CN115645449A - 一种双辅料酒蜜制山萸肉炮制方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种山茱萸的双辅料酒蜜制方法及应用，属于中药炮制技术领域。本发明以莫诺苷、马钱苷、獐芽菜苷、山茱萸新苷Ⅰ、没食子酸等有效成分的含量及口感为主要考察指标，采用双辅料的方法对山茱萸进行炮制，并对炮制过程的工艺参数进行了优化，运用双辅料炮制后的山萸肉口感酸甜，可在不同程度上升高主要环烯醚萜苷类成分的含量，解决了传统酒萸肉口感酸涩的问题以及传统酒萸肉炮制后环烯醚萜苷类含量显著降低的问题。且本发明所公开炮制方法制备的酒蜜萸肉对糖尿病肾病具有最佳的治疗效果，说明双辅料制山萸肉有望成为糖尿病肾病更好的治疗药物。
Description
技术领域
本发明属于中药材炮制技术领域，具体涉及一种双辅料酒蜜制山萸肉炮制方法及应用。
背景技术
山萸肉为山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalis Sieb. et Zucc.的干燥成熟果肉，其味酸、涩，具有补益肝肾，收涩固脱的功效，常用于治疗眩晕耳鸣，腰膝酸痛，阳痿遗精，遗尿尿频，崩漏带下，大汗虚脱，内热消渴。
山萸肉作为传统中药应用已有数千年历史。山萸肉中活性成分主要包括环烯醚萜苷类（莫诺苷、马钱苷、山茱萸新苷Ⅰ、獐芽菜苷等）、有机酸（没食子酸）、三萜类等，其中，莫诺苷、马钱苷具有保护心肌、调节骨代谢等作用；獐芽菜苷具有保护肝细胞、促进细胞修复的作用；山茱萸新苷Ⅰ具有抗炎、保护神经元等功效；没食子酸具有抗氧化、降糖等作用。其中环烯醚萜苷类成分是山茱萸含量最高的成分群，同时也是山茱萸的特征性成分，因此在山萸肉及酒蜜萸肉的质量控制中具有指导作用。
目前，《中国药典》2020年版收载山茱萸的饮片为山萸肉和酒萸肉，而临床应用主要以酒萸肉为主。《中国药典》1963年版出版以来，药典中收载酒萸肉的制备方法均为酒蒸（炖）法，炖或蒸至酒吸尽而成。酒萸肉中莫诺苷、马钱苷、山茱萸新苷Ⅰ、獐芽菜苷含量均显著低于生品；且山萸肉经黄酒炮制后口感酸涩，不利于临床患者服用。基于以上情况，综合考虑酒蜜萸肉产品质量评价指标为：莫诺苷、马钱苷、獐芽菜苷、山茱萸新苷Ⅰ、没食子酸等有效成分含量，以及成品口感，建立切实可行的酒蜜萸肉生产工艺，有效减少生产中品质的差别，使有效成分损失降至最低，对中药饮片生产企业生产酒蜜萸肉饮片具有重要意义。
糖尿病肾病（Diabetic nephropathy，DN）是糖尿病（Diabetes mellitus，DM）最严重、最常见的慢性并发症之一，是导致终末期肾脏病的主要原因之一，也是糖尿病患者致死的重要因素，对人类健康造成严重危害。迄今为止，DN的发病机制并未阐明，现有研究数据表明，糖代谢异常、炎性反应、氧化应激、内质网应激、自噬、外泌体等均能引起DN。目前，西医主要通过控制血压、控制血脂、抗炎进而预防DN发生及恶化；中医主要通过中药内服、针刺、灌肠等进行治疗，但是未能完全阐明DN的发病机制以及治疗的特效药。因此，积极的防治DN，抑制病情的发展，是避免肾衰竭，延长患者生命的主要手段。在本发明中，采用高脂高糖饲料喂养联合链脲佐菌素（STZ）腹腔注射法诱导建立DN大鼠模型，探讨山萸肉炮制前后对DN治疗作用机制，以及对肠道菌群的影响，以期为山萸肉及其炮制品的临床应用提供新的实验依据。
CN114796299A公开了一种山萸肉的炮制方法，该方法直接利用山茱萸鲜果进行高压蒸制，得到蒸制山茱萸果。该方法虽然能够使净山萸肉快速干燥，但是采用高压蒸制，生产上增加了投资成本，且高压会导致炮制品的功效下降，也未能改变山萸肉的酸涩口感。CN111467384A公开了一种酒萸肉的炮制方法，该方法将黄酒和山茱萸果肉按一定比例混合；将浸泡好的山茱萸果肉蒸制，蒸制完成后保温；将保温处理后的山茱萸果肉干燥，即得酒萸肉。该方法有效避免酒萸肉在加工过程中山萸肉质量不稳定，颜色不均一现象，但是该方法未能改善山萸肉酸涩的口感。
