CN106266473A - 一种具有抗肝癌作用的绿蒜提取物及制备方法及用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有抗肝癌作用的绿蒜提取物及制备方法及用途，方法为：(1)取新鲜大蒜，于2‑6℃下放置，粉碎，常温放置，加入食品级弱酸水溶液，混匀，在40‑60℃条件下加热30‑40min，再在70‑80℃加热30‑40min，固液分离，得到绿变大蒜；(2)向绿变大蒜中加入乙醇水溶液，在18‑25℃条件下浸泡提取，提取液浓缩至浸膏无醇味，加水混悬，加有机溶剂萃取，萃取液浓缩至干得到提取物。本发明的方法使提取物含硫化合物含量为85％以上。绿蒜提取物能显著抑制肝癌细胞SMMC‑7721的生长，同时针对H22荷瘤小鼠，有较强抗肿瘤效果，用药后毒副作用降低，且增强了机体的免疫力。

Description

一种具有抗肝癌作用的绿蒜提取物及制备方法及用途
技术领域
本发明涉及一种具有抗肝癌作用的绿蒜提取物及制备方法及用途，属于医药保健品技术应用领域。
背景技术
肝癌是常见的恶性肿瘤之一，其死亡率在消化系统中列第三位，仅次于胃癌和食管癌。我国每年大约有36万新增的肝癌病例，严重威胁了国民身体健康和生活质量。目前的治疗方案一般采取手术方法，并配合化疗。但是肝癌治疗中存在的缺点比如早期症状不明显导致一般初次诊疗就为癌症晚期，并且治疗所用到的化学药物会引起正常细胞和其他脏器损害。相比之下，中药抗肿瘤具有独特的优势，有驱邪、扶正或增效、减毒的作用，所以中药预防和对抗肿瘤一直是抗肝癌研究的热点。
大蒜为百合科葱属植物，它既是人们喜欢的食物，又是一种广泛用于治疗各种疾病的药用植物，有“天然保健食品”之称。大蒜防癌抗癌的历史悠久，其主要的治疗作用集中在含硫化合物成分上，研究和应用较多的是大蒜的脂溶性成分大蒜油和大蒜油的主要有效成分二烯丙基三硫和二烯丙基二硫化合物。含硫化合物具有阻滞肿瘤细胞周期、增效化疗药物等多种抗肿瘤作用。
绿蒜作为一种大蒜衍生产品，国内外学者对于绿蒜的绿变机理及其理化性质做了相关研究，证实蒜瓣在醋酸的作用下，细胞膜以及液泡膜的通透性增加，导致位于液泡内的蒜酶与细胞质中的底物接触，从而诱发一系列化学反应，产生硫代亚磺酸酯，然后硫代亚磺酸酯继续与氨基酸或其他的化合物反应绿色物质。现有报道关于绿蒜的制备方法有传统的腊八蒜腌制方法，腊八蒜具有抗氧化、抗菌和助消化等活性。然而，对于绿蒜中含硫化合物的含量和药理作用特别是抗肝癌活性，却未见报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种具有抗肝癌作用的绿蒜提取物。
本发明的第二个目的是提供一种具有抗肝癌作用的绿蒜提取物的制备方法。
本发明的第三个目的是提供一种具有抗肝癌作用的绿蒜提取物的在制备保健品中的用途。
本发明的技术方案概述如下：
一种具有抗肝癌作用的绿蒜提取物的制备方法，包括如下步骤：
(1)取新鲜去皮大蒜瓣，于2-6℃下放置12天-16天，粉碎，常温放置30-60min，加入1.5-2质量倍的体积浓度为5％-6％的食品级弱酸水溶液，混匀，在40-60℃条件下加热30-40min，再在70-80℃加热30-40min，固液分离，得到绿变大蒜；
(2)向绿变大蒜中加入2-5质量倍的体积浓度为70％-80％的乙醇水溶液，在18-25℃条件下浸泡提取，提取2-4次，每次20-24h，合并提取液，浓缩至浸膏无醇味，加1-3体积倍水混悬，加入混悬液体积1-3倍的有机溶剂萃取，萃取3-4次，合并萃取液，浓缩至干得到提取物。
