切片。在处理LPC模型样品时，当切到脊髓时，要进行连续切片，并立即在白光显微镜下观察脊髓脱髓鞘病灶的情况。当脱髓鞘出现时，准备玻片贴片，14μm连续切片10片为1组，分别贴到1-6号载玻片上，剩余四片弃掉，第11-16片贴于第1-6号载玻片上。以此进行连续切片，直到脱髓鞘病灶切完。冰冻切片要在37℃烘烤1h，然后放入-20℃进行冷藏。

二、实验结果：

如图5所示，图5是莽草酸促进溶血卵磷脂诱导的脱髓鞘模型的髓鞘再生示意图；其中，图5A是溶血卵磷脂(LPC)模型示意图，lysolecithin是溶血卵磷脂；图5B是不同剂量的莽草酸处理组的LPC小鼠在7dpi和14dpi时的脊髓切片的Fluoromyelin染色示意图，vehicle是腹腔注射PBS的对照组；图5C是不同剂量的莽草酸处理组的LPC小鼠在7dpi和14dpi时的脊髓切片的快蓝染色示意图，图5D是LPC小鼠在7dpi和14dpi时的病变体积(图中纵坐标volumn of LPC lesion)统计图。结果证实，在LPC诱导的脱髓鞘模型中，根据LFB染色结果，损伤后第7天治疗组小鼠脊髓背侧白质区脱髓鞘病灶体积与对照组相比，无明显差异。而在第14天时，100mg/kg与200mg/kg的莽草酸作用组小鼠比对照组小鼠的脱髓鞘体积减小明显(如图5B和图5C所示)，而50mg/kg的莽草酸与对照组相比无明显差异。我们得出结论：100mg/kg与200mg/kg的莽草酸均能促进LPC小鼠的髓鞘再生进程。

实施例6

莽草酸促进OPCs分化的机制研究

一、实验方法：

已知m-TOR与Erk1/2信号通路都在OPCs分化中发挥作用。为了确定莽草酸的作用机制，首先在体外培养的OPCs中加入莽草酸、莽草酸与m-TOR、Erk1/2抑制剂，通过WB方法检测两条通路对MBP蛋白的作用。再次检测蛋白的磷酸化是否由莽草酸的激活引发的。

1.实验用细胞：原代培养的少突胶质前体细胞(OPCs)。

2.实验常用试剂和耗材：DMEM细胞培养液、Neurobasal/B27培养液，购自于美国Gibco公司；胎牛血清FBS购自于澳大利亚PAA公司；0.25％Trypsin胰酶、左旋多聚赖氨酸(poly-L-lysine,PLL)购自于美国Sigma公司。其他实验室常规试剂材料均购自于上海国药集团，细胞培养皿及板材购自于康宁公司。

3.实验用药物和抗体：

本发明药物：莽草酸(Sigma-Aldrich公司)

阴性对照药物：PBS

Anti-m-TOR(CST公司)

Anti-Pho-mTOR(CST公司)

4.免疫印迹分析

样品收集：将OPCs按照一定时间培养完成后，先吸掉培液，用PBS润洗5分钟，润洗两次。吸掉PBS后，加入RIPA裂解液(PMSF)放在冰上进行裂解10min。裂解完成后，收集细胞裂解液至EP管中。将EP管放在4℃摇床上振摇裂解15min后，在4℃低温离心机中12000rpm离心15min，至管底有沉淀析出。吸取蛋白上清移入新的EP管中，加入适量5xloading buffer。混匀后，在100℃加热10min，最后置于-20℃冰箱保存。

SDS-PAGE:髓鞘碱性蛋白MBP在12％的SDS-PAGE中分离，m-TOR蛋白在10％的SDS-PAGE中分离。m-TOR与p-mTOR在10％的胶中分离。电泳上样时，分别加入蛋白marker与适量的样品上样液，先在80V电压下，电泳30min左右，当蛋白marker分离出红色条带后，就可以把电泳仪电压调至120V进行电泳约60min，loading buffer会跑掉，密切关注电泳情况，直至跑到相应位置就关掉电泳机器。

转膜时根据蛋白分子量设置相应的转膜时间，MBP蛋白在300mA转膜90min，m-TOR与p-mTOR蛋白在300mA电流下转膜约180min。转膜完毕后，硝酸纤维素膜用丽春红进行显色处理后，用TBST清洗干净，然在室温下将膜放入10％的牛奶中2小时封闭杂蛋白。封闭完成后，用TBST洗膜5min，将一抗加到膜上，4℃孵育过夜。一抗用TBST按相应比例配制，一抗孵育完成后，将膜移至室温下，用TBST清洗一抗5min，重复清洗3次。然后将HRP偶联的二抗用TBST稀释后，加到膜上室温孵育2h。二抗孵育过后，用TBST洗膜10分钟，重复清洗3次。最后将化学发光试剂ECL液加到膜上，在BIO-RAD仪器上的Image-Lab软件中进行显影拍照以及分析。