可见，目前还没有既能改善山萸肉的酸涩口感又能保证山萸肉良好疗效的中药饮片。因此，本发明建立切实可行的酒蜜萸肉生产工艺，对中药饮片生产企业酒蜜萸肉饮片的生产具有重要意义。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的是提供一种酒蜜萸肉的炮制方法及应用。本研究以山萸肉经黄酒和蜂蜜炮制后改善酸涩口感、提高了山萸肉炮制品中主要环烯醚萜苷类的含量为指标对炖制工艺中的酒蜜比、炖制时间、干燥温度、干燥时间进行优化，并采用正交设计法对双辅料酒蜜制山萸肉炖制工艺参数进行优化，最终得到酒蜜萸肉的最佳炖制工艺。
为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案。
本发明提供了一种双辅料酒蜜制山萸肉的炮制方法，其特征在于，所述双辅料为黄酒和蜂蜜；所述方法具体包括以下步骤：
步骤一：取净山萸肉，加入适量的双辅料，拌匀，密闭容器，至双辅料被吸尽；
步骤二：将步骤一所制得山萸肉饮片上锅，隔水炖制；
步骤三：将步骤二所得炖后所得酒蜜萸肉进行干燥，即得。
进一步地，所述步骤一中山萸肉和双辅料的比例为山萸肉：混合辅料=100：35。
进一步地，所述步骤一中双辅料的混合比例为为酒重：蜜重=（30~15）：（5~20）。
进一步地，所述步骤二中隔水炖制时间为2~10 h。
进一步地，所述步骤三中干燥温度为40~80℃。
进一步地，所述步骤三中干燥时间为3~7 h。
进一步地，具体包括以下步骤：
步骤一：山萸肉原药材经除去杂质及果核、果梗得到净山萸肉，按比例加入双辅料黄酒和蜂蜜拌匀，密闭；所述净山萸肉与双辅料的比例为100：30：5；
步骤二：将10 g步骤一所制得的山萸肉生品饮片隔水炖制6 h，取出；
步骤三：将步骤二所得山萸肉饮片于50℃烘箱干燥5 h，制得酒蜜萸肉炮制品。
进一步地，根据上述任一项所述的一种酒蜜萸肉的炮制方法制得的酒蜜萸肉在治疗糖尿病肾病中的药物中的应用。
本发明还提供一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有上述所述任一项所述的一种酒蜜萸肉的炮制方法制得的酒蜜萸肉以及药学上可接受的载体；所述药物组合物用于制备治疗糖尿病肾病中的药物。
进一步地，所述药物组合物选自：片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、散剂、膏剂、混悬剂、注射剂、栓剂、滴剂、滴丸剂、口服液或贴剂。
与现有技术相比本发明的有益效果。
1.运用双辅料炮制的山萸肉口感酸甜，解决了传统酒萸肉口感酸涩的问题，方便患者服用；传统酒萸肉炮制后环烯醚萜苷类含量显著降低，应用本发明炮制后可在不同程度上升高主要环烯醚萜苷类成分的含量；与传统的炮制方法相比，酒蜜萸肉炮制工艺具有指标量化、效率高等特点，可为饮片临床应用中的安全性和有效性提供保障。
2.山萸肉及其不同炮制品能有效降低糖尿病肾病大鼠24小时尿白蛋白，减轻肾脏病理损害。山萸肉及其不同炮制品可能通过抗氧化作用及抑制Wnt/β-catenin信号通路，发挥肾脏保护功效，调节部分短链脂肪酸产生菌的含量提高肠道内短链脂肪酸的含量，发挥机体供能的作用，利于健康的恢复，使有益菌增多，致病菌减少。实验表明，酒蜜萸肉效果最佳，酒蜜萸肉有望成为糖尿病肾病的治疗药物。本专利的结果可为后期酒蜜萸肉的合理开发利用提供科学依据。
附图说明
图1是混合对照品、山萸肉、酒萸肉、酒蜜萸肉高效液相色谱图。其中A为混合对照品；B为山萸肉生品；C为酒萸肉炖品；D为酒蜜萸肉炖品。图A-D中1为没食子酸；2为莫诺苷；3为獐芽菜苷；4为马钱苷；5为山茱萸新苷Ⅰ。
图2是各组大鼠S-Cr（A），BUN（B），mALB（C）、KI（D）及FBG（E）指标水平比较（n=10，
）。其中，A.空白组；B.DN模型组；C.厄贝沙坦组；D.山萸肉组；E.酒萸肉组；F.酒蜜萸肉组；G.辅料酒组；H.辅料酒蜜组。与空白组比较 * P<0.05；与DN模型组比较 # P<0.05；与酒蜜萸肉组比较 Δ P<0.05。
