CN114574532B

CN114574532B - 一种透明质酸二四六糖的制备方法

Info

Publication number: CN114574532B
Application number: CN202210317542.6A
Authority: CN
Inventors: 戴跃锋; 伍陵; 宋保平; 毕延凯
Original assignee: Syoung Cosmetics Manufacturing Co Ltd
Current assignee: Syoung Cosmetics Manufacturing Co Ltd
Priority date: 2022-03-29
Filing date: 2022-03-29
Publication date: 2024-05-14
Anticipated expiration: 2042-03-29
Also published as: CN114574532A

Abstract

本发明提供了一种透明质酸二四六糖单体的制备方法，包括以下步骤：A)将透明质酸、水和透明质酸酶进行酶解，再进行高温灭活，得到酶解液；B)将所述酶解液于LXT‑298层析柱中吸附，再进行洗脱，得到透明质酸二糖洗脱收集液、透明质酸四糖洗脱收集液和透明质酸六糖洗脱收集液；C)将透明质酸二糖洗脱收集液、透明质酸四糖洗脱收集液和透明质酸六糖洗脱收集液分别进行纳滤浓缩，再分别进行喷雾干燥，分别得到透明质酸二糖、透明质酸四糖和透明质酸六糖。本申请提供的制备方法可制备出高纯的透明质酸二糖、透明质酸四糖和透明质酸六糖。

Description

一种透明质酸二四六糖的制备方法

技术领域

本发明涉及透明质酸技术领域，尤其涉及一种透明质酸二四六糖的制备方法。

背景技术

透明质酸(hyaluronic acid，HA)是一种酸性黏多糖，广泛存在于动物组织细胞间质中，于1934年由Karl Meyer和John Plamer首次从牛眼睛玻璃体中提取得到。HA是由N-乙酰氨基葡糖和D-葡糖醛酸双糖重复单位通过β-(1→4)糖苷键和β-(1→3)糖苷键构成的无分支高分子糖胺聚糖，在低浓度的水溶液中，HA分子呈单螺旋状态，且以多种对称体存在，如二折体(即分子链中每一螺旋含2个双糖)、三折体或四折体；当HA达到一定浓度时，HA分子间相互作用形成双螺旋结构，浓度更高时形成网状结构。

HA以其独特的分子结构和理化性质在机体内显示出多种重要的生理功能，如润滑关节、调节血管壁的通透性、调节蛋白质、水电解质扩散及运转以及促进创伤愈合等。尤为重要的是，HA具有特殊的保水作用，是目前发现的自然界中保湿性最好的物质，被称为理想的天然保湿因子，由于HA具有良好的保湿性、粘弹性、渗透性和延展性，同时无任何免疫原性和毒性，被广泛应用于化妆品、食品和医药等行业领域。

根据文献研究表明，分子量大小对HA的生物活性影响较大，不同分子量范围的HA表现出截然不同的生理学功能。高分子量的HA(Mr>2×10⁶)由于具有较好的粘弹性、保湿性、抑制炎性反应以及润滑等功能，可应用于高端化妆品行业、眼科手术黏弹剂和关节腔内注射治疗。中等分子量的HA(Mr介于1×10⁵-10⁶)具有良好的保湿性、润滑和药物缓释作用，可广泛用于化妆品、滴眼液、皮肤烧伤愈合及术后防粘连。低分子量的HA和寡聚透明质酸(o-HAs)，表现出非常强的生物活性，具有抑制肿瘤扩散、促进创伤愈合、促进骨和血管生成、免疫调节等作用，且易于渗透到真皮中，作为免疫细胞、细胞因子的激活剂。小分子透明质酸(包括o-HA单体)在食品保健、化妆品以及临床医疗领域具有广阔的应用前景。

