CN107890469A - 一种抗脑缺血再灌注损伤的天然药物活性成分组合物及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗脑缺血再灌注损伤的天然药物活性成分组合物及其提取方法与应用，该天然药物活性组分包括3,4,5‑三羟基苯甲醛、特马里素Ⅱ、木麻黄鞣宁。提取时，取民族药蓝布正干燥全草，切碎，加入甲醇或乙醇溶液，采用回流或浸渍提取的方式进行多次提取，过滤，合并滤液，进行减压浓缩，回收甲醇或乙醇，即可为得到活性成分的组合物。该活性成分组合物的制备方法简单，能够减轻脑缺血再灌注损伤引起的细胞凋亡程度，恢复大脑功能，开发前景可观。

Description

一种抗脑缺血再灌注损伤的天然药物活性成分组合物及其制 备方法与应用

技术领域

本发明涉及中药技术领域，具体涉及一种用于防治脑缺血再灌注损伤的天然药物活性成分组合物及其制备方法与应用。

背景技术

近年来，中风已成为世界上导致人类死亡及成年人残疾的重要病因，其中急性缺血性中风约占全部中风类型的60％-80％左右。目前，恢复血流为临床治疗急性缺血性中风的主要方法，如rTPA溶栓治疗等，这种通过恢复缺血区的血流灌注减轻缺血部位的损伤；然而，血流的突然恢复又可能会造成缺血区的二次损伤——缺血再灌注损伤。缺血再灌注损伤是一种常见、复杂的病理生理过程，其主要会导致细胞凋亡。细胞凋亡是指在一定的生理和病理条件下，机体为了维护内外环境的稳定，通过多基因的调控使细胞主动死亡的过程，属于一种生理性的细胞死亡。因此，减轻或抑制细胞凋亡是治疗脑缺血再灌注损伤的重要途径之一。磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt,phosphoinositide3kinase/Akt)信号转导途径是一个经典抗凋亡、促存活的信号转导途径；它的激活在神经细胞，尤其在缺血缺氧神经元损伤中起着重要作用。若某种药物能够影响此条通路中蛋白的表达，则可能减轻细胞凋亡程度，进而抗脑缺血再灌注损伤。

蓝布正为蔷薇科植物路边青(GeumaleppicumJacq)或柔毛路边青(GeumjaponicumThu nb.var.chinenseBolle)的干燥全草，在民间，蓝布正(柔毛路边青)与其原变种日本路边青(GeumjaponicumThunb.)，因形态相似，性味功效相同，又名追风七、五气朝阳草、红心草、路边黄、见肿消，以及水杨梅等。蓝布正味甘微苦，性微寒，民间多用于治疗头痛头晕、小儿惊风、高血压、腰腿疼痛和月经不调等。目前关于其有效成分的研究较少，对其主要活性成分的药理作用知之甚少。

发明内容

本发明的目的提供一种抗脑缺血再灌注损伤的天然药物活性成分组合物及其制备方法与应用，首次从蓝布正中提取并鉴定了三种有效成分，并观察研究了该活性成分对脑缺血再灌注损伤的作用。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种治疗脑缺血再灌注损伤的天然药物活性成分组合物，此活性成分组合物包括：3,4,5-三羟基苯甲醛、特马里素Ⅱ和木麻黄鞣宁。其分子式如下：

三种成分的鉴定方法如下：取适量活性成分样本用一次性注射过滤器过滤，加入进样小瓶中，4℃保存，待进样。进样前，用注射泵注入质谱中，利用4500QTRAP采用MIM-IDA-EPI模式进行分析，MIM模式进行离子筛选后，IDA触发线性离子阱进行碎片化，通过对碎片离子以及三种化合物的结构特征进行分析，确定样本中是否含有此三种物质。