弱酸优选醋酸、苹果酸或柠檬酸。
有机溶剂优选正己烷、石油醚和乙酸乙酯中至少一种。
上述方法制备的具有抗肝癌作用的绿蒜提取物。
上述具有抗肝癌作用的绿蒜提取物在制备保健品中的用途。
本发明的优点：
(1)快速制备绿蒜，并用一种或者几种有机试剂提取，提取物含硫化合物含量为85％以上。
(2)绿蒜提取物能显著抑制肝癌细胞SMMC-7721的生长，同时针对H22荷瘤小鼠，有较强的抗肿瘤效果，用药后毒副作用降低，且增强了机体的免疫力。
附图说明
图1：绿蒜提取物对H22荷瘤小鼠的瘤体积的影响
图2：H22荷瘤小鼠肿瘤形状
图3：绿蒜提取物对H22荷瘤小鼠的水食效率的影响
图4：H22荷瘤小鼠肿瘤病理切片，其中的A为模型组、B为阳性对照组、C为低剂量组、D为中剂量组、E为高剂量组。
具体实施方式：
下面结合实施例对本发明做进一步的阐述，但本发明并不受限于此，在不脱离本发明的思想和宗旨的情况下，对本发明的技术方案所做的任何变化都应落入本发明权利要求书所限定的范围内。
实施例1
一种具有抗肝癌作用的绿蒜提取物的制备方法，包括如下步骤：
(1)取新鲜去皮大蒜瓣，于4℃下放置14天，粉碎，常温放置45min，加入1.8质量倍的体积浓度为5％的食品级醋酸水溶液，混匀，在50℃条件下加热35min，再在75℃加热35min，固液分离，得到绿变大蒜；
(2)向绿变大蒜中加入3质量倍的体积浓度为75％的乙醇水溶液，在20℃条件下浸泡提取，提取3次，每次22h，合并提取液，浓缩至浸膏无醇味，加2体积倍水混悬，加入混悬液体积2倍的正己烷萃取，萃取3次，合并萃取液，浓缩至干得到提取物。
绿蒜提取物含硫化合物含量为89.63％。
对比例
(步骤(1)、(2)、(3)、(4)为现有技术)
一种制备绿色大蒜的方法，包括如下步骤:
(1)将收获的大蒜蒜头在8℃冷藏20天进行低温预处理；
(2)挑选无霉变、无虫蛀的蒜头，散瓣脱皮得到蒜米，用清水清洗干净，粉碎；
(3)取食品级冰醋酸加水，配成醋酸体积浓度为4.5％的溶液为腌渍液；
(4)按照每1kg蒜末与1.2L腌渍液的用量关系将蒜末浸入腌渍液中，加热至60℃温育2h，得到绿色大蒜。
(5)(按实施例1步骤(2)进行提取)：
向绿变大蒜中加入3质量倍的体积浓度为80％的乙醇水溶液，在20℃条件下浸泡提取，提取3次，每次24h，合并提取液，浓缩至浸膏无醇味，加1体积倍水混悬，加入混悬液体积1倍的正己烷萃取，萃取3次，合并萃取液，浓缩至干得到提取物。
绿蒜提取物含硫化合物含量为65.33％。
实施例2
一种具有抗肝癌作用的绿蒜提取物的制备方法，包括如下步骤：
(1)取新鲜去皮大蒜瓣，于2℃下放置16天，粉碎，常温放置60min，加入1.5质量倍的体积浓度为6％的食品级苹果酸水溶液，混匀，在40℃条件下加热40min，再在70C加热40min，固液分离，得到绿变大蒜；
(2)向绿变大蒜中加入2质量倍的体积浓度为80％的乙醇水溶液，在25℃条件下浸泡提取，提取4次，每次20h，合并提取液，浓缩至浸膏无醇味，加2体积倍水混悬，加入混悬液体积1倍的有机溶剂(有机溶剂为正己烷和石油醚按体积比为1：1的混合物)萃取，萃取3次，合并萃取液，浓缩至干得到提取物。
绿蒜提取物含硫化合物含量为85.07％。
实施例3
一种具有抗肝癌作用的绿蒜提取物的制备方法，包括如下步骤：