目前，制备o-HAs的主要方法有物理降解法、化学降解法和酶解法。物理法主要有加热、辐照等手段；该方法制备的o-HAs产品稳定性较差。而化学法则常使用水解法和氧化降解法，这当中可能会引入一些化学试剂，易给o-HAs的性质和产品质控带来影响。而酶解法则是使用特定的酶，使得HA中的糖苷键发生断裂，以获得o-HAs。使用特定的酶可以提高剪切糖苷键的专一性，得到纯分子量分布集中且纯度较高的o-HAs。

现有技术主要针对透明质酸寡糖混合物(o-HAs)进行制备(CN112553273A、CN111040048A)或应用研究(CN113876623A)，为数不多专利涉及透明质酸寡糖单体制备工艺开发，但也仅限于透明质酸四糖及以上单体(CN104610467B、CN111040048A、CN109517012B)，并未对饱和透明质酸二糖单体制备展开研究，且所得单体纯度偏低。

未开展透明质酸二糖单体制备研究的原因可能有如下两点：1)透明质酸酶酶解大分子透明质酸生成地二糖量较少，不易规模化制备；2)未找到合适方法或材料分离纯化低浓度二糖，工艺有难点。基于以上原因，透明质酸二糖单体制备工艺的开发具有重要意义。

发明内容

本发明解决的技术问题在于提供一种透明质酸二四六糖的制备方法，本申请提供的制备方法可制备出高纯的透明质酸二糖、透明质酸四糖和透明质酸六糖。

有鉴于此，本申请提供了一种透明质酸二四六糖单体的制备方法，包括以下步骤：

A)将透明质酸、水和透明质酸酶进行酶解，再进行高温灭活，得到酶解液；

B)将所述酶解液于LXT-298层析柱中吸附，再进行洗脱，得到透明质酸二糖洗脱收集液、透明质酸四糖洗脱收集液和透明质酸六糖洗脱收集液；

C)将透明质酸二糖洗脱收集液、透明质酸四糖洗脱收集液和透明质酸六糖洗脱收集液分别进行纳滤浓缩，再分别进行喷雾干燥，分别得到透明质酸二糖、透明质酸四糖和透明质酸六糖。

优选的，所述高温灭活之后还包括：

将所述酶解液采用陶瓷膜处理，再采用3K卷式超滤膜处理。

优选的，所述透明质酸酶采用水蛭来源的内切糖苷酶，所述透明质酸酶的加入量U_酶液/V_反应体积≥48000U/ml；所述酶解的温度为20～40℃，时间为12～24h。

优选的，所述高温灭活的温度为70～80℃，时间为30～40min。

优选的，所述LXT-298层析柱吸附前进行了活化，所述活化的过程具体为：

将LXT-298于玻璃层析柱中，采用氢氧化钠活化后水洗至pH＜10，然后采用盐酸活化后水洗至pH＞5。

优选的，所述LXT-298层析柱的高径比为8：1，所述LXT-298层析柱中的离子交换剂和所述酶解液的体积比为1：(5～10)。

优选的，所述洗脱为NaCl的预洗脱和NaCl的梯度洗脱。

优选的，所述吸附的物料上柱、所述预洗脱和所述梯度洗脱的速度分别为2.5～3.5BV/H。

优选的，所述纳滤浓缩的纳滤膜为150～250Da GE卷式纳滤膜。

优选的，所述喷雾干燥的进风温度为100～120℃，出风温度为60～80℃，流速为300～500ml/h。

本申请提供了一种透明质酸二四六糖的制备方法，其包括依次进行的酶解、高温灭活、离子交换层析、纳滤浓缩和喷雾干燥。本申请将大分子透明质酸经透明质酸酶一次酶解后高温灭活，再经一次离子交换层析即可分离透明质酸二糖(HA2)，同时可高质量分离透明质酸四糖(HA4)及透明质酸六糖(HA6)，经过纳滤浓缩脱盐及喷雾干燥，可制备高纯透明质酸二四六糖单体。该方法工艺简单，环境友好，设备要求低，易于工业化生产。