本发明还涉及提取所述蓝布正活性成分的方法，包括以下步骤：

取蓝布正干燥全草，切碎，加入甲醇或70％的乙醇溶液，采用回流或浸渍提取的方式进行多次提取，过滤，合并滤液，进行减压浓缩，回收甲醇或乙醇，即可得到活性成分组合物。

进一步地，采用甲醇进行提取时，甲醇的加入量为蓝布正质量的10倍，采用室温浸渍方式进行提取，共提取3次，每次浸渍提取时间为5-7天。

进一步优选地，采用乙醇溶液进行提取时，乙醇溶液的加入量为蓝布正质量的10倍，在60℃进行回流提取，共提取3次，每次时间为1.5-2h。

本发明还涉及一种药物组合物，其为含有上述天然药物活性成分组合物的药学上可接受的载体。

进一步地，所述药学上可接受的载体为颗粒剂、丸剂、片剂、胶囊、干糖浆或冻干粉针。

本发明还涉及天然药物活性成分组合物在制备减轻脑缺血再灌注损伤药物中的应用。

本发明还涉及天然药物活性成分组合物在制备经PI3K/Akt通路抑制受损脑细胞凋亡以减轻脑缺血再灌注损伤药物中的应用。

目前，相关临床或已公开专利中蓝布正多作为治疗脑损伤类疾病复方制剂中的一味药使用，而其作为单味药物或提取其活性成分组合物使用的案例较少。本发明提供的该活性成分的制备方法简单，可长期使用，开发前景可观。

附图说明

图1是实施例3中3,4,5-三羟基苯甲醛的MRM图谱。

图2是实施例3中3,4,5-三羟基苯甲醛的EPI图谱。

图3是实施例3中特马里素Ⅱ的MRM图谱。

图4是实施例3中特马里素Ⅱ的EPI图谱。

图5是实施例3中木麻黄鞣宁的MRM图谱。

图6是实施例3中木麻黄鞣宁的EPI图谱。

图7是实施例4中PI3K和p-Akt的Western blotting蛋白表达情况；图中A为四个分组(Sham假手术组、I/R模型组、GJ-H蓝布正高剂量组、GJ-L蓝布正低剂量组)PI3K的表达条带，图B为其蛋白表达量的统计学分析，图C为p-Akt的表达条带，图D为p-Akt的蛋白表达量统计学分析。

图8是实施例4中利用免疫组织化学法测定的Bcl-2，Bax和cleaved caspase-3的阳性细胞表达情况。其中图A为Bcl-2，Bax和cleaved caspase-3的阳性细胞表达情况，图B、C、D分别为Bcl-2，Bax和cleaved caspase-3阳性细胞表达量的统计学分析。

图9是实施例4中利用Western blotting测定的Bcl-2，Bax和cleaved caspase-3的蛋白表达情况。其中：图A为Bcl-2的蛋白表达条带，图B为其蛋白表达量的统计学分析；图C为Bax的蛋白表达条带，图D为其蛋白表达量的统计学分析；图E为Bcl-2/Bax的比值分析；图F为caspase-3及cleaved caspase-3的蛋白表达条带，主要对cleaved caspase-3进行分析，图G为对cleaved caspase-3蛋白表达量的统计学分析。

具体实施方式

下面结合实施例来进一步说明本发明，但本发明要求保护的范围并不局限于实施例表述的范围。

实施例1：取蓝布正饮片，加入10倍量70％体积浓度的乙醇加热回流提取3次，每次1.5小时，过滤，合并滤液，滤液减压浓缩，得蓝布正活性成分。收率为10％-12％。

实施例2：取蓝布正饮片，加入10倍量甲醇在室温浸渍提取3次，每次6天，过滤，合并三次滤液，减压浓缩，回收甲醇，得蓝布正活性成分。收率为11％-14％。

实施例3：用LC-MS/QTRAP法定性检测蓝布正组合物中三种活性成分的含量

实验方法：本次实验利用4500QTRAP采用MIM-IDA-EPI模式进行分析，MIM模式进行离子筛选后，IDA触发线性离子阱进行碎片化，通过对碎片离子以及三种化合物的结构特征进行分析，可大致确定是否含有三种物质。测试结果显示组合物中极有可能含有3,4,5-三羟基苯甲醛、特马里素Ⅱ、木麻黄鞣宁。

该实验检测体系为：

液相条件——流动相A：去离子水；流动相B：100％甲醇；清洗液：100％甲醇；色谱柱温度：40度；进样量：10uL，流速：1.0mL/min；起始梯度：10％B；

