CN114316085A - 一种顺式透明质酸六糖及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种顺式透明质酸六糖及其制备方法和用途。本发明用现代生物医药技术，制备得到了顺式透明质酸六糖，用现代光谱学技术确定了顺式透明质酸六糖的结构及其构型。药学生物学研究证明，该化合物具有较好的抑制细胞凋亡、提高免疫等活性，是一个潜在的新医药原料。

Description

一种顺式透明质酸六糖及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于新医药技术领域。具体地说，属于新医药原材料技术领域。

技术背景

透明质酸(hyaluronic acid，简称HA)，俗称玻尿酸。2021年预计国内透明质酸市场销量在500吨左右，主要用在食品、保健品和化妆品上，作为药物应用只占很小的市场份额。

透明质酸是分子量在1万～220万道尔顿的混合物。资料表明，分子量为120万道尔顿的透HA具有血管新生抑制作用。

[High molecular weight hyaluronic acid inhibits advanced glycationendproduct-induced NF-kappaB activation and cytokine expression.Neumann A，Schinzel R，Palm D，Riederer P， Munch G.FEBS Lett 1999 Jun 25；453(3)：283-7；Feinberg RN， Beebe DC.Hyaluronate in vasculogenesis.Science 220：1177-1179，1983.]。而分子量为50万道尔顿以下的透明质酸具有与此相反的活性[Noble PW， McKeeCM，Cowman M，Shin HS.Hyaluronan fragments activate an NF- kappaB/I- kappaBalpha autoregulatory loop in murine macrophages.J Exp Med 183：2373-2378，1996.；West DC，Shaw DM.Tumour hyaluronan in relation to angiogenesis andmetastasis.In：Laurent TC， ed.The chemistry biology and medical applicationsof hyaluronan and its derivative s.London：portland press，1998：227.]。为此，深入研究透明质酸的构效关系显得十分必要。

由于透明质酸分子量大，且分子量组成杂乱，给透明质酸结构研究和质量研究带来了很大的困难，制约了该领域的技术进步。用现代药物化学和药理学手段，研究其结构和生物活性的关系，是本发明的目的。

本发明涉及一个化合物：顺式透明质酸六糖(Cis-HA6)；本发明还涉及以 Cis-HA6作为有效成分的药品，特别是细胞死亡抑制剂、细胞障碍抑制剂，或皮肤的保护剂、皮肤损伤的修复剂；本发明还涉及以Cis-HA6作为有效成分的保健品、化妆品、(人或宠物的)食品等。本发明Cis-HA6的结构如下：

其，中文名为：Cis-4，5-脱水-β-D-吡喃葡糖糖醛酸基-(1→3)-2-(乙酰胺基)-2-去氧-β-D-吡喃葡糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡糖醛酸基-(1→3)-2-(乙酰胺基)-2-去氧-β-D-吡喃葡糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡糖糖醛酸基-(1→3)-2-(乙酰胺基)-2-去氧-α-D-吡喃葡糖。

英文为：Cis-4，5-dehydrate-β-D-glucopyranuronosyl-(1→3)-2-(acetylamino)-2-deoxy-β-D-hexopyranosyl-(1→4)-β-D-glueopyranuronosyl- (1→3)-2-(acetylamino)-2-deoxy-β-D-hexopyranoseyl-(1→4)-β-D- glucopyranuronosyl-(1-→3)-2-(acetylamino)-2-deoxy-α-D-hexopyranose

简称：Cis-HA6

发明内容

本发明涉及一个顺式不饱和透明质酸六聚糖化合物(Cis-HA6)。发明人用现代生物医药技术制备得到Cis-HA6，用现代光谱学技术，首次确定了该化合物分子结构及其构型。

本发明的目的在于提供将Cis-HA6作为有效成分的药品、食品或化妆品的原料，特别是，提供良好的细胞凋亡或细胞障碍抑制剂。提供细胞、组织和皮肤的保护与修复剂等。

本发明的另一个目的，在于提供将Cis-HA6作为有效成分的化妆品和保健品和食品等的应用。

本发明还涉及到了Cis-HA6制备方法。

本发明还涉及到了Cis-HA6生物学研究方法和实验结果。

下面详细说明本发明的过程和结果。

一、Cis-HA6制备。我们将HA(购自：山东安华生物医药股份有限公司)用该技术领域已经知晓的酶切法进行有效的剪切，然后用Sephadex G-20(Pharmacia公司)层析技术进行有效分离，的到化合物单体化合物Cis-HA6。