图3是山萸肉及其炮制品对DN大鼠肾组织病理学的影响（HE，×400）。其中，A.空白组；B. DN模型组；C.厄贝沙坦组；D.山茱萸组；E.酒山茱萸组；F.酒蜜山茱萸组；G.辅料酒组；H.辅料酒蜜组。箭头①表示肾小球变形，箭头②表示肾间质水肿，箭头③表示肾小管变性萎缩，箭头④表示间质炎性细胞浸润。
图4是各组YKL-40（A）、Wnt4（B）、β-catenin（C）、TGF-β1（D）mRNA表达比较（n=10，
）。
图5是各组大鼠粪便样本肠道菌群测序稀释曲线。
图6是各组大鼠粪便样本肠道菌群测序Shannon-Wiener曲线。
图7是各组大鼠粪便样本肠道菌群测序和Rank-Abundance曲线。
图8是OUT在不同处理组分布的Veen图。
图9是各组大鼠肠道菌群的PCoA得分分布。
图10是门（A）属（B）分类水平的分类学组成分析。
具体实施方式
下面以具体实施例对本发明做进一步的详细描述。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明内容所实验的技术均属于本发明的范围。
本发明所述双辅料酒蜜制山萸肉炮制工艺的产品的质量检测方法为：测定莫诺苷、獐芽菜苷、马钱苷、山茱萸新苷Ⅰ、没食子酸的含量。
测定莫诺苷、獐芽菜苷、马钱苷、山茱萸新苷Ⅰ、没食子酸的含量方法包括以下步骤。
（1）色谱条件
色谱柱：Diamonsil Plus C18-A柱；流动相：乙腈（A）-0.3%磷酸水（B）（0~20 min：A%为7%；20~50 min：A%为7%→20%；50~65 min：A%为20%）；流速：1.0 mg·mL-1；检测波长：0~10 min为280 nm，10~65 min为240 nm；进样量：10 μL；柱温：30℃。
（2）对照品溶液制备
分别精密称取莫诺苷、獐芽菜苷、马钱苷、山茱萸新苷Ⅰ、没食子酸对照品适量，加入甲醇溶液定容于10 mL容量瓶中，摇匀，即得对照品母液。分别吸取上述莫诺苷、獐芽菜苷、马钱苷、山茱萸新苷Ⅰ、没食子酸对照品母液各1 mL于5 mL量瓶中，摇匀，即得含莫诺苷0.036 mg·mL-1，獐芽菜苷0.040 mg·mL-1，马钱苷0.092 mg·mL-1，山茱萸新苷Ⅰ0.028mg·mL-1，没食子酸0.031 mg·mL-1的混合对照品溶液。
（3）供试品溶液制备
取山萸肉饮片粉末（过四号筛）约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入25mL80%甲醇，称重，超声20 min，放冷，补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
一种山茱萸的酒蜜炖制备方法，包括以下步骤。
实施例1。
（1）山萸肉原药材经除去杂质及果核、果梗，加辅料黄酒和蜂蜜（山萸肉：黄酒：蜂蜜=100：30：5）拌匀，密闭。
（2）将10 g上述所制得的山萸肉饮片隔水炖制4 h，取出。
（3）于60℃烘箱干燥4 h，制得酒蜜萸肉炮制品。
（4）口感：舌头品尝。
所得产品莫诺苷含量为11.17 mg·g-1；獐芽菜苷含量为0.73 mg·g-1；马钱苷含量为4.41 mg·g-1；山茱萸新苷Ⅰ含量为1.38 mg·g-1；没食子酸含量为1.50 mg·g-1；口感酸甜。
实施例2。
（1）山萸肉原药材经除去杂质及果核、果梗，加辅料黄酒和蜂蜜（山萸肉：黄酒：蜂蜜=100：25：10）拌匀，密闭。
（2）将10 g上述所制得的山萸肉饮片隔水炖制4 h，取出。
（3）于60℃烘箱干燥4 h，制得酒蜜萸肉炮制品。
（4）口感：舌头品尝。
所得产品莫诺苷含量为11.48 mg·g-1；獐芽菜苷含量为0.92 mg·g-1；马钱苷含量为5.64 mg·g-1；山茱萸新苷Ⅰ含量为1.53 mg·g-1；没食子酸含量为1.30 mg·g-1；口感酸甜。
实施例3。
（1）山萸肉原药材经除去杂质及果核、果梗，加辅料黄酒和蜂蜜（山萸肉：黄酒：蜂蜜=100：30：5）拌匀，密闭。
（2）将10 g上述所制得的山萸肉饮片隔水炖制2 h，取出。
（3）于60℃烘箱干燥4 h，制得酒蜜萸肉炮制品。
（4）口感：舌头品尝。