质谱条件——MIN(MRM)如表1所示：

表1

质谱参数CUR:30.00，CAD:-2.00，TEM:550.00，GS1:60.00，GS2:60.00，IS:-4000.00，EP：-10.00，CXP-10.00；

EPI参数CUR:30.00，CAD:-2.00，TEM:550.00，GS1:60.00，GS2:60.00，IS:-4000.00，DP:-80.00，EP:-10.00，CE:-30.00，CES:10.00。

取适量组合物样本用一次性注射过滤器过滤，加入进样小瓶中，4℃保存，待进样。进样前，用注射泵注入质谱中，Q1SCAN负模式扫描，初步观察是否有目标离子峰出现，然后按上述方法进样，并分析结果。

实验结果见图1-图6，其中图1、图2为3,4,5-三羟基苯甲醛特征图谱，图3和图4为特马里素Ⅱ特征图谱，图5和图6为木麻黄鞣宁特征图谱。根据图谱特征峰，分析发现蓝布正活性成分中存在3,4,5-三羟基苯甲醛、特马里素Ⅱ、木麻黄鞣宁。如：将图1和图2的结果结合分析，图2中的碎片分子量包含3,4,5-三羟基苯甲醛的特征离子碎片，且图1中发现3,4,5-三羟基苯甲醛的特征峰，因此我们断定该混合物中存在3,4,5-三羟基苯甲醛；同理可得该活性成分组合物中存在3,4,5-三羟基苯甲醛、特马里素Ⅱ、木麻黄鞣宁。

实施例4：

蓝布正活性成分组合物通过PI3K/Akt通路抑制脑缺血再灌注损伤大鼠受损细胞的凋亡试验

实验方法：取雄性SD大鼠60只，体重180-220g，随机分为假手术组(等体积生理盐水)、模型组(等体积生理盐水)、蓝布正活性成分组合物高剂量组(下称蓝布正高剂量组)(7.00g/kg)、蓝布正活性成分组合物低剂量组(下称蓝布正低剂量组)(1.75g/kg)，每组15只。各组动物按各自剂量和药物灌胃给药，连续给药7天。末次给药后1小时，模型组和药物组按照线栓法制备大鼠大脑中动脉栓塞模型，记录插入线栓时间，1.5小时后拔出线栓，再灌24小时后进行神经功能评分；随后用水合氯醛麻醉，各组选取适量动物断头取脑，进行TTC染色；各组再选取适量动物心脏灌注4％多聚甲醛固定，取脑后在液氮中速冻，储存在-80℃冰箱备用，随后进行尼氏染色、TUNEL染色、免疫荧光、Western Blotting、免疫组织化学等相应的检测。具体方法如下所示：

1.神经功能评分(Zea-Longa法)

按照Zea-Longa标准评分法对大鼠进行神经功能评分，评分等级为0-4分，分值越离，神经功能损伤越严重。具体标准如下：

活动正常，提尾时两前爪伸向地面，无任何神经缺损症状——0分；

提尾时左侧前爪不能完全伸展，且不伴其他不正常行为——1分；

提尾时左前肢屈曲内收，爬行时自发向左侧转圈——2分；

站立不稳，行走时向偏擁侧跌倒——3分；

有意识障碍，不能自发走——4分。

评分均在1-3分者为造模成功，评分为0分、4分以及生命体征不平稳的动物弃之不用。

2.TTC染色

TTC是能与组织中脱氨酶反应的脂溶性光敏感复合物，可通过染色检测动物组织中缺血便死灶大小。经TTC染色，正常脑组织呈玫瑰红色，缺血梗死灶脱氨酶活性低，呈白色。麻醉后直接取脑，应仔细保持大脑的完整性。将脑在-20度冰箱中速冻20分钟左右，便于切片。一般切成5-6片，每隔2mm切一片。第一刀在脑前极与视交叉连线中点处；第二刀在视交叉部位；第三刀在漏斗柄部位；第四刀在漏斗柄与后叶尾极之间。将切片置于TTC中，浓度为2％，避光放入37C温箱15～30min，不时翻动脑片，使均匀接触到染色液。最后将脑片没入多聚甲醛中固定，拍照，计算梗死体积。