二、Cis-HA6结构鉴定：Cis-HA6为微黄色粉末。10％EtOH-H₂SO₄检验呈红黑色(加热)，表明有糖的反应存在。质谱确定其分子量为1137.3道尔顿，m/z[M-H]。紫外光谱 210nm和232nm出有两个吸收带，前者为透明质酸的紫外吸收特征，后者为Cis-HA6 的吸收特征峰。经过C¹³NMR(碳谱)、H¹NMR(氢谱)、¹H-¹H NOESY(氢-氢相关谱)，¹H-¹³C QC(碳-氢相关谱)，¹H-¹³C HMBC(碳-氢远程相关谱)，¹³C DEPT(改变照射碳谱)，、HPLC(液相色谱)等光谱学的研究，解析确定其分子结构(如上)。Cis- HA6的C和H归属见表1。

三、纯度和分子量

A.纯度检查

仪器试剂：HPLC-LC-10A色谱系统(岛津仪器，苏州，有限公司)；色谱柱：氨基硅胶键合色谱柱，250x4.6mml.D.S-5μm，美国YMC公司；乙腈，美国MREDA；样品： Cis-HA6。

以5％～50％乙腈水为流动相；流速0.5～1mL/min；检测波长为210nm，柱温：30℃。HPLC参数：流速设置：控制流速为0.5-1ml/min，检测波长设置：210nm。称取Cis- HA6 1mg溶解于2ml流动相中，精密取样5μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果表明Cis-HA6纯度达到98％(百分面积法)。如附图1所示。

B.分子量测定

仪器：Waters Acquity UPLC

离子方式：ESI。

质谱条件：雾化压力30psi，脱气剂气流50L/h，温度400℃，负离子。将Cis- HA6溶解于甲醇，进行ESI-MS测试，Cis-HA6分子量为1137.3m/z[M-H]。如附图2 所示。

四、核磁¹³C和¹H归属

仪器：AVANCE IIIHD 600(德国Bruker公司)超导核磁共振波谱仪

将Cis-HA6 1～2mg溶解于D₂O，记录C¹³NMR、H¹NMR、¹H-¹H NOESY，¹H-¹³C QC，¹H-¹³CHMBC，¹³C DEPT谱，综合解析，确定其各糖C和H的归属。结果：如表1。

表1 Cis-6HA的¹³C-NMR和¹H-NMR归属(D₂O，600MHz)

五、Cis-HA6中VI端基H₁的构型

1 偶合常数。资料表明，吡喃糖端基H₁为β构型时，¹H-NMR(600M HzD₂O)端基H₁与H₂间的偶合常数J＝8Hz左右；当吡喃糖端基H₁为α构型时，端基氢H₁与H₂间的偶合常数为J＝4Hz左右^[1，2]。本发明Cis-HA6中VI端基氢H₁和H₂之间的偶合常数为J＝4.80Hz，与α构型相吻合^[3](参见图2.)。

当换用溶剂，¹H-NMR(600M Hz in pyridine-D₅)谱中，本化合物端基H₁与H₂的偶合常数为4.46Hz，进一步支持端基H₁为α构型型^[4-7]。

2 NOESY数据。

在本发明¹H-¹H NOESY谱中，Cis-HA6中VI端基H₁和H₂之间出现显著的NOE效应(见附图7)，证明H₁和H₂之空间距离＜0.27nm^[8]。进一步支持Cis-HA6中VI端基H₁为为α构型。

3 C¹³核磁数据。

MaryK.Cowman等人^[12]深入研究了类似化合物透明质酸的核磁C¹³。将Cis-HA6中VI的C¹³化学位移数据进行比较(见表2)，与α构型吻合，进一步佐证Cis-HA6中VI的端基 H₁为α构型。

表2.Cis-HA6中VI的C¹³核磁数据比较

位置	β构型(ppm)		α构型(ppm)	VI(ppm)
					C<sub>1</sub>	97.40		93.72	91.01
C<sub>2</sub>	58.29		55.65	55.93
					C<sub>3</sub>	85.02		82.56	82.65
C<sub>4</sub>	71.11		71.12	71.26
					C<sub>5</sub>	78.05		73.93	73.53
C<sub>6</sub>	63.40		63.24	66.07

综上所述，Cis-HA6的¹³C-NMR和¹H-NMR及其相关的二维谱，均数据支持VI 端基H₁为α构型。如下所示。

六、Cis-HA6中I的H₄构型

1 偶合常数。资料表明，类似化合物H-H顺式时偶合常数J＝4Hz左右，为反式结构时H-H的偶合常数J＝＞10Hz^{[9，10，11]}，本发明Cis-HA6中I的¹H-NMR(600M Hz in D₂O)H₄与H₅间的偶合常数为J＝4.2Hz，表明为顺式结构。