附图说明

图1为本发明透明质酸二四六糖制备的流程示意图；

图2为本发明实施例1中透明质酸寡糖混合物液相检测图谱；

图3为本发明实施例1制备的透明质酸二糖的液相检测图谱；

图4为本发明实施例1制备的透明质酸四糖的液相检测图谱；

图5为本发明实施例1制备的透明质酸六糖的液相检测图谱。

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。

鉴于现有技术中，低浓度透明质酸二糖不易从透明质酸寡糖混合物(o-HAs)中分离的问题，本申请提供了一种透明质酸二四六糖的制备方法，其通过采用LXT-298层析柱并结合纳滤浓缩和喷雾干燥的方式，有效分离除了低浓度的透明质酸二糖，并同时得到了透明质酸四糖和透明质酸六糖，且高纯。具体的，本申请提供的透明质酸二四六糖单体的流程具体如图1所示，更具体的，本发明实施例公开了一种透明质酸二四六糖单体的制备方法，包括以下步骤：

在制备透明质酸二四六糖的过程中，本申请首先将透明质酸、水和透明质酸酶进行酶解，再进行高温灭活，得到酶解液；在此过程中，优选采用水蛭来源的透明质酸酶(hyaluronidase，HAase)，其为内切糖苷酶，可以分解透明质酸(HA)分子链内的β-1,3糖苷键生成还原性末端为葡萄糖醛酸的饱和寡糖系列，最终产物是透明质酸四糖HA4(GlcNAc-GlcUA)₂和六糖HA6(GlcNAc-GlcUA)₃及少量二糖HA2(GlcNAc-GlcUA)。所述透明质酸酶的加入量U_酶液/V_反应体积≥48000U/ml；所述酶解的温度为20～40℃，时间为12～24h；更具体的，所述酶解的温度为36～40℃，时间为12h。在酶解之后，则将其高温灭活，以免活性酶蛋白残留于透明质酸寡糖中，避免影响透明质酸寡糖的质量。在本申请中，所述高温灭活的温度为70～80℃，时间为30～40min；更具体的，所述高温灭活的温度为70℃，时间为30min。

本申请而后进行了分离、提纯的过程，首先将所述酶解液于LXT-298层析柱中吸附，再进行洗脱，得到透明质酸二糖洗脱收集液、透明质酸四糖洗脱收集液和透明质酸六糖洗脱收集液；在此之前，优选进行了陶瓷膜除菌和超滤的操作，所述陶瓷膜除菌的质量高，所述超滤采用卷式超滤膜处理o-HAs，在循环浓缩过程中，酶蛋白及其它大分子杂质由于粒径大于膜孔径而被截留于膜上，而o-HAs由于分子粒径小，则透过超滤膜，该方式可将o-HAs中绝大部分失活酶蛋白清除。在本申请中，所述超滤为3K超滤膜。

按照本发明，然后进行离子交换层析，所述离子交换层析采用LXT-298层析柱进行离子交换；所述LXT-298层析柱吸附前进行了活化，所述活化的过程具体为：

将LXT-298于玻璃层析柱中，采用氢氧化钠活化后水洗至pH＜10，然后采用盐酸活化后水洗至pH＞10。

在上述过程中，所述LXT-298层析柱的高径比为8：1，所述LXT-298层析柱中的离子交换剂和所述酶解液的体积比为1：(5～10)。

在吸附完成后，用布氏漏斗将离子交换剂与o-HAs分离，取样检测吸附后各寡糖峰面积，同时以去离子水清洗离子交换剂，再经布氏漏斗抽滤将离子交换剂与水洗液分开，液相检测水洗液中各透明质酸寡糖峰面积。吸附后洗脱，所述洗脱为NaCl的预洗脱和NaCl的梯度洗脱；所述梯度洗脱为不同浓度0.04M～0.16M的NaCl，浓度增幅为0.02M/3BV。在上述过程中，所述吸附的物料上柱、所述预洗脱和所述梯度洗脱的速度分别为2.5～3.5BV/H。