(1)取新鲜去皮大蒜瓣，于6℃下放置12天，粉碎，常温放置30min，加入2质量倍的体积浓度为5％的食品级柠檬酸水溶液，混匀，在60℃条件下加热30min，再在80℃加热30min，固液分离，得到绿变大蒜；
(2)向绿变大蒜中加入5质量倍的体积浓度为70％的乙醇水溶液，在18℃条件下浸泡提取，提取2次，每次24h，合并提取液，浓缩至浸膏无醇味，加3体积倍水混悬，加入混悬液体积2倍的乙酸乙酯萃取，萃取4次，合并萃取液，浓缩至干得到提取物。
绿蒜提取物含硫化合物含量为85.72％。
实施例4
一种具有抗肝癌作用的绿蒜提取物的制备方法，包括如下步骤：
(1)取新鲜去皮大蒜瓣，于4℃下放置14天，粉碎，常温放置50min，加入1.5质量倍的体积浓度为5.5％的食品级醋酸水溶液，混匀，在50℃条件下加热40min，再在75℃加热35min，固液分离，得到绿变大蒜；
(2)向绿变大蒜中加入4质量倍的体积浓度为75％的乙醇水溶液，在25℃条件下浸泡提取，提取2次，每次24h，合并提取液，浓缩至浸膏无醇味，加1体积倍水混悬，加入混悬液体积3倍的正己烷萃取，萃取3次，合并萃取液，浓缩至干得到提取物。
绿蒜提取物含硫化合物含量为86.14％。
实施例5
本发明具有抗肝癌作用的绿蒜提取物对肝癌细胞SMMC-7721抑制率的影响。
实验目的
检测具有抗肝癌作用的绿蒜提取物对肝癌细胞SMMC-7721抑制率的影响。
实验材料
1.受试物：将实施例1、2、3、4所制备的绿蒜提取物，准确称量各受试物，用二甲基亚砜溶解，配成浓度为0.10mg/ml的贮存液，在-20℃下保存，使用时用二甲基亚砜稀释成浓度为0.02,0.04,0.06,0.08和0.10mg/ml的溶液。
2.试剂：DMEM培养基：Gibco(USA)，10％胎牛血清：Gibco(USA)；PBS缓冲液：Solarbio(Beijing)；MTT：Solarbio(Beijing)；其余试剂均为市售。
3.细胞株：人源性SMMC-7721肝癌细胞购自上海细胞库。
4.仪器：CO2培养箱(BPN-80CW)：上海一恒科学仪器有限公司；超净工作台(SW-CJ-1FD)：苏州净化设备有限公司；倒置显微镜(BDS-200)：重庆奥特光学仪器有限公司。酶标仪(DNM-9602)：北京普朗医疗设备有限公司。
实验方法：
MTT法检测受试物对肝癌细胞SMMC-7721抑制率的影响。
1.常规培养细胞
1.1细胞复苏
该步骤中，分别对肝癌细胞SMMC-7721进行复苏操作，具体操作如下：
实验前，将超净工作台的台面用紫外线照射30min，将水浴锅加水并预热至37℃，然后将完全培养基(含10％(v/v)牛血清和1％(v/v)青、链霉素的DMEM培养基)置于水浴锅预热。取出冻存的细胞株，迅速将冻存管放入已经预热的水浴锅中迅速解冻，并不断的摇动，使管内的液体迅速融化，约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出，用含75％(体积分数)乙醇的棉球擦拭冻存管外壁。吸取冻存管内细胞，转移至15mL离心管中，同时加入5mL预热完全培养基，1000r/mim离心3min，弃上清液，将离心管内加入10mL完全培养基，轻柔吹打成细胞悬液。通过细胞计数并进行活力测定后，将细胞悬液加入10cm培养皿中，于5％CO2，饱和湿度、37℃的CO2培养箱培养24h。
1.2细胞培养与传代