2 NOESY数据。在本发明化合物的NOESY谱中，H₄与H₅间检测强的NOE效应(见附图7)，表明H₄与H₅间的两个质子的空间距离非常接近^[8]，即为环的同侧。进一步支持Cis- HA6中I的H₄为顺式结构。

以上研究数据表明，Cis-HA6中I的H₄为顺式结构。如下所示。

综上所述，我们首次确定了Cis-HA6分子结构及其空间构型，它是一个新化合物。

附图说明

图1为Cis-HA6的HPLC色谱图。

图2为Cis-HA6的MS图谱。

图3为Cis-HA6de ¹H-NMR谱图。

图4为Cis-HA6的¹³C-NMR谱图。

图5为Cis-HA6的¹³C-¹H QC相关谱图。

图6为Cis-HA6的¹³C-¹H BC相关谱图。

图7为Cis-HA6的¹H-¹H NOESY相关谱图。

图8为Cis-HA6的¹³C DEPT谱图。

图9为Cis-HA6对人上皮细胞增殖的影响的曲线图。

具体实施方式

下面是实施例。

实施例1

Cis-HA6的制备方法一

用枯草(芽孢)杆菌酶(CAS：12211-28-8，SIGAMA公司)制备Cis-HA6。

将50g HA样品(购自：山东安华生物医药股份有限公司)溶解在5～10升蒸馏水中，滤膜过滤除菌(防止在降解的过程有副产物)中，加入各种底物配成培养液 (培养液配方：W/W蛋白胨0.3～3％，酵母粉0.3～3％，磷酸二氢钾0.05～0.2％，硫酸镁0.05～0.20％，葡萄糖0.5～2.5％，PH＝6～8)，接种枯草(芽孢)杆菌酶(CAS： 12211-28-8，SIGAMA公司)溶液，酶活1.3x10⁶IU/ml，接种量为种子培养液(参考专利申请号：201210317032.5公开的方法)占培养液的5～10％，将培养液置于 37～47℃恒温，反应4～6小时，降解过程中用HPLC检测，观测化合物Cis-HA6最多时发酵停止，加热至80℃使酶变性失活，得到酶解液(参考专利申请号： 201210317032.5公开的方法)。

反应之后，酶解液以5000rpm离心分离20分钟后回收上清液，在用200目滤材离心过滤，将的上清液上样到柱床为φ2×L100cm装有强碱性阴离子交换树脂I 型(阴离子交换基三甲基铵甲基，DIAION系列)层析柱子，通过NaCl浓度梯度 0.01M～0.50M洗脱，用HPLC检测(见：三、纯度和分子量)，反复制备。收集的流份用Sephadex G-20(Pharmacia制造；柱床φ2×L100cm)进行分离纯化，然后冰冻干，得到Cis-HA6 1.23g。

实施例2

Cis-HA6的制备方法二

用利用软骨素酶AC-1制备Cis-HA6制备。

将HA(购自：山东安华生物医药股份有限公司)10g用100～200毫升水溶解，过滤除菌，加入各种底物配成培养液(培养液配方：W/W蛋白胨0.3～3％，酵母粉0.3～3％，磷酸二氢钾0.05～0.2％，硫酸镁0.05～0.20％，葡萄糖0.5～2.5％， PH＝6～8)，接种软骨素酶AC-1(CAS：9047-57-8，SIGAMA公司)，酶活35-56IU/ml 接种，接种量为种子培养液占培养液的5～10％，将培养液置于37～47℃恒温，反应 4～6小时，降解过程中用HPLC检测，观测化合物Cis-HA6最多时发酵停止，加热至 80℃使酶变性失活，得到酶解液。

反应之后，酶解液以5000rpm离心分离20分钟后回收上清液，在用200目离心过滤，将的上清液上样到柱床为φ5×L100cm装有强碱性阴离子交换树脂I型(阴离子交换基三甲基铵甲基，DIAION系列)层析柱子，通过NaCl浓度梯度0.01M-0.50M 洗脱，用HPLC检测(见：三、纯度和分子量)。收集不同流份，用Sephadex G- 20(Pharmacia制造；柱床φ2×L100cm)进行分离纯化，然后后冰冻干，Cis-HA6 168mg。

