CN105213523B - 一种从黄连中提取有效成份的方法及该提取物的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从黄连中提取有效成份的方法及该提取物的用途。该方法包括如下步骤，(1)将黄连粉碎成粉末状；(2)一次低温水提，得一次低温水提液；(3)将一次低温水提液冷冻干燥制得水提干粉，即制得成品。优点在于，(1)本发明的方法简便，成本低廉，环保，无毒，有效的将黄连中溶于水的物质全部提取出来。该提取物的有效成份极易吸收，且稳定活性也好，同时黄连中的蛋白质、多糖等，在水解的过程中不被破坏。(2)通过本发明提取物，颜色好，水溶性好，活性强，用药量少，效果好，产量大；(3)工业生产易行，对原材料不造成浪费，一药可多用；(4)单独存放稳定性也好，易贮藏，使用方便。
Description
技术领域：
本发明涉及一种药物的提取有效成份的方法，尤其是涉及一种从黄连中提取有效成份的方法及该提取物的用途。
背景技术：
目前中药制剂的提取方法存在以下不足，(1)有些物质加热后很快被破坏，出现不可逆的反应，成为胶体物，很难溶解，用有机物才能溶解；(2)现有工艺提取出的药材，水解度低，活性低，用药量大，效果不明显，产量低。
在热带与亚热带的发展中国家，疟疾是最严重的传染病之一，据世界卫生组织报道，2008年全球有2.43亿临床疟疾病例，86.3万人因疟疾死亡。在过去很长时间里，氯喹一直是首选的一线抗疟药物，然而，随着上世纪60年代氯喹抗性虫株的出现并迅速播散，恶性疟原虫抗药性逐渐成为全球公共健康的重要问题。由于疟原虫抗药性的迅速蔓延，特别是多重抗药性恶性疟原虫不断扩散，恶性疟原虫对替代氯喹等药物药的物青蒿素类药物等的敏感性也明显下降。可供选择的抗疟药物已十分有限，与全球抗疟药巨大的需求存在明显反差。抗疟药物的研究开发周期和难度大大限制了新药的研发速度，新药的研发速度跟不上抗药性出现的速度，当前急需加强抗疟药物的研发。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种本发明涉及一种从黄连中提取有效成份的方法。
本发明的第二个目的在于提供一种从黄连中提取的有效成份用于治疗恶性疟原虫的用途。
本发明的第一个目的由如下技术方案实施：一种从黄连中提取有效成份的方法其包括如下步骤，(1)按照中药材国家标准选取黄连，并将黄连粉碎成粉末状；(2)一次低温水提：将粉碎后的黄连进行一次低温水提，即将粉碎好的黄连在4℃—20℃温度下分别用纯水浸泡4—6小时，在-30℃～-25℃下冷冻至冻实，冻实指冻成冰块，然后自然解冻，倒出浸液，过滤，得一次低温水提液；(3)将一次低温水提液冷冻干燥制得水提干粉，即制得成品。
一种从黄连中提取有效成份的方法，其还包括有如下步骤：(4)二次低温水提：经步骤(2)的一次低温水提后所得药渣进行二次低温水提，即将步骤(2)药渣再加纯水浸泡，使得药渣充分被纯水溶解后，在-30℃—-25℃冷冻至冻实，冻实指冻成冰块，然后自然解冻，倒出浸液，过滤，得二次低温水提液；(5)得二次低温水提液冷冻干燥制得水提干粉，即制得成品。
一种从黄连中提取有效成份的方法，在所述步骤(4)二次低温水提中，将步骤(2)药渣再加纯水浸泡时间优选至少2小时。
一种从黄连中提取有效成份的方法，其包括有如下步骤：将步骤(4)所得二次低温水提液与步骤(2)所得一次低温水提液混和，得到低温水提混和液，并冷冻干燥制得水提干粉，即制得成品。