5.免疫荧光实验：

细胞玻片首先用PBS清洗两遍后，用4％的多聚甲醛在室温下固定15min，用PBS清洗3次，每次5分钟，用0.3％的Triton X-100打孔15min，PBS清洗后，加入一抗MBP，4℃孵育过夜。一抗孵育完成后，用PBS缓冲液清洗5min，重复三次后，加入一抗来源的二抗，室温下避光孵育1h，然后用PBS清洗3×5min，染核Hoechst33342十分钟，50％甘油封片，最后在连有CCD的电脑控制的荧光显微镜(DXM1200，Nikon)下观察拍照，并用专业软件image-proPLUS(Media cybernetics)进行图像分析。

二、实验结果：

如图6所示，图6是莽草酸促进OPCs分化的机制研究的示意图，其中，图6A是在OPCs中加入莽草酸与mTOR抑制剂Rap或Erk1/2的抑制剂U0126时，MBP蛋白表达的WB示意图，actin是肌动蛋白，MBP是髓鞘碱性蛋白，Control为对照组，SA是莽草酸组，SA+Rap是莽草酸与雷帕霉素组，Rap是雷帕霉素组，SA+U0126是莽草酸+抑制剂U0126组，U0126是抑制剂U0126组；图6B是图6A各处理组的MBP蛋白的表达水平的统计分析图；图6C是莽草酸、莽草酸与雷帕霉素、雷帕霉素作用下的OPCs中的MBP⁺细胞的免疫荧光示意图，Control为空白组，SA是莽草酸组，Rap是雷帕霉素组，SA+Rap是莽草酸与雷帕霉素组；图6D是图6C中各组的MBP⁺/Hoechst⁺的比值(MBP⁺/Hoechst⁺cells)的统计分析图；图6E是莽草酸对OPCs作用1h或2h后的p-mTOR与mTOR蛋白的WB示意图，SA是莽草酸组，Rap是雷帕霉素组，p-mTOR是磷酸化的mTOR蛋白，m-TOR是哺乳动物雷帕霉素靶蛋白，actin是肌动蛋白组；图6F是p-mTOR蛋白相对表达(relative level of p-mTOR)的统计分析图。图A、B表明莽草酸对MBP的上调作用可以被m-TOR的抑制剂雷帕霉素所抑制，但是却不能被Erk上游分子MEK的抑制剂U0126所抑制；图C、D说明莽草酸对MBP⁺成熟少突胶质细胞量的上调作用可以被m-TOR的抑制剂雷帕霉素所抑制。图E、F说明OPCs在莽草酸作用1h与2h后，p-m-TOR表达水平均上调，但是总的m-TOR蛋白的表达水平不变。得出结论：莽草酸通过m-TOR通路来发挥对OPCs分化的促进作用。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims (10)

1.莽草酸在制备预防或治疗脱髓鞘疾病药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的莽草酸在制备预防或治疗脱髓鞘疾病药物中的应用，其特征在于：所述预防或治疗脱髓鞘疾病药物是以莽草酸为唯一的活性成份，或包含莽草酸的药物组合物。

3.根据权利要求1所述的莽草酸在制备预防或治疗脱髓鞘疾病药物中的应用，其特征在于：所述包含莽草酸的药物组合物是指莽草酸与药学上允许的一种或多种辅料构成的药物组合物。

4.根据权利要求1所述的莽草酸在制备预防或治疗脱髓鞘疾病药物中的应用，其特征在于：所述脱髓鞘疾病药物中莽草酸的含量为0.1～99wt％。

5.根据权利要求1所述的莽草酸在制备预防或治疗脱髓鞘疾病药物中的应用，其特征在于：所述辅料为稀释剂、赋形剂、香味剂、甜味剂中的至少一种。

6.根据权利要求1所述的莽草酸在制备预防或治疗脱髓鞘疾病药物中的应用，其特征在于：所述莽草酸可以和药剂学上的常规药用辅料制成药物制剂。

7.根据权利要求1所述的莽草酸在制备预防或治疗脱髓鞘疾病药物中的应用，其特征在于：所述药物制剂是胶囊剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂或注射剂中的至少一种。

8.根据权利要求1所述的莽草酸在制备预防或治疗脱髓鞘疾病药物中的应用，其特征在于：所述药物制剂的给药方式为口服、注射。

9.根据权利要求1所述的莽草酸在制备预防或治疗脱髓鞘疾病药物中的应用，其特征在于：所述脱髓鞘疾病药物为促进髓鞘再生的药物。

10.根据权利要求1所述的莽草酸在制备预防或治疗脱髓鞘疾病药物中的应用，其特征在于：所述脱髓鞘疾病药物为促进少突胶质前体细胞的分化成熟或促进髓鞘相关蛋白表达的药物；所述脱髓鞘疾病为多发性硬化症或阿尔兹海默症。