采用完全培养基将1.1所得细胞进行培养。将生长状态对数期的细胞的原培养液弃去，加入2-3mL PBS缓冲液，轻柔晃动培养皿，然后弃去。加入0.25％(w/v)的胰酶，放入37℃的CO2恒温箱，消化1-2min，再加入3-5ml培养基终止消化，并将贴壁细胞吹打至悬浮，按1:3分装，于37℃，5％CO2的CO2培养箱培养。
1.3MTT法测试细胞活力的步骤如下：
(1)收集对数生长期细胞，在96孔板中每孔加入100μL细胞悬液，每孔细胞数约为5×103个/孔,孔边缘用无菌PBS溶液填充。
(2)37℃，5％CO2培养箱中培养24h后加入不同浓度的绿蒜提取物，空白对照(新鲜大蒜按实施例1步骤(2)提取获得)和阳性对照药(紫杉醇)，37℃，5％CO2培养箱中孵育72h。
(3)弃去培养基，用PBS清洗一次，然后每孔加入含有0.5mg/ml的MTT 100μL，37℃，5％CO2培养箱中孵育4h。
(4)将96孔板孔内的培养基吸去，然后每孔加100μL二甲基亚砜。用酶标仪进行检测，检测波长为490nm。
细胞抑制率(％)＝【1-(受试组OD值/对照组OD值)】×100％
实验结果：
表1：本发明得到的受试物对SMMC-7721细胞抑制率的IC50值。
实验结果表明按实施例制备获得的绿蒜提取物对肝癌细胞SMMC-7721的生长具有良好的抑制作用。
实施例6
本发明绿蒜提取物对小鼠肝癌H22移植性肿瘤生长的影响。
实验目的：
检测绿蒜提取物对小鼠肝癌H22移植性肿瘤生长的影响。
实验材料：
1.受试物：实施例1、2、3、4获得的绿蒜提取物。准确称量绿蒜提取物，用0.5％的CMC-Na溶液制成浓度为15mg/mL的混悬液，在-20℃下保存，使用时用生理盐水将提取物物稀释成3，6和12mg/mL的低中高三个剂量的溶液；环磷酰胺：江苏盛迪医药有限公司(批号15101225)；0.9％氯化钠注射液(生理盐水)：河北天成药业股份有限公司(批号A15100801)；
2.试剂：DMEM培养基：Gibco(USA)，10％胎牛血清：Gibco(USA)；PBS缓冲液：Solarbio(Beijing)；MTT：Solarbio(Beijing)；其余试剂均为市售。
3.动物及瘤株：雄性昆明种小鼠，体重20±2g，共40只，动物合格证SCXK(京)2014-0004，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。鼠源性H22肉瘤细胞：购自上海细胞库。
4.仪器：CO2培养箱(BPN-80CW)：上海一恒科学仪器有限公司；超净工作台(SW-CJ-1FD)：苏州净化设备有限公司；倒置显微镜(BDS-200)：重庆奥特光学仪器有限公司。紫外分光光度计(UV-9200)：北京瑞利分析仪器厂。酶标仪(DNM-9602)：北京普朗医疗设备有限公司。
实验方法及结果：
1.受试物对H22实体瘤的抑制作用
取冻存的H22小鼠肝癌细胞，置于37℃恒温水浴中解冻，离心，收集细胞，用PBS缓冲液洗涤两次，再用PBS液重悬细胞，经ICR小鼠腹腔传3代以上，腹水长出后，在无菌条件下抽取瘤液，瘤液与生理盐水按体积比1:1的比例稀释并充分混合得到细胞悬液。用台盼兰染色后，在血细胞计数器上计数，其中活细胞数大于95％，用生理盐水调整细胞悬液的浓度为1×107个瘤细胞/mL。然后将调整好浓度的细胞悬液按0.2mL/只接种于小鼠右前肢腋窝皮下，构建实体瘤动物模型，得到H22荷瘤小鼠。接种后次日随机分组，每组8只，受试物组(低中高三个剂量)，模型组(生理盐水)和阳性对照药组(25mg/kg)。小鼠灌胃给药，每天一次，剂量0.01mL/g(给药体积/小鼠体重)连续给药给药14天，给药期间，每隔2到3天用游标卡尺测量肿瘤的最大直径a、最小直径b，按V＝1/2×a×b2计算瘤体积，绘制小鼠肿瘤生长曲线。实验结果见表2、图1；于第15天称取各小鼠的体重，摘除眼球取血，脱颈椎处死小鼠，剥离肿瘤、脾脏、胸腺并称重，按以下各式计算肿瘤抑制率、脾脏指数及胸腺指数。肿瘤拍照。实验结果见表2-4，肿瘤照片见图2。