一种从黄连中提取有效成份的方法，其还包括有如下步骤：(6)三次药渣一次醇提：经步骤(4)的二次低温水提后所得药渣在60％(w/w)—70％(w/w)的乙醇进行醇提至少2小时，将一次醇提液过滤，得一次醇提液；(7)四次药渣二次醇提：经步骤(6)的三次药渣一次醇提后所得药渣在60％(w/w)—70％(w/w)的乙醇进行二次醇提至少2小时，将二次醇提液过滤，得二次醇提液；(8)一次醇提水解物：将步骤(6)所得一次醇提液和步骤(7)所得二次醇提液混和，脱醇，得一次醇提水解物；(9)将步骤(8)所得一次醇提水解物至少加入一次醇提水解物重量的2倍的纯水继续脱醇，得二次醇提水解物，在0℃—6℃静置至少12小时，取静置上清液；(10)静置上清液冷冻干燥制得水提干粉，即制得成品。
一种从黄连中提取有效成份的方法，其还包括有如下步骤：将步骤(9)所得的静置上清液与步骤(2)所得一次低温水提液混和，并冷冻干燥制得水提干粉，即制得成品。
一种从黄连中提取有效成份的方法，其还包括有如下步骤：将步骤(9)所得的静置上清液与步骤(4)所得二次低温水提液混和，并冷冻干燥制得水提干粉，即制得成品。
一种从黄连中提取有效成份的方法，其还包括有如下步骤：将步骤(4)所得二次低温水提液与步骤(2)所得一次低温水提液混和，得到低温水提混和液，经超滤得滤清液和浓缩液，分别将超滤后所得滤清液和浓缩液进行冷冻干燥制得两种水提干粉，即制得两种成品。
一种从黄连中提取的有效成份用于治疗恶性疟原虫的用途。
本发明的优点在于，(1)本发明的方法简便，成本低廉，环保，无毒，有效的将黄连中溶于水的物质全部提取出来。该提取物的有效成份极易吸收，且稳定活性也好，同时黄连中的蛋白质、多糖等，在水解的过程中不被破坏。(2)通过本发明提取物，颜色好，水溶性好，活性强，用药量少，效果好，产量大；(3)工业生产易行，对原材料不造成浪费，一药可多用；(4)单独存放稳定性也好，易贮藏，使用方便。
附图说明：
图1为黄连水提(醇提)紫外吸光度图。
图2为黄连各部位的紫外吸收图。
具体实施方式
实施例1：一种从黄连中提取有效成份的方法包括如下步骤，(1)按照中药材国家标准选取黄连，并将黄连粉碎成粉末状；(2)一次低温水提：将粉碎后的黄连进行一次低温水提，即将粉碎好的黄连在4℃—20℃温度下分别用纯水浸泡4—6小时，在-30℃～-25℃下冷冻至冻实，冻实指冻成冰块，然后自然解冻，倒出浸液，过滤，得一次低温水提液；(3)将一次低温水提液冷冻干燥制得水提干粉，即制得成品。
实施例2：一种从黄连中提取有效成份的方法包括如下步骤，(1)按照中药材国家标准选取黄连，并将黄连粉碎成粉末状；(2)一次低温水提：将粉碎后的黄连进行一次低温水提，即将粉碎好的黄连在4℃—20℃温度下分别用纯水浸泡4—6小时，在-30℃～-25℃下冷冻至冻实，冻实指冻成冰块，然后自然解冻，倒出浸液，过滤，得一次低温水提液；(3)二次低温水提：经步骤(2)的一次低温水提后所得药渣进行二次低温水提，即将步骤(2)药渣再加纯水浸泡，使得药渣充分被纯水溶解后，在-30℃—-25℃冷冻至冻实，冻实指冻成冰块，然后自然解冻，倒出浸液，过滤，得二次低温水提液；(4)得二次低温水提液冷冻干燥制得水提干粉，即制得成品。将步骤(2)药渣再加纯水浸泡时间优选至少2小时。