本申请中，离子交换剂的活化目的是为了提高其对寡聚HA的吸附及分离纯化能力，碱酸交替浸泡的处理方法就可以使离子交换剂活化再生。本发明首先采用NaOH处理，可将吸附于离子交换剂上杂质去除，并将其转化为OH型，最后采用HCl处理可将其转为Cl型，该型下物料PH变化浮动小，物料更稳定。若离子交换剂不活化，会使其对寡聚HA的吸附及纯化能力大幅度下降，直观体现在对低浓度透明质酸二糖和四六糖吸附量降低及二四六糖不能高质量分离。

本申请然后将透明质酸二糖洗脱收集液、透明质酸四糖洗脱收集液和透明质酸六糖洗脱收集液分别进行纳滤浓缩，再分别进行喷雾干燥，分别得到透明质酸二糖、透明质酸四糖和透明质酸六糖。在上述过程中，所述纳滤的纳滤膜为150～250Ge卷式纳滤膜；所述喷雾干燥的进风温度为100～120℃，出风温度为60～80℃，流速为300～500ml/h。

经过上述说明，本发明筛选出离子交换剂LXT-298，该离子交换剂对透明质酸寡糖具有高吸附量(特别是对低浓度透明质酸二糖有高吸附量)、低盐高效解析等优点，基于该离子交换剂的获得，本发明首次将低浓度透明质酸二糖从透明质酸寡糖中分离，经过一系列纯化，得到高纯透明质酸二糖单体，同时可制备高纯透明质酸四糖及六糖单体；进一步的，采用150-250Da纳滤膜分别对透明质酸二糖、四糖及六糖进行浓缩脱盐处理，该方式具有高脱盐率、高浓缩效率等优点；同时，喷雾干燥法相对于低温冷冻干燥法具有能耗低、处理量大、易于工业化生产等优点，经验证，优选喷雾干燥温度下(100～120℃)，透明质酸二糖单体、四糖单体、六糖单体性质稳定。因此，采用纳滤+喷雾干燥方式制备透明质酸二四六糖单体具有明显优势。

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的透明质酸二四六糖的制备方法进行详细说明，本发明的保护范围不受以下实施例的限制。

实施例1

1、酶解

称取大分子透明质酸200g，溶于10L去离子水，加入400ml透明质酸酶液(单位酶活：1.2MU/ml)于38℃酶解12hr，将酶解液升温至70℃，保温30min，以灭活透明质酸酶；

2、陶瓷膜除菌

采用50nm陶瓷膜处理灭活后酶解液，该步骤可去除酶解过程生成地杂菌及大分子杂质，使酶解液变得澄清透亮；

3、超滤除蛋白

采用3K卷式超滤膜处理陶瓷膜除菌后物料，该步骤可去除绝大部分酶蛋白，使酶解液杂质更少，纯度更高；

4、透明质酸二四六糖分离

将1L离子交换剂LXT-298装入层析柱(柱径比：8：1)，采用2L 4％NaOH活化(流速2L/h)，水洗至PH＜10，2L 4％HCl平衡(流速2L/h)，水洗至PH＞5；

将3L超滤后物料以3L/h速度加入离子交换剂中，待吸附完全后，以2L 0.02M NaCl溶液进行预洗脱，流速为3L/h；继续以NaCl为洗脱剂进行线性梯度洗脱，洗脱液中NaCl浓度为0.04M～0.14M，浓度增幅为0.02M/3L，流速为3L/h，依次收集得到的峰，由于二糖聚合度低，首先被洗脱下来，接着为四糖，六糖；经HPLC检测，该洗脱条件下，洗脱收集所得二四六糖均为单峰，如图2～5。