所得产品莫诺苷含量为10.02 mg·g-1；獐芽菜苷含量为0.75 mg·g-1；马钱苷含量为4.73 mg·g-1；山茱萸新苷Ⅰ含量为1.30 mg·g-1；没食子酸含量为0.83 mg·g-1；口感酸甜。
实施例4。
（1）山萸肉原药材经除去杂质及果核、果梗，加辅料黄酒和蜂蜜（山萸肉：黄酒：蜂蜜=100：30：5）拌匀，密闭。
（2）将10 g上述所制得的山萸肉饮片隔水炖制6 h，取出。
（3）于60℃烘箱干燥4 h，制得酒蜜萸肉炮制品。
（4）口感：舌头品尝。
所得产品莫诺苷含量为12.07 mg·g-1；獐芽菜苷含量为0.89 mg·g-1；马钱苷含量为5.68 mg·g-1；山茱萸新苷Ⅰ含量为1.49 mg·g-1；没食子酸含量为1.43 mg·g-1；口感酸甜。
实施例5。
（1）山萸肉原药材经除去杂质及果核、果梗，加辅料黄酒和蜂蜜（山萸肉：黄酒：蜂蜜=100：30：5）拌匀，密闭。
（2）将10 g上述所制得的山萸肉饮片隔水炖制8 h，取出。
（3）于60℃烘箱干燥4 h，制得酒蜜萸肉炮制品。
（4）口感：舌头品尝。
所得产品莫诺苷含量为10.64 mg·g-1；獐芽菜苷含量为0.68 mg·g-1；马钱苷含量为4.44 mg·g-1；山茱萸新苷Ⅰ含量为1.11 mg·g-1；没食子酸含量为1.40 mg·g-1；口感酸甜。
实施例6。
（1）山萸肉原药材经除去杂质及果核、果梗，加辅料黄酒和蜂蜜（山萸肉：黄酒：蜂蜜=100：30：5）拌匀，密闭。
（2）将10 g上述所制得的山萸肉饮片隔水炖制6 h，取出。
（3）于50℃烘箱干燥4 h，制得酒蜜萸肉炮制品。
（4）口感：舌头品尝。
所得产品莫诺苷含量为11.00 mg·g-1；獐芽菜苷含量为0.96 mg·g-1；马钱苷含量为5.85 mg·g-1；山茱萸新苷Ⅰ含量为1.80 mg·g-1；没食子酸含量为1.31 mg·g-1；口感酸甜。
实施例7。
（1）山萸肉原药材经除去杂质及果核、果梗，加辅料黄酒和蜂蜜（山萸肉：黄酒：蜂蜜=100：30：5）拌匀，密闭。
（2）将10 g上述所制得的山萸肉饮片隔水炖制6 h，取出。
（3）于50℃烘箱干燥3 h，制得酒蜜萸肉炮制品。
（4）口感：舌头品尝。
所得产品莫诺苷含量为10.98 mg·g-1；獐芽菜苷含量为0.79 mg·g-1；马钱苷含量为5.55 mg·g-1；山茱萸新苷Ⅰ含量为1.26 mg·g-1；没食子酸含量为1.76 mg·g-1；口感酸甜。
实施例8。
（1）山萸肉原药材经除去杂质及果核、果梗，加辅料黄酒和蜂蜜（山萸肉：黄酒：蜂蜜=100：30：5）拌匀，密闭。
（2）将10 g上述所制得的山萸肉饮片隔水炖制6 h，取出。
（3）于50℃烘箱干燥5 h，制得酒蜜萸肉炮制品。
（4）口感：舌头品尝。
所得产品莫诺苷含量为15.74 mg·g-1；獐芽菜苷含量为1.02 mg·g-1；马钱苷含量为5.89 mg·g-1；山茱萸新苷Ⅰ含量为2.09 mg·g-1；没食子酸含量为2.24 mg·g-1；口感酸甜。
实施例9。
（1）山萸肉原药材经除去杂质及果核、果梗，加辅料黄酒和蜂蜜（山萸肉：黄酒：蜂蜜=100：30：5）拌匀，密闭。
（2）将10 g上述所制得的山萸肉饮片隔水炖制6 h，取出。
（3）于50℃烘箱干燥6 h，制得酒蜜萸肉炮制品。
（4）口感：舌头品尝。
所得产品莫诺苷含量为13.05 mg·g-1；獐芽菜苷含量为0.80 mg·g-1；马钱苷含量为4.79 mg·g-1；山茱萸新苷Ⅰ含量为1.30 mg·g-1；没食子酸含量为1.65 mg·g-1；口感酸甜。
上述实施例证明在本申请工艺参数下所得产品莫诺苷、马钱苷、獐芽菜苷、山茱萸新苷Ⅰ、没食子酸含量较高，口感酸甜。
对比例1。
一种山萸肉饮片的炮制方法，包括以下步骤：山萸肉原药材经除去杂质及果核果梗，于50℃烘箱干燥，即得山萸肉生品饮片。
口感：舌头品尝。
所得产品莫诺苷含量为18.17 mg·g-1；獐芽菜苷含量为1.22 mg·g-1；马钱苷含量为7.77 mg·g-1；山茱萸新苷Ⅰ含量为3.57 mg·g-1；没食子酸含量为0.99 mg·g-1；口感酸涩。
对比例2。