肿瘤抑制率(％)＝(1－给药组平均瘤重/模型组平均瘤重)×100％
脾脏指数(mg/g)＝脾脏重量/体重
胸腺指数(mg/g)＝胸腺重量/体重
表2实验各组小鼠给药期间肿瘤体积
实施例1各组小鼠给药期间肿瘤体积如表2所示，图1是各组小鼠的瘤体积随观察天数的变化曲线，结果表明，本发明的绿蒜提取物能减缓小鼠移植性肿瘤的生长速度，对肿瘤的生长曲线有阻碍作用，且中剂量绿蒜提取物效果明显。
实验证明，实施例2、3、4的绿蒜提取物能减缓小鼠移植性肿瘤的生长速度，对肿瘤的生长有阻碍作用。
表3.实验各组小鼠的瘤重及肿瘤的抑制率
注：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001vs模型组；#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001vs阳性对照药组
由表3所示的实验数据可知，与模型组相比，实施例1的绿蒜提取物物对小鼠H22实体瘤有明显的抑制作用(P<0.001)，随着用药剂量的增加，抑瘤作用增强；中剂量组的抑瘤率接近阳性对照药且在三个剂量中表现出较强的抑瘤效果。
实验证明，实施例2、3、4的绿蒜提取物对小鼠H22实体瘤有明显的抑制作用。
表4.实验各组小鼠的脾脏指数和胸腺指数
注：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001vs模型组；#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001vs阳性对照药组
由表4的实验结果可知，实施例1的绿蒜提取物的中剂量提取物可以显著提高荷瘤小鼠的脾脏指数和胸腺指数，提高了小鼠的固有免疫力。
实验证明，实施例2、3、4的绿蒜提取物的中剂量可以显著提高荷瘤小鼠的脾脏指数和胸腺指数，提高了小鼠的固有免疫力。
本发明药物对荷瘤小鼠生存质量的影响
实验方法及结果：
每日测定小鼠的体重，摄食量及摄水量。计算小鼠的水食效率。摄食效率＝(增长的体重/摄食量)×100％；摄水效率＝(增长的体重/摄水量)×100％。实验结果见图3。
由图3可知，与阳性对照药相比，实施例1的绿蒜提取物可以显著提高荷瘤小鼠的水食效率(P<0.001)，很大程度地改善了荷瘤小鼠的生存质量。
实验证明，实施例2、3、4的绿蒜提取物可以显著提高荷瘤小鼠的水食效率，很大程度地改善了荷瘤小鼠的生存质量。
本发明药物对荷瘤小鼠肝脏中相关酶的影响
实验方法及结果：
测肝组织匀浆中过氧化氢(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)的活力及丙二醛(MDA)的含量。测定试剂盒购买于南京建成生物工程研究所(货号依次为：A007-1；A005；A001-3；C009-2；C010-2；A003-1)。各组小鼠肝脏中相关酶的含量如表5所示。
表5实验各组小鼠肝脏中相关酶的含量