实施例3

Cis-HA6的制备方法三

利用裂解酶HyaL16-3(中国科学院微生物研究所，菌株编号CGMCC NO.12351)制备Cis-HA6。

将HA(购自：山东安华生物医药股份有限公司)10g用100～200毫升水溶解，过滤除菌，加入各种底物配成培养液(培养液配方：W/W蛋白胨0.3～3％，酵母粉 0.3～3％，磷酸二氢钾0.05～0.2％，硫酸镁0.05～0.20％，葡萄糖0.5～2.5％， PH＝6～8)，接种裂解酶HyaL16-3降解，酶活4125-5313IU/ml IU/ml，接种量为种子培养液占培养液的5～10％，将培养液置于37℃恒温，反应4～6小时小时，降解过程中用HPLC检测，观测化合物Cis-HA6最多时发酵停止，加热至80℃使酶变性失活，得到酶解液。

反应之后，酶解液以5000rpm离心分离20分钟后回收上清液，在用200目离心过滤，将的上清液上样到柱床为φ5×L100cm装有强碱性阴离子交换树脂I型 (阴离子交换基三甲基铵甲基，DIAION系列)层析柱子，通过NaCl浓度梯度 0.01M-0.50M洗脱，用HPLC检测(见：三、纯度和分子量)。收集不同流份，用Sephadex G-20(Pharmacia制造；柱床φ2×L100cm)进行分离纯化，然后后冰冻干，Cis-HA6 221mg。

实施例4

Cis-HA6对免疫系统的作用

A.抗体生成细胞(PFC)影响

取灌胃法，每日灌胃一次，对照组灌蒸馏水。各组小鼠连续给予受试物4周后，测定各项指标。腹腔注射0.2mL 2％(V/V)SRBC免疫每只小鼠。5d后，取小鼠脾脏制成细胞浓度为5×10⁶个/ml的脾细胞液。溶解琼脂糖制成1％的溶液，于48.0℃水浴保温，与等量2倍浓度的Hank’s液混合，分装至小试管中。每管0.50mL，加入 0.050mLl0％SRBC和0.010mL脾细胞悬液，迅速混匀，倾倒在玻片上。于37.0℃恒温箱中温育1h，将补全体加在玻片槽中，再温育1.5h，计数空斑。结果见表3.

表3 Cis-HA6对正常小鼠PFC的影响(X±SD)

*：与对照相比较有显著性差异(p＜0.05)

**：与对照相比较有非常显著性差异(p＜0.01)

由表3可见，Cis-HA6经口给予小鼠不同剂量的受试物4周后，与对照相比较，低、中、高剂量组的PFC数量与对照组比较差别显著或非常显著。

实施例5

Cis-HA6的抗氧化作用

采用Schaal法^[13]，分别称取样品Cis-HA6，HA(购自：山东安华生物医药股份有限公司)和维生素C，配制用70％的乙醇溶解的样品0.25～0.5mg/ml(测试液)，然后用定容至20ml容量瓶中，过滤后，将其加入到装有20g食用花生油的碘量瓶中，置于65℃烘箱中培养24小时。每间隔24小时测定一次过氧化值(POV)，连续检测 6次，每组平行做三份样品取其平均值，以空白的使用油作为空白对照组。过氧化值得测定按照GB/T5009.37-1996。

计算公式：POV(meq/kg)＝(S×N)/W×1000

式中，POV为食用花生油的过氧化值，S为消耗的Na₂S₂O₃的毫升数，N为Na₂S₂O₃的摩尔浓度(mol/L)；W为测试样品的重量(g)，结果见表4.

表4样品的POV值(meq/kg)

从表4可见，随着时间的增长，食用花生油POV值逐渐增大，说明被氧化的越严重，相反，其POV数值约小说明抗氧化的作用越强。表2表明，Cis-HA6的抗氧化作用比HA和VC强一倍左右。

实施例6

Cis-HA6的保湿作用

测试Cis-HA6对人皮肤的水量。以HA(购自：山东安华生物医药股份有限公司) 和水溶液作为对照。随机挑选20人，男女各半，年龄相近30-40岁，经过初步筛选，选择皮肤水分相似或相近的人员入选。

采样方法：配制一定浓度溶液涂抹，取样配制2～5％溶液，取0.5ml涂抹于受试者小臂内侧皮肤约2cm²。大约30分钟后用皮肤水分测试仪(德国Courage+Khazaka 型号：CM825-MDD)测试皮肤水分含量。分别在30、60、90、120、150分钟后测试皮肤角质层水分。测试结果见表5。