一种山萸肉饮片的炮制方法，包括以下步骤：每100 kg山萸肉原药材经除去杂质及果核果梗加入35 kg的黄酒，拌匀，闷润1 h，隔水加热炖制6 h，50℃烘箱干燥，即得酒萸肉饮片。
口感：舌头品尝。
所得产品莫诺苷含量为11.81 mg·g-1；獐芽菜苷含量为0.70 mg·g-1；马钱苷含量为4.82 mg·g-1；山茱萸新苷Ⅰ含量为1.43 mg·g-1；没食子酸含量为2.12 mg·g-1；口感酸涩。
按实施例8、对比例1、2依法测定生山萸肉、酒萸肉、酒蜜萸肉中莫诺苷、獐芽菜苷、马钱苷、山茱萸新苷Ⅰ、没食子酸的含量，由实验结果可知，实施例8炮制的山萸肉口感酸甜；与对比例1比较，对比例2炮制后环烯醚萜苷类含量显著降低，而实施例8可在不同程度上升高主要环烯醚萜苷类成分的含量。
实施例12。
（1）样品的制备。
酒萸肉的制备：取净山萸肉，加适量辅料拌匀，密闭，隔水炖制8 h至辅料被吸尽，取出，于50℃烘干4 h，每600 g的山萸肉用辅料黄酒180 g。
酒蜜萸肉的制备：取净山萸肉，加适量辅料拌匀，密闭，隔水炖制6 h至辅料被吸尽，取出，于50℃烘干5 h，每600 g的山萸肉用辅料210 g（黄酒：蜂蜜=30：5）。
分别精密称取山萸肉、酒萸肉、酒蜜萸肉样品各600 g，加水煎煮2次，第1次加入10倍量水，煎煮1.5 h，第2次加入8倍量水煎煮1.5 h，合并2次滤液，旋蒸浓缩浓度至0.28125g·mL-1，即得山萸肉生品及炮制品提取液，分装至玻璃瓶内，密封保存，置于4℃冰箱供实验周期使用。
（2）造模、分组及给药。
所有大鼠适应性饲养7 d，及时剔除毛色、精神、大便异常的大鼠10只，剩余大鼠应用随机数字表法分为正常组（n=10）和DN组（n=80）。空白组普通饲料喂养，DN组高糖高脂饲料喂养4周，禁食不禁水12 h后采用一次性腹腔注射STZ 35 mg·kg-1（即用即配，溶剂为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液）诱导建立DN大鼠模型，空白组给予等体积柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液单次腹腔注射。72 h后尾静脉取血并采用血糖仪测血糖值，选取空腹血糖（FBG）≥16.7mmol·L-1及大鼠尿液量增加一倍以上的作为DN大鼠。6只造模大鼠血糖＜16.7 mmol·L-1，4只大鼠造模过程死亡，均予以剔除。将70只造模成功大鼠按随机数字表法分为DN模型组、厄贝沙坦组（1.35 mg·kg-1·d-1）、山萸肉组（281.25 mg·kg-1·d-1）、酒萸肉组（281.25mg·kg-1·d-1）、酒蜜萸肉组（281.25 mg·kg-1·d-1）、辅料酒组（10 mL·kg-1·d-1）及辅料酒蜜组（10 mL·kg-1·d-1）各10只，按上述药物及剂量灌胃，1次/d，连续6周。
（3）标本留取与保存。
观察大鼠的一般状态。6周给药结束后，采用尾静脉采血，测定大鼠血糖。代谢笼收集大鼠24 h尿液，期间禁食不禁水，记录各组大鼠尿量，离心取上清后，-20℃冰箱冻存，用于mAlb测定。采用提尾反射法取各组大鼠粪便样本于无菌EP管中，于液氮中速冻后，冻存于-80℃冰箱，用于肠道菌群多样性及短链脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）的检测。大鼠取材前空腹12 h，称定各组大鼠体质量，用20%乌拉坦溶液腹腔注射麻醉后，腹腔主动脉采血5 mL，促凝管采集全血，静置1 h后离心（3500 r·min-1，4℃，15 min），分装血清冻存，用于S-Cr、BUN的测定。取左侧肾脏称定质量后固定于4%多聚甲醛溶液中，右侧肾脏迅速分装于EP管，于液氮中速冻后，冻存于-80℃超低温冰箱内用于RT-PCR法测定YKL-40、Wnt4、β-catenin、TGF-β1 mRNA的表达。
（4）一般状态检测。
观察大鼠的反应、精神状况、饮食、毛色、二便等。每周监测大鼠体质量、进食及进水量。