脑梗死体积百分比＝(梗死对侧正常脑组织体积－梗死侧正常脑组织体积)/梗死对侧正常脑组织体积*100％

3.尼氏染色

常规脱蜡，然后梯度酒精脱水(100％I、100％II、95％、90％、80％、70％、50％各5min)；蒸馏水冲洗3次，每次5min；然后置于60℃温箱用1％甲苯胺蓝染色40min(或用焦油紫染色30s)；蒸馏水洗净染料后，于分别置于70％，80％和95％以及100％乙醇中脱水，再用二甲苯透明；最后用中性树胶封片。

4.TUNEL染色

使用TUNEL细胞凋亡检测试剂盒检测神经细胞凋亡情况。简言之，将石蜡切片在3％过氧化氢中封闭10分钟，然后在37℃下用缓冲溶液温育20分钟。在37℃下加入终端脱氧核苷酸转移酶(TdT)反应混合物2小时。接下来，加入Converter-POD溶液并在37℃下温育40分钟。之后用4'6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)着色。对于阴性对照，将切片在没有TdT反应混合物的情况下孵育。凋亡指数为TUNEL阳性细胞占总细胞数的百分比。

5.免疫荧光检测GFAP表达

石蜡切片用乙醇:乙酸(2:1)溶液12分钟，在0.2％Triton-100中5分钟，并用PBS洗涤3次。切片在含1％BSA的PBS中室温封闭1小时，然后用一抗GFAP(1:1000的稀释液)在4℃孵育过夜。用PBS冲洗后，用二抗在室温下处理脑切片1.5小时。用PBS洗涤，然后与DAPI孵育10分钟。使用荧光显微镜将脑切片盖玻片，成像并拍照。

6.Western Blotting

从-80℃冰箱中取出冻存右侧脑海马及皮质标本，置于备好的1.5ml离心管中，按一定比例加入样本、裂解液及蛋白磷酸酶抑制剂。将样本尽量剪碎，在冰浴中用电动匀浆器匀浆，静置于冰上裂解30分钟，12000rpm 4℃低温离心10分钟，留取上清，分装于0.5ml离心管中，置于-20℃保存。用BCA法测定蛋白浓度，确定上样量；随后进行SDS-PAGE电泳:将各组蛋白样品液与上样缓冲液内充分混匀，100℃煮沸5min，使蛋白充分变性，作为蛋白样品电泳加样液。上样完成后，接通电源，待蛋白样品中的溴酚蓝泳至距分离胶下缘1cm时，停止电泳；随后进行湿转法转膜，即将凝胶上的条带转移至PVDF膜上；转膜结束后，进行一抗(PI3K、Akt、p-Akt、Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3、β-actin)孵育及二抗(山羊抗兔IgG单克隆抗体)孵育，最后进行化学发光，显影。

7.免疫组织化学

将固定好的组织经过梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡、石蜡包埋，常规切片。将石蜡切片脱蜡并在乙醇梯度浓缩下水化，然后在高压下用柠檬酸进行抗原修复5分钟。用3％过氧化氢封闭内源性过氧化物酶10min，1％BSA孵育30min，PBS洗15min后与Bcl-2，Bax，caspase-3抗体结合，4℃过夜。随后，与辣根过氧化物酶缀合的山羊抗兔IgG单克隆抗体(1:200稀释)在室温下孵育1小时。DAB作为发色团，用苏打水复染后用苏打水复染，脱水，盖玻片。计算Bcl-2，Bax和cleaved caspase-3表达水平作为阳性细胞数/总数。

实验结果与讨论：

1.对脑缺血再灌注损伤大鼠神经功能和脑梗死体积的影响

与无症状的假手术组相比，模型组评分明显升高(2.43±0.20)(p<0.01)。且蓝布正有效成分组合物组的评分明显高于模型组(P<0.01)，且观察到其行为障碍得到显著改善。TTC染色结果显示，与假手术组相比，模型组梗死体积比明显增加(p<0.01)。蓝布正高低剂量组较模型组的梗死体积明显减少(P<0.01)，具体见表2所示。