结论 实验结果标明：HA Cis-HA6均具有一定的保湿效果，可以形成一层保水透气的软膜，羟基增加了这层软膜的结合水能力，相当于在皮肤角质层形成了一层“含水层”，这个“含水层”能够有效锁护皮肤角质层中的水分含量，从而保持皮肤的湿润。Cis-HA6的保湿效果明显的好于HA。

表5 Cis-HA6的保湿效果

**：与HA组相比较有非常显著性差异(p＜0.01)

实施例7

Cis-HA6对人内皮细胞(Human Umbilicai Vein Endothelial Cells，简称HUVEC)增殖的影响，可表现为血管生成、正常组织生长和愈合等过程中发挥十分重要的作用，本发明评价了Cis-HA6对上皮细胞增殖的影响，以期发现其对创伤愈合、皮肤护理等领域新的应用前景。

药物试剂：Cis-HA6；，HA(又名：玻尿酸，购自山东安华生物医药股份有限公司)；胰酶细胞消化液(碧云天生物技术研究所)；96孔细胞培养板，Coming，美国；人静脉内皮细胞(EA.hy926，中科院上海细胞库)。

接种：EA.hy926细胞用消化液消化EA.hy926细胞，消化完成后细胞悬浮于含 10％FBS的培养基中，将细胞接种于96孔细胞培养板中，每孔100ul。接种完成后，将细胞置37℃、5％CO₂培养箱中培养。

加药孵化：细胞培养24h后Cis-HA6和HA(玻尿酸)药品浓度分别为5、10、 20、40、80mg/ml的最终浓度用培养基稀释。阴性对照组不加药物，每种处理做6个

检测：取出培养板，避光条件下每孔加入5mg/mL的MTT溶液20ul，置37℃、 5％C02培养箱中孵育4h后，测定各孔光吸收值，492nm检测，按照下式计算RGR，结果如图9。

RGR(％)＝Ac/Av₀×100％

式中，Ac为样品吸光度，Aco为阴性对照组吸光度。

从图9可以看出，Cis-HA6具有明显的促进人上皮细胞(HUVEC)的增殖作用，在40mg/ml增殖率达到259％，后随着剂量的增加趋于平坦。而比较组HA则没有显的增殖效果。

血管生成是在原有血管网上形成新生血管的复杂过程。血管生成在伤口的愈合、皮肤养护等具有重要的生物学意义。血管生成的影响的药物，可作为细胞凋亡或细胞障碍的抑制剂。并可作为细胞、组织和皮肤的修复与保护剂。

参考文献：

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Claims (7)

1.具有式A结构的化合物。该化合物名称如下：

中文系统名：Cis-4，5-脱水-β-D-吡喃葡糖糖醛酸基-(1→3)-2-(乙酰胺基)-2-去氧-β-D-吡喃葡糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡糖醛酸基-(1→3)-2-(乙酰胺基)-2-去氧-β-D-吡喃葡糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡糖糖醛酸基-(1→3)-2-(乙酰胺基)-2-去氧-α-D-吡喃葡糖。

英文系统名：Cis-4，5-dehydrate-β-D-glucopyranuronosyl-(1→3)-2-(acetylamino)-2-deoxy-β-D-hexopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranuronosyl-(1→3)-2-(acetylamino)-2-deoxy-β-D-hexopyranoseyl-(1→4)-β-D-glucopyranuronosyl-(1→3)-2-(acetylamino)-2-deoxy-α-D-hexopyranose.

通用名：顺式透明质酸六糖

简称：Cis-HA6

2.含有权利要求1的式Cis-HA6化合物，在制备细胞死亡抑制剂、细胞障碍抑制剂、及细胞和组织、皮肤保护剂的药物、化妆品和食品。

3.含有权利要求1的式Cis-HA6化合物的免疫增强剂的药物、化妆品和食品(包括宠物食品)。

4.含有式Cis-HA6化合物作为细胞死亡抑制剂药物、细胞障碍抑制剂药物、细胞和组织和皮肤保护剂的药物、化妆品和食品。

5.含有式Cis-HA6化合物作为改善免疫的药物、食品(包括宠物食品)和化妆品。

6.根据权利3和4，时正常人的用量范围是：1～600毫克/公斤体重/次，优选范围是0.5～300毫克/公斤体重/次。宠物使用的剂量是人的2～10倍。

7.根据权利要求3和4的定义，含式Cis-HA6化合物与药学可接受的载体或赋形剂，制备口服剂、注射剂、缓释剂、皮肤涂抹剂、和长效剂等药物组合物的方法。

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