在实验过程中，空白组大鼠生长状况良好，皮毛光亮，活动量大，反应敏捷，进食与排泄正常，体质量逐渐增加。DN模型组、辅料酒组、辅料酒蜜组大鼠生长明显迟缓，活动量少，且多饮、多食、多尿，在实验后期，DN模型组、辅料酒组、辅料酒蜜组大鼠出现明显的反应迟钝，皮毛暗淡无光，身体明显消瘦。与DN模型组比较，厄贝沙坦组与酒蜜萸肉组大鼠在上述方面有明显的改善，在实验后期，DN模型组较其它组大鼠体质量明显降低。
（5）生化指标检测及肾脏指数计算。
取-80℃冻存的血清样本，于4℃冰箱解冻，ELISA试剂盒检测大鼠血清样本中S-Cr、BUN、mALB水平，实验步骤严格按照试剂盒说明书执行。肾脏质量（mg）与体质量（g）之比即为肾脏指数（kidney index，KI）。
与空白组比较，DN模型组、辅料酒组、辅料酒蜜组大鼠S-Cr，BUN，mALB，KI，FBG显著升高（P＜0.05），差异有明显统计学意义；与DN模型组比较，厄贝沙坦组、山萸肉组、酒萸肉组及酒蜜萸肉组大鼠S-Cr，BUN，mALB，KI，FBG显著降低（P＜0.05）；酒蜜萸肉组S-Cr，BUN，mALB，KI与FBG与山萸肉组、酒萸肉组比较明显降低（P<0.05）。
（6）肾脏组织病理形态观察。
取4%多聚甲醛固定48 h以上的肾脏组织，不同浓度酒精梯度脱水，石蜡包埋后切片，烘片后二甲苯脱蜡，水洗后进行HE染色，光学显微镜下观察各组肾脏组织形态。
病理检查结果显示，空白组大鼠肾组织形态正常，肾小球形状规则，无肥大或萎缩，肾小管上皮细胞大小正常排列整齐，肾脏间质结构正常。DN模型组、辅料酒组、辅料酒蜜组大鼠肾脏组织存在特征明显的DN病理改变，肾组织结构紊乱，肾小球肥大，系膜细胞增生，结节硬化清晰可见，肾小管变性萎缩，肾小管上皮细胞包浆内可见大量空泡和肿胀细胞明显出现空泡变性，部分出现萎缩，肾间质明显水肿，可见大量炎性细胞浸润。与DN模型组比较，山萸肉组、酒萸肉组、酒蜜萸肉组及厄贝沙坦组大鼠肾组织以上病理改变有较为明显的改善，肾小球结节硬化和肾间质水肿减轻，其中酒蜜萸肉组肾脏组织病理炎症浸润和肾小球萎缩减少以及系膜增生的程度降低的最为明显。
（7）YKL-40、Wnt4、β-catenin和TGF-β1 mRNA的表达。
取适量冻存肾脏组织标本，匀浆，严格按照Trizol试剂盒说明书操作提取组织总RNA，测定RNA浓度，反转录试剂盒合成cDNA。按SYBR Green PCR试剂盒说明书要求，进行PCR反应。PCR循环反应条件：95℃预变性30 s，95℃变性15 s，60℃退火1 min，95℃延伸15 s，40个循环。以2^(-∆∆CT)法计算各样品中目的基因的相对表达量（CT为循环数）。每个样品独立重复实验3次。引物序列见表1。
表1 基因及其对应引物序列
与空白组比较，DN模型组、辅料酒组、辅料酒蜜组大鼠肾组织YKL-40、Wnt4、β-catenin、TGF-β1 mRNA表达显著升高（P＜0.05）；与DN模型组比较，山萸肉组、酒萸肉组、酒蜜萸肉组肾组织YKL-40、Wnt4、β-catenin、TGF-β1 mRNA表达显著降低（P＜0.05）。与酒蜜萸肉组比较，山萸肉组及酒萸肉组肾组织YKL-40、Wnt4、β-catenin、TGF-β1 mRNA表达具有显著性差异（P＜0.05）。
（8）SCFAs的检测。
称取各组大鼠同时间点的无菌粪便100 mg，精密称定，置于20 mL顶空进样瓶中。加入50 μL 0.2% H3PO4溶液，内含4-甲基戊酸内标溶液（0.668 mg·mL-1），充分混匀，迅速密封，在GC-MS仪器中进行检测，为了保证实验结果真实可重复性，需要将同一份样品分为6份，逐一完成进样，计算对应SCFAs峰面积，根据标准曲线图推算上清液中各短链脂肪酸的浓度。
与空白组比较，DN模型组、辅料酒组、辅料酒蜜组大鼠新鲜粪便中的7种短链脂肪酸含量发生显著减少（P<0.05），经药物干预后发现，厄贝沙坦组、酒萸肉组、酒蜜萸肉组对新鲜粪便种SCFAs含量均具有显著回调作用，山萸肉组除了对新鲜粪便中丁酸无显著增加作用外，对其他6种SCFAs也具有广泛回调作用（P<0.05），虽然各样本中SCFAs受各给药组调节的范围和强度略有不同，但各给药组除丁酸外，均具有显著上调作用（P<0.05）。总之，酒蜜萸肉组对7种SCFAs含量的调节作用最佳。见表2。