实施例3：一种从黄连中提取有效成份的方法包括如下步骤，(1)按照中药材国家标准选取黄连，并将黄连粉碎成粉末状；(2)一次低温水提：将粉碎后的黄连进行一次低温水提，即将粉碎好的黄连在4℃—20℃温度下分别用纯水浸泡4—6小时，在-30℃～-25℃下冷冻至冻实，冻实指冻成冰块，然后自然解冻，倒出浸液，过滤，得一次低温水提液；(3)二次低温水提：经步骤(2)的一次低温水提后所得药渣进行二次低温水提，即将步骤(2)药渣再加纯水浸泡，使得药渣充分被纯水溶解后，在-30℃—-25℃冷冻至冻实，冻实指冻成冰块，然后自然解冻，倒出浸液，过滤，得二次低温水提液；在所述步骤(4)二次低温水提中，将步骤(2)药渣再加纯水浸泡时间优选至少2小时。将步骤(2)所得一次低温水提液和将步骤(3)所得二次低温水提液混和，得到低温水提混和液，并冷冻干燥制得水提干粉，即制得成品。
实施例4：一种从黄连中提取有效成份的方法包括如下步骤，(1)按照中药材国家标准选取黄连，并将黄连粉碎成粉末状；(2)一次低温水提：将粉碎后的黄连进行一次低温水提，即将粉碎好的黄连在4℃—20℃温度下分别用纯水浸泡4—6小时，在-30℃～-25℃下冷冻至冻实，冻实指冻成冰块，然后自然解冻，倒出浸液，过滤，得一次低温水提液；(3)二次低温水提：经步骤(2)的一次低温水提后所得药渣进行二次低温水提，即将步骤(2)药渣再加纯水浸泡，使得药渣充分被纯水溶解后，在-30℃—-25℃冷冻至冻实，冻实指冻成冰块，然后自然解冻，倒出浸液，过滤，得二次低温水提液；一种从黄连中提取有效成份的方法，在所述步骤(3)二次低温水提中，将步骤(2)药渣再加纯水浸泡时间优选至少2小时。(4)三次药渣一次醇提：经步骤(3)的二次低温水提后所得药渣在60％(w/w)—70％(w/w)的乙醇进行醇提至少2小时，将一次醇提液过滤，得一次醇提液；(5)四次药渣二次醇提：经步骤(4)的三次药渣一次醇提后所得药渣在60％(w/w)—70％(w/w)的乙醇进行二次醇提至少2小时，将二次醇提液过滤，得二次醇提液；(6)一次醇提水解物：将步骤(4)所得一次醇提液和步骤(5)所得二次醇提液混和，脱醇，得一次醇提水解物；(7)将步骤(6)所得一次醇提水解物至少加入一次醇提水解物重量的2倍的纯水继续脱醇，得二次醇提水解物，在0℃—6℃静置至少12小时，取静置上清液；(8)静置上清液冷冻干燥制得水提干粉，即制得成品。
实施例5：一种从黄连中提取有效成份的方法是将实施例1步骤(2)所得一次低温水提液和实施例4的步骤(7)所得的静置上清液混和，并冷冻干燥制得水提干粉，即制得成品。
实施例6：一种从黄连中提取有效成份的方法实施例2步骤(3)所得二次低温水提液和实施例4的步骤(7)所得的静置上清液混和，并冷冻干燥制得水提干粉，即制得成品。
实施例7：一种从黄连中提取有效成份的方法，将实施例2步骤(3)所得二次低温水提液与实施例1步骤(2)所得一次低温水提液混和，得到低温水提混和液，经超滤得滤清液和浓缩液，分别将超滤后所得滤清液和浓缩液进行冷冻干燥制得两种水提干粉，即制得两种成品。
实施例8：通过实施例1-7所提出制得的黄连超低温提取物微量元素的含量测定
由实施例1-7制备的黄连超低温提取物，取样品约40-200ml，在温度24℃，湿度17％，气压89kPa的环境条件下检验，测定项目：黄连超低温提取物：钾、钠、钙、镁、铜、铁、锰、锌、锶、铬、硒、钴。采用的主要仪器：凯氏定氮仪、原子吸收分光光度计、原子荧光光度计、UV2300、荧光分光光度计。
黄连超低温提取物微量元素的含量测定
| 元素 | 1# | 2# | 3# | 4# | 5# | 6# | 7# |