表2.对脑缺血再灌注损伤大鼠神经功能评分和脑梗死体积的影响

分组	动物数量(只)	剂量(g/kg)	神经功能评分	脑梗死体积(％)
					假手术组	7	—	0	0
模型组	7	—	2.43±0.53##	19.76±5.44##
					蓝布正高剂量组	8	7.00	1.38±0.52**	10.38±2.86**
蓝布正低剂量组	7	1.75	1.71±0.98**	11.19±2.16**

注：与假手术组比较，##p<0.01；与模型组比较，**p<0.01。

2.对脑缺血再灌注损伤大鼠皮质神经元的活性的影响

与假手术组大鼠皮质区比较，模型组大鼠缺血皮质中大部分细胞被破坏，细胞间距增大，表明MCAO手术会诱导损伤，尼氏体数量与假手术组比较明显减少，且差异有统计学意义。蓝布正低剂量组与模型组相比，尼氏体数量明显增加(p<0.05)，高剂量组效果优于低剂量组(p<0.01)，差异均有统计学意义，如表2所示。

表2.对脑缺血再灌注损伤大鼠皮质神经元的活性的影响

分组	动物数量(只)	剂量(g/kg)	尼氏体数量
				假手术组	10	—	1847.70±273.19
模型组	10	—	824.80±236.32##
				蓝布正高剂量组	10	7.00	1654.80±192.53**
蓝布正低剂量组	10	1.75	1099.00±184.43*

注：与假手术组比较，##p<0.01；与模型组比较，**p<0.01,*p<0.05。

3.对脑缺血再灌注损伤大鼠皮质星形胶质细胞的活性的影响

GFAP被认为是星形胶质细胞标记物，我们利用免疫荧光分析评估了GFAP的表达，以研究脑缺血再灌注对星形胶质细胞的影响及蓝布正活性成分对星形胶质细胞的作用。结果表明，MCAO诱导的模型组大鼠脑皮层缺血半暗区大部分星形胶质细胞死亡，GFAP免疫反应性星形胶质细胞的分布和形态发生明显改变，且阳性细胞数与假手术组相比显着降低(p<0.01)。然而，用不同浓度的蓝布正处理减少了MACO诱导的星形胶质细胞死亡的数量，与模型组相比，蓝布正高低剂量组的阳性细胞数均明显增加，且具有统计学意义，具体见表3。

表3.对脑缺血再灌注损伤大鼠皮质星形胶质细胞的活性的影响

注：与假手术组比较，##p<0.01；与模型组比较，**p<0.01,*p<0.05。

4.对脑缺血再灌注损伤大鼠皮质细胞凋亡的影响

为进一步探讨蓝布正预处理对大鼠脑缺血再灌注损伤的影响，采用TUNEL染色法鉴定DNA片段化，确定细胞的凋亡情况。凋亡指数通过凋亡细胞与总细胞数的比率来评估。定量分析显示假手术大鼠的大脑几乎为DNA片段化阴性而与其相比模型组大部分为TUNEL阳性细胞。然而，与模型组相比，蓝布正高剂量组的阳性细胞数量明显减少(p<0.01)，减轻了脑缺血再灌注损伤诱发的TUNEL阳性细胞数量增加。蓝布正低剂量组细胞虽有所减少，但与模型组相比差异无统计学意义(P>0.05)。这些观察结果支持蓝布正可能通过介导细胞凋亡而发挥神经保护作用的假设。

表4.对脑缺血再灌注损伤大鼠皮质细胞凋亡的影响

分组	动物数量(只)	剂量(g/kg)	凋亡率
				假手术组	10	—	18.54±2.09
模型组	10	—	11.68±0.90##
				蓝布正高剂量组	10	7.00	17.38±2.65**
蓝布正低剂量组	13	1.75	15.32±2.28

注：与假手术组比较，##p<0.01；与模型组比较，**p<0.01。

5.对PI3K/Akt通路及凋亡相关蛋白表达情况的影响：

为了探讨脑缺血再灌注期间蓝布正活性成分调节PI3K/Akt信号通路的内在机制，我们通过Western blotting分析了再灌注24小时后PI3K的表达和Akt的磷酸化水平。如图7所示，与假手术组比较，模型组PI3K和p-Akt的表达显着降低(均P<0.01)。然而，给予药物后能升高缺血大脑皮质PI3K和p-Akt的表达水平。与模型组相比，蓝布正高剂量组的PI3K和p-Akt蛋白表达均显着增加(均P<0.01)，低剂量组PI3K蛋白表达也增加(p<0.05)，但p-Akt蛋白表达虽有升高趋势，但无明显的统计学差异(p>0.05)。结果表明，脑缺血再灌注损伤使PI3K和p-Akt的表达减少，且蓝布正能使减少的PI3K和p-Akt的表达增加，说明蓝布正可能影响PI3K/Akt通路。