5、纳滤浓缩脱盐

采用250Da GE卷式纳滤膜分别将二糖、四糖、六糖洗脱收集液进行浓缩，浓缩后期加入3-4倍纯水，可高效去除物料中盐类物质，以提高物料纯度；

6.喷雾干燥

采用进风温度：110℃，出风温度60℃，流速300ml/h对浓缩后物料进行喷雾干燥，分别收集二四六糖单体。

采用HPLC面积归一法测定纯度，硫酸咔唑法测定含量，烘箱干燥法测定干燥失重，数据如表1所示；

表1本实施例制备得到的透明质酸二四六糖的纯度等数据表

经验证，200g大分子HA，通过该工艺制备透明质酸二四六糖，可得到HA2单体17.2g，纯度为100％，收率为8.6％；HA4单体94.6g，纯度为100％，收率为47.3％；HA6单体73.6g，纯度为100％，收率为36.8％；以上工艺制备总收率为92.7％。

以下实施例分别对上述各步骤参数进行筛选：

实施例2

A)酶解大分子HA

酶解：是利用活性酶来水解特定的某种物质，酶(enzyme)是由活细胞产生的、对其底物具有高度特异性和高度催化效能的蛋白质或RNA；酶是一类极为重要的生物催化剂(biocatalyst)，由于酶的作用，生物体内的化学反应在极为温和的条件下也能高效和特异地进行。

透明质酸酶(hyaluronidase，HAase)是能使透明质酸产生低分子化作用酶的总称，本发明使用透明质酸酶也称为玻璃酸酶，其降解大分子透明质酸时，只有酶切位点的糖苷键断裂，其双糖结构单元没有变化。由HA酶解制备o-HA一般使用从睾丸提取的透明质酸酶，其为内切糖苷酶，可以打断分子链内的β-1，4糖苷键。另外，硫酸软骨素ABC酶、硫酸软骨素AC酶以及微生物提取的HAase也可以降解HA。其中硫酸软骨素ABC酶是将HA降解为双糖，由链球菌提取的HAase将HA降解为4糖或6糖。另外报道有由微生物提取的HAase将HA降解成非还原性末端不饱和的寡糖(Δ4，5-糖醛酸)，而动物来源的HAase将HA降解为饱和的寡糖，硫酸软骨素酶降解HA的产物为不饱和寡糖。

本发明采用水蛭来源的HAase，其为内切糖苷酶，可以分解HA分子链内的β-1，3糖苷键生成还原性末端为葡萄糖醛酸的饱和寡糖系列，最终产物是透明质酸四糖HA4(GlcNAc-GlcUA)₂和六糖HA6(GlcNAc-GlcUA)₃及少量二糖HA2(GlcNAc-GlcUA)。

A1)酶解HA-透明质酸酶(HAase)投量及酶解验证

①在1L烧杯中加入0.5L纯水并加热至38℃，开启搅拌至400rpm/min，缓慢加入10g大分子透明质酸粉末，高速搅拌状态下至大分子透明质酸完全溶解(无任何颗粒)；

②向完全溶解地大分子透明质酸溶液中加入一定量HAase(酶活：1.2MU/ml)，保持温度38℃，高速搅拌12h后停止水解；四组实验，HAase投量(U_酶液/V_反应体积)分别为：12000U/ml、24000U/ml、36000U/ml和48000U/ml。

分离色谱条件：色谱柱：YMC-Pack Polyamine II色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)(日本YMC公司)；流动相0.08mol/L磷酸二氢钠：乙腈(90：10)，流速1mL/min，柱温25℃，紫外检测器210nm，进样量5μL。结果如表2所示：

表2透明质酸酶不同投量的透明质酸二四六糖的实验数据表

由表2可知，不同HAase投量，酶解生成地o-HAs组成不同。当酶解反应中HAase投量在24000U/ml及以下时，反应中仍有HA8和HA10生成，而将HAase投量提高至48000U/ml时，HA8和HA10可完全酶解，酶解液主要以HA2、HA4及HA6形式存在，且三者均达到最高生成量，因此，将反应体系中HAase投量控制在48000U/ml及以上为最优。