表2 各组大鼠肠道SCFAs含量（n=10，
，μg/g）
注：与正常组比较* P<0.05；与模型组比较# P<0.05；与酒蜜萸肉组比较Δ P<0.05。
（9）16S rRNA高通量测序技术检测大鼠肠道菌群
根据DNA提取试剂盒提取粪便中的总DNA，使用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的提取质量，使用NanoDrop2000测定DNA浓度和纯度。对16S rRNA基因V3-V4可变区进行PCR扩增，引物为338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’），扩增程序如下：95℃预变性3min，27个循环（95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s），然后72℃稳定延伸10 min，最后在4℃进行保存。每个样本重复3次。
将同一样本的PCR产物混合后使用2%琼脂糖凝胶回收PCR产物，利用AxyPrep DNAGel Extraction Kit进行回收产物纯化，2%琼脂糖凝胶电泳检测，并用Quantus™Fluorometer对回收产物进行检测定量。使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit 进行建库首先进行链接接头；再使用磁珠进行筛选，去掉接头自连片段；利用PCR扩增的方法进行文库模板的富集；最后使用磁珠回收PCR产物得到文库。利用Illumina公司的61 Miseq PE300平台进行测序。
使用fastp软件对原始测序序列进行质控，使用FLASH软件进行拼接：（1）过滤reads尾部质量值20以下的碱基，设置50 bp的窗口，如果窗口内的平均质量值低于20，从窗口开始截去后端碱基，过滤质控后50 bp以下的reads，去除含N碱基的reads；（2）根据PEreads之间的overlap关系，将成对reads拼接(merge)成一条序列，最小overlap长度为10bp；（3）拼接序列的overlap区允许的最大错配比率为0.2，筛选不符合序列；（4）根据序列首尾两端的barcode和引物区分样品，并调整序列方向，barcode允许的错配数为0，最大引物错配数为2。
使用UPARSE软件，根据97%的相似度对序列进行OTU聚类并剔除嵌合体。利用RDPclassifier对每条序列进行物种分类注释，比对Silva 16S rRNA数据库，设置比对阈值为70%。
根据样本在不同测序深度时多样性指数为sobs时的OTU数，绘制稀释曲线，可见样本在30000Reads左右时曲线逐渐趋于平坦，说明测序数据量合理，更多的数据量只会产生少量新的物种；根据样本在不同测序深度时多样性指数为Shannon-Wiener时的OTU数，绘制曲线，可见样本在4000Reads左右时曲线逐渐趋向平坦，说明测序数据量足够大，可以反映样本中绝大多数的微生物多样性信息。
应用Venn图统计5组样本中所共有和独有的OTU数目，可以比较直观的展现不同环境样本中OTU组成相似性及重叠情况。各组对象肠道菌群OTU情况。空白组独有的OTU有22个，DN模型组独有的OTU有19个，生山萸肉组独有的OTU有12个，酒萸肉组独有的OTU有26个，酒蜜萸肉独有的OTU有22个。5组对象共有的OTU有493个。
Alpha多样性反映的是单个样品内部的物种多样性，通过群落丰度指数与群落多样性指数来衡量，群落丰度指数包括Chao1和Ace，此指数值越大说明群落的丰富度越高，群落多样性指数包括Shannon与Simpson，此指数值越大，说明样品的物种多样性越高。结果显示，DN模型大鼠粪便中肠道菌群的丰富度（Chao1和Ace）及多样性（Shannon与Simpson）较正常组低（P<0.05），厄贝沙坦组，生山萸肉组，酒萸肉组，酒蜜萸肉组大鼠粪便肠道菌群的丰富度（Chao1和Ace）及多样性（Shannon与Simpson）与DN模型组存在显著性差异（P<0.05），接近于空白组。见表3。