| K钾 | 13296.3 | 17740.7 | 10792.6 | 12355.5 | 11789.6 | 15647.3 | 14566.2 |
| Ca钙 | 3745 | 4436 | 2916 | 3568 | 4125 | 3500 | 3145 |
| Na钠 | 330.3 | 383.2 | 160.7 | 340.2 | 268.4 | 369.4 | 290.5 |
| Mg镁 | 5329 | 7372 | 5502 | 5698 | 7045 | 5809 | 6988 |
| Se硒 | 3.838 | 3.033 | 3.021 | 3.455 | 3.156 | 3.098 | 3.826 |
| Cr铬 | 33.24 | 24.09 | 15.09 | 18.36 | 22.36 | 31.25 | 25.68 |
| Co钴 | 1.774 | 1.541 | 1.539 | 1.695 | 1.468 | 1.741 | 1.642 |
| Sr锶 | 21.27 | 22.34 | 19.02 | 20.36 | 22.65 | 21.55 | 19.58 |
| Cu銅 | 25.68 | 20.40 | 30.19 | 23.56 | 29.32 | 27.25 | 21.22 |
| Fe铁 | 76.15 | 19.24 | 20.97 | 56.23 | 33.25 | 45.36 | 28.65 |
| Mn锰 | 489.8 | 685.4 | 500.7 | 623.1 | 484.8 | 588.9 | 512.5 |
| Zn锌 | 256.9 | 346.2 | 288.9 | 298.2 | 312.5 | 336.1 | 297.5 |
实施例9：由实施例1-7所获得的从黄连中提取的有效物用于治疗恶性疟原虫的用途。
1.恶性疟原虫体外连续培养
1.1 虫株来源
恶性疟原虫株采用云南省寄生虫病防治所实验室训化的恶性疟原虫FccSM/YN株(采自云南思茅，位于中老、中缅边境地区的恶性疟患者)。按Trager等蜡烛缸培养法，建立体外传代培养，实验室长期保种。
1.2 虫株复苏
1.2.1 解冻虫株：从液氮中取出一株恶性疟原虫感染血标本，迅速置于37℃恒温水浴锅内，使其充分解冻。
1.2.2 洗脱冻存液：解冻后在Ⅱ级生物安全柜上迅速将虫血转移入15ml无菌离心管，用移液枪加入F1200ul,边加边混匀，静置5min后，加入F25ml，边加边混匀静置5min，再加入F35ml，边加边混匀，静置5min后置于台式离心机上，1500rpm/min离心5min。
1.2.3 洗涤：离心后弃上清，加入不完全培养液至10ml，混匀，在1500rpm/min离心5min，弃上清液。
1.3 虫株培养
将剩余的虫血转移入无菌培养瓶内，加入10ml完全培养液、1ml血清和1ml50％RBC悬液。轻轻摇匀，置于玻璃干燥器内，将其蜡烛点燃，等待蜡烛将熄灭时，关闭活塞。置于37℃恒温培养箱内，每24小时(h)更培养液1～2次，每3～4天添加一次50％RBC悬液，每天或者隔天取血样一次，涂制厚、薄血片，吉氏染色后显微镜下检查1000～5000个红细胞，计算红细胞感染率，观察疟原虫的繁殖情况及形态变化。
2.疟原虫同步化处理