由表5的结果可知，本发明实施例1的绿蒜提取物可以提高肝脏中抗氧化酶CAT、GSH-Px、SOD的活力，降低肝脏MDA的水平，其中，中剂量的绿蒜提取物效果最佳。另外，本发明的提取物可以显著降低肝脏中谷草转氨酶和谷丙转氨酶的活力，降低肝毒性，减少肝脏炎症的产生。与模型组相比，阳性药组小鼠肝脏中转氨酶升高，这表明化疗药环磷酰胺对肝脏有较大的毒性。
实验证明，实施例2、3、4的绿蒜提取物能提高肝脏中抗氧化酶CAT、GSH-Px、SOD的活力，降低肝脏MDA的水平，中剂量绿蒜提取物效果最佳。可以显著降低肝脏中谷草转氨酶和谷丙转氨酶的活力，降低肝毒性，减少肝脏炎症的产生。与模型组相比，阳性药组小鼠肝脏中转氨酶升高，这表明化疗药环磷酰胺对肝脏有较大的毒性。
本发明的提取物对荷瘤小鼠血清中免疫因子含量的影响
实验方法及结果：
各组小鼠停药后次日采用眼球摘除法取血，静置后离心分离血清，E L I S A法检测荷瘤小鼠血清中血管内皮生长因子(VEGF)、白细胞介素(IF-2)和肿瘤坏死因子(TNF-α)的含量，结果见表6。
表6.实验各组小鼠血清中血管内皮生长因子、白细胞介素2和肿瘤坏死因子α的含量
注：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001vs模型组；#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001vs阳性对照药组
由表6可知，本发明的实施例1绿蒜提取物可以降低肿瘤血管内皮生长因子的表达，提高白细胞介素2和肿瘤坏死因子α的表达，提高机体免疫力。
实验证明，实施例2、3、4的绿蒜提取物可以降低肿瘤血管内皮生长因子的表达，提高白细胞介素2和肿瘤坏死因子α的表达，提高机体免疫力。
实施例1荷瘤小鼠的肿瘤病理切片见图4(A-E分别代表：模型组、阳性对照药组、低剂量组、中剂量组、高剂量组)
给药组肿瘤细胞生长不如模型组活跃，部分紧密排列，部分较松散，高剂量组表现出多发灶性及大片状肿瘤组织坏死，可见较大部分凝固性坏死，肿瘤周边可见血管、纤维组织增生；少量炎细胞浸润。
实施例2、3、4的绿蒜提取物对荷瘤小鼠的肿瘤病理切片结果与实施例1结果相似。

Claims (5)

1.一种具有抗肝癌作用的绿蒜提取物的制备方法，其特征是包括如下步骤：
(1)取新鲜去皮大蒜瓣，于2-6℃下放置12天-16天，粉碎，常温放置30-60min，加入1.5-2质量倍的体积浓度为5％-6％的食品级弱酸水溶液，混匀，在40-60℃条件下加热30-40min，再在70-80℃加热30-40min，固液分离，得到绿变大蒜；
(2)向绿变大蒜中加入2-5质量倍的体积浓度为70％-80％的乙醇水溶液，在18-25℃条件下浸泡提取，提取2-4次，每次20-24h，合并提取液，浓缩至浸膏无醇味，加1-3体积倍水混悬，加入混悬液体积1-3倍的有机溶剂萃取，萃取3-4次，合并萃取液，浓缩至干得到提取物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述弱酸为醋酸、苹果酸或柠檬酸。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述有机溶剂为正己烷、石油醚和乙酸乙酯中至少一种。
4.权利要求1-3之一的方法制备的具有抗肝癌作用的绿蒜提取物。
5.权利要求4的具有抗肝癌作用的绿蒜提取物在制备保健品中的用途。
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