此外，为了确定该活性成分组合物对凋亡相关蛋白有何影响，我们通过免疫组织化学染色法和Western blotting法对Bcl-2，Bax和cleaved caspase-3蛋白的表达进行了评估。免疫组织化学结果发现，模型组Bcl-2阳性细胞明显减少，而Bax和cleaved caspase-3阳性细胞较假手术组明显增加(均P<0.01)。与模型组相比，蓝布正高剂量组Bcl-2阳性细胞数增加，Bax和cleaved caspase-3显著降低(均P<0.01)。蓝布正低剂量组中，Bcl-2和cleaved caspase-3阳性细胞数与模型组相比虽然有所降低，但其差异均无统计学意义(均p>0.05)，而Bax阳性细胞数明显下降(p<0.05)。图8分别显示了Bcl-2，Bax和cleavedcaspase-3的阳性细胞表达情况。根据以上结果，我们发现当大鼠受到缺血再灌注损伤时，Bcl-2的阳性细胞数减少，Bax阳性细胞数增加，cleaved caspase-3阳性细胞数增加，说明细胞凋亡增多；而蓝布正高低剂量组均能翻转上述变化，说明蓝布正能使细胞凋亡情况有所改善。与免疫组织化学分析结果一致，Western blotting结果(图9)表明造模后Bcl-2蛋白表达降低(p<0.01)，Bax及cleaved caspase-3均升高(均p<0.01)。但用不同剂量的蓝布正处理大鼠后，Bcl-2表达增加，Bax和cleaved caspase-3明显降低。另一方面，对于Bcl-2和cleaved caspase-3，Western blotting和免疫组织化学的结果中模型组和蓝布正低剂量组之间的均无显着性差异(p>0.05)。此结果与免疫组化结果相对应，进一步证实了脑缺血再灌注会引起细胞凋亡，且蓝布正能够通过减轻细胞凋亡改善脑损伤。

结果表明，该天然药物的活性成分组合物能够减轻脑缺血再灌注损伤，其可能的作用机制是通过PI3K/Akt通路，调节凋亡相关蛋白的表达，从而减轻脑缺血再灌注损伤引起的细胞凋亡程度，恢复大脑功能。

Claims (8)

1.一种治疗脑缺血再灌注损伤的天然药物活性成分组合物，其特征在于：活性成分组合物包括：3,4,5-三羟基苯甲醛、特马里素Ⅱ和木麻黄鞣宁。

2.权利要求1所述天然药物活性成分组合物制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

取蓝布正干燥全草，切碎，加入甲醇或70%的乙醇溶液，采用回流或浸渍提取的方式进行多次提取，过滤，合并滤液，进行减压浓缩，回收甲醇或乙醇，即可得到活性成分组合物。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：采用甲醇进行提取时，甲醇的加入量为蓝布正质量的10倍，采用室温浸渍方式进行提取，共提取3次，每次浸渍提取时间为5-7天。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：采用乙醇溶液进行提取时，乙醇溶液的加入量为蓝布正质量的10倍，在60~70℃进行回流提取，共提取3次，每次时间为1.5-2h。

5.一种药物组合物，其特征在于：其为含有权利要求1中天然药物活性成分组合物的药学上可接受的载体。

6.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于：所述药学上可接受的载体为颗粒剂、丸剂、片剂、 胶囊、干糖浆或冻干粉针。

7.权利要求1所述的天然药物活性成分组合物在制备减轻脑缺血再灌注损伤药物中的应用。

8.权利要求1所述的天然药物活性成分组合物在制备经PI3K/Akt通路抑制受损脑细胞凋亡以减轻脑缺血再灌注损伤药物中的应用。