选择原虫密度较高且环状体较多的生长阶段，将培养物移至刻度离心管中，1500rpm/min离心10min，吸弃上清液，于沉积细胞中加入5倍体积的5％山梨醇溶液(即0.274mol/L)，充分混匀，静置10min，1500rpm/min离心10min,吸弃上清液及上层棕色沉淀，加入至少2倍体积的不完全培养基，充分混匀，同上离心，弃去上清，加等体积完全培养基和2～3倍体积50％的RBC悬液，用完全培养基将培养物稀释约为8％的细胞悬液后，完全转入培养瓶，放于蜡烛缸，恒温箱培养。48h(一个生活史周期)后涂片观察，同步满意(疟原虫环状体达到95％)可以进行测定。同步不满意可以再进行一次同步化处理。
3.体外抗疟作用测定
3.1 测试采用Rieckmann体外微测量法[8]。选择同步化处理好的疟原虫，在环状体期将其原虫密度稀释到20000-60000个/μl血,加5倍完全培养基稀释,混匀后加入测定板各药井,加样顺序:先加对照，再从低浓度#至高浓度#，每个药物浓度同时测定2组。每#加样50μl。记录虫株和加样时间，在37℃±1℃恒温箱中培养20小时后预收(涂厚血膜)对照#，对照#3个核和3核个以上裂殖体大于20％,可以收获,反之继续培养，再预收，直至成功收获。如果培养时间超过48小时，3个核和3个核以上裂殖体仍小于10％，视为测定失败。收获时，取出测定板，各井分别取血(弃上清液后取血涂片，顺序由高浓度药井到低浓度药井)涂制厚血膜(一行均在同1张载玻片上按顺序涂制12个厚血膜)。最后涂制对照井血膜。在收虫的载玻片上做上标记，标明虫株、药板种类和收获时间。
4.计数
收获的标本片，待血膜充分干燥后，用3％的吉姆萨染液染色15-20分钟，水洗后晾干。采用盲法，请2名不知情疟原虫镜检专家，在不同地点或者不同时间，在油镜下计数。计数每个厚血膜中500个无性体原虫范围内3个核和3个核以上裂殖体数作为测定结果，并及时记录在相关表格中。
5.统计处理
2次(行)测定结果合计后，以对照#为基数，计算各浓度#中的裂殖体抑制率〔(1－各#中的裂殖体数/对照#数)×100％〕，用ICEstimator software软件处理，计算50％疟原虫抑制量(IC50)、95％抑制量(IC95)、99％抑制量(IC99)以及95％可信区间。如上述提取物无抗疟作用，则无法计算各浓度#中的裂殖体抑制率和计算IC50以及IC5095％可信区间。
结果
1 疟原虫在实施例1-7提取物浓度#中发育至裂殖体数与抑制率见表1。实施例1-7所获得的提取物2次测定结果基本相同，对照#中有38.1％(381/1000)的疟原虫发育至裂殖体，0.8mg/#以下浓度裂殖体抑制率均为0，1.6mg/#抑制率达94％，3.2mg/#抑制率以上#达95％以上，但均达到100％，这与实验室培育的疟原虫发育不同步，虽然经过同步处理，也不只能清除95％的裂殖体，仍然残存5％左右的裂殖体有关。
表1 疟原虫在实施例1-7所获得的提取物浓度#中发育至裂殖体数与抑制率(％)
2 实施例1-7提取物IC50-IC99以及95％可信区间见表2。实施例1-7提取物的IC50为38.18±2×1.76，IC99为60.45±2×2.79。
表2 实施例1-7提取物对恶性疟原虫IC50、IC99以及IC50的95％可信区间
讨论与小结
1 本研究结果只反映实施例1-7提取物对体外培养恶性疟原虫红血球内期无性体作用(活性)，不代表其它生活期和其他疟原虫的作用。
2 研究结果显示：实施例1-7提取物对恶性疟原虫红血球内期无性体有一定作用，