表3 山萸肉炮制前后对DN大鼠肠道菌群Alpha多样性指数的影响（n=6，
）
注：与正常组比较* P<0.05;与模型组比较# P<0.05。
主坐标分析（PCoA），结果发现PCo1和PCo2对总体方差解释的百分比分别为68.66%和18.33%。空白组与DN模型组完全分开，与空白组比较，DN模型组大鼠菌群结构具有明显差异；生山萸肉组、酒萸肉组、酒蜜萸肉组样本点均比DN模型组的距离更近，更趋向空白组，表明山萸肉能够影响DN大鼠的肠道菌群组成；辅料酒、辅料酒蜜组样本点更趋近于DN模型组，表明辅料酒以及辅料酒蜜不能影响DN大鼠的肠道菌群组成；DN状态下的肠道菌群发生了明显改变，山萸肉炮制前后均能逆转这种改变，且酒蜜萸肉作用效果优于生山萸肉以及酒萸肉。
在门分类水平上，各组样品中菌群组成情况，在空白组、DN模型组、各给药组中主要的门分类有厚壁菌门（Firmicutes），拟杆菌门（Bacteroidetes），放线菌门（Actinobacteriota），变形菌门（Proteobacteria），其中Firmicutes相对丰度最高，Bacteroidota次之，Proteobacteria相对丰度最低。在属分类水平上，空白组、DN模型组、各给药组中相对丰度较高的为乳酸菌属（Lactobacillus）。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种双辅料酒蜜制山萸肉的炮制方法，其特征在于，所述双辅料为黄酒和蜂蜜；所述方法具体包括以下步骤：
步骤一：取净山萸肉，加入适量的双辅料，拌匀，密闭容器，至双辅料被吸尽；
步骤二：将步骤一所制得山萸肉饮片上锅，隔水炖制；
步骤三：将步骤二所得炖后所得酒蜜萸肉进行干燥，即得。
2.根据权利要求1所述的一种双辅料酒蜜制山萸肉的炮制方法，其特征在于，步骤一中山萸肉和双辅料的比例为山萸肉：双辅料=100：35。
3.根据权利要求1所述的一种双辅料酒蜜制山萸肉的炮制方法，其特征在于，步骤一中双辅料的混合比例为为酒重：蜜重=（30~15）：（5~20）。
4.根据权利要求1所述的一种双辅料酒蜜制山萸肉的炮制方法，其特征在于，步骤二中隔水炖制时间为2~10 h。
5.根据权利要求1所述的一种双辅料酒蜜制山萸肉的炮制方法，其特征在于，步骤三中干燥温度为40~80℃。
6.根据权利要求1所述的一种双辅料酒蜜制山萸肉的炮制方法，其特征在于，步骤三中干燥时间为3~7 h。
7.根据权利要求1所述的一种双辅料酒蜜制山萸肉的炮制方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：山萸肉原药材经除去杂质及果核、果梗得到净山萸肉，按比例加入双辅料黄酒和蜂蜜拌匀，密闭；所述净山萸肉与双辅料的比例为100：30：5；
步骤二：将10 g步骤一所制得的山萸肉生品饮片隔水炖制6 h，取出；
步骤三：将步骤二所得山萸肉饮片于50℃烘箱干燥5 h，制得酒蜜萸肉炮制品。
8.根据权利要求1-7任一项所述的一种酒蜜萸肉的炮制方法制得的酒蜜萸肉在治疗糖尿病肾病中的药物中的应用。
9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有权利要求1-7任一项所述的一种酒蜜萸肉的炮制方法制得的酒蜜萸肉以及药学上可接受的载体；所述药物组合物用于制备治疗糖尿病肾病中的药物。
10.根据权利要求9一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物选自：片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、散剂、膏剂、混悬剂、注射剂、栓剂、滴剂、滴丸剂、口服液或贴剂。
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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