3 表2结果显示实施例1-7提取物抑制或者杀灭99％疟原虫的浓度为60.45mg/L，如果以一个成人5升血液计算，可能只要300mg(60.45mg×5)就可以抑制或者杀灭疟原虫，其作用与当今抗疟作用最好的青蒿素类(青蒿琥酯)相似，但比青蒿素类以外的抗疟药作用强。该提取物值得进一步研究。
Claims (9)
1.一种从黄连中提取有效成份的方法，其特征在于，其包括如下步骤，(1)按照中药材国家标准选取黄连，并将黄连粉碎成粉末状；(2)一次低温水提：将粉碎后的黄连进行一次低温水提，即将粉碎好的黄连在4℃—20℃温度下分别用纯水浸泡4—6小时，在-30℃～-25℃下冷冻至冻实，冻实指冻成冰块，然后自然解冻，倒出浸液，过滤，得一次低温水提液；(3)将一次低温水提液冷冻干燥制得水提干粉，即制得成品。
2.根据权利要求1所述的一种从黄连中提取有效成份的方法，其特征在于，其还包括有如下步骤：(4)二次低温水提：经步骤(2)的一次低温水提后所得药渣进行二次低温水提，即将步骤(2)药渣再加纯水浸泡，使得药渣充分被纯水溶解后，在-30℃—-25℃冷冻至冻实，冻实指冻成冰块，然后自然解冻，倒出浸液，过滤，得二次低温水提液；(5)得二次低温水提液冷冻干燥制得水提干粉，即制得成品。
3.根据权利要求2所述的一种从黄连中提取有效成份的方法，其特征在于，在所述步骤(4)二次低温水提中，将步骤(2)药渣再加纯水浸泡至少2小时。
4.根据权利要求2或3所述的一种从黄连中提取有效成份的方法，其特征在于，其包括有如下步骤：将步骤(4)所得二次低温水提液与步骤(2)所得一次低温水提液混和，得到低温水提混和液，并冷冻干燥制得水提干粉，即制得成品。
5.根据权利要求2所述的一种从黄连中提取有效成份的方法，其特征在于，其还包括有如下步骤：(6)三次药渣一次醇提：经步骤(4)的二次低温水提后所得药渣在60％(w/w)—70％(w/w)的乙醇进行醇提至少2小时，将一次醇提液过滤，得一次醇提液；(7)四次药渣二次醇提：经步骤(6)的三次药渣一次醇提后所得药渣在60％(w/w)—70％(w/w)的乙醇进行二次醇提至少2小时，将二次醇提液过滤，得二次醇提液；(8)一次醇提水解物：将步骤(6)所得一次醇提液和步骤(7)所得二次醇提液混和，脱醇，得一次醇提水解物；(9)将步骤(8)所得一次醇提水解物至少加入一次醇提水解物重量的2倍的纯水继续脱醇，得二次醇提水解物，在0℃—6℃静置至少12小时，取静置上清液；(10)静置上清液冷冻干燥制得水提干粉，即制得成品。
6.根据权利要求5所述的一种从黄连中提取有效成份的方法，其特征在于，其还包括有如下步骤：将步骤(9)所得的静置上清液与步骤(2)所得一次低温水提液混和，并冷冻干燥制得水提干粉，即制得成品。
7.根据权利要求5所述的一种从黄连中提取有效成份的方法，其特征在于，其还包括有如下步骤：将步骤(9)所得的静置上清液与步骤(4)所得二次低温水提液混和，并冷冻干燥制得水提干粉，即制得成品。
8.根据权利要求4所述的一种从黄连中提取有效成份的方法，其特征在于，其还包括有如下步骤：将步骤(4)所得二次低温水提液与步骤(2)所得一次低温水提液混和，得到低温水提混和液，经超滤得滤清液和浓缩液，分别将超滤后所得滤清液和浓缩液进行冷冻干燥制得两种水提干粉，即制得两种成品。
9.根据权利要求1-8任一所述的一种从黄连中提取的有效成份用于制备治疗恶性疟原虫的药物用途。
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