A2)高温灭活

HAase高温灭活：酶解反应完后，需将HAase经过高温灭活处理，以免活性酶蛋白残留于o-HAs中，影响o-HAs质量。

A21)HAase灭活温度及时间优化

①取单位酶活48000U/ml的酶解液150ml，均分为三组，灭活温度为60℃、70℃、80℃，灭活时间为20min、30min、40min。

②按照以上灭活条件，分别取样检测该条件下HAase单位活力，从而确定最优灭活条件。

酶活检测方法：透明质酸酶低活力检测方法，结果如表3所示；

表3不同高温灭活温度下的酶活数据表

由表3可知，将灭活温度控制在70℃、30min左右即可使HAase完全失活，该温度下o-HAs性质稳定。

B)陶瓷膜除菌

陶瓷膜微滤：膜分离技术是当前比较热潮的分离技术之一，它具有以下特点：无相变化，能耗较低，易操作，易于放大，膜的性能可以调节，不需要化学药品；其中陶瓷膜还具有化学稳定性好、耐酸、耐碱、耐有机溶剂；抗污染、抗微生物能力强，机械强度大，耐磨损等诸多优点。

由于HA为糖类物质，在38℃及长时间(12h)酶解下，HA酶解液中极易滋生细菌及其它杂质，影响o-HAs质量，因此，采用50nm陶瓷膜对o-HAs进行除菌处理，处理效率高且处理过程中o-HAs性质稳定，最直观体现为物料由浑浊变澄清。

采用陶瓷膜处理，除菌质量高、处理效率高，物料性质稳定，易于工业放大。

C)超滤

超滤(UF)：超滤是一种加压膜分离技术，即在一定的压力下，使小分子溶质和溶剂穿过一定孔径的特制的薄膜，而使大分子溶质不能透过，留在膜的一边，从而使大分子物质得到了部分的纯化。超滤原理也是一种膜分离过程原理，超滤利用一种压力活性膜，在外界推动力(压力)作用下截留水中胶体、颗粒和分子量相对较高的物质，而水和小的溶质颗粒透过膜的分离过程。通过膜表面的微孔筛选可截留分子量大于膜孔径的物质。当被处理水借助于外界压力的作用以一定的流速通过膜表面时，水分子和分子量小于膜孔径的溶质透过膜，而大于膜孔的微粒、大分子等由于筛分作用被截留，从而使水得到净化。也就是说，当水通过超滤膜后，可将水中含有的大部分胶体硅除去，同时可去除大量的有机物等。

本工艺采用卷式超滤膜处理o-HAs，在循环浓缩过程中，酶蛋白及其它大分子杂质由于粒径大于膜孔径而被截留于膜上，而o-HAs由于分子粒径小，则透过超滤膜，该方式可将o-HAs中绝大部分失活酶蛋白清除。

C1)超滤膜筛选

超滤机：BONA-GM-17，超滤膜元件：GE，膜面积：0.22m²；

物料：3L经陶瓷膜处理地o-HAs混合物，经不同孔径超滤膜元件进行超滤处理；

超滤膜元件：5KD、3KD、1KD，超滤操作规程按设备使用说明进行，结果如表4所示；

表4不同超滤膜的超滤效果数据表

由表4可知，采用5K超滤膜处理o-HAs，处理后o-HAs中蛋白含量仍达24ug/ml，远超行标(10ug/ml)，而采用1KD超滤膜处理o-HAs，其蛋白含量合格，但超滤收率降低，其原因可能为膜孔径小导致HA6被膜少量截留；采用3K超滤膜处理o-HAs，既能高质量去除蛋白，又能保证高收率，因此，以3K超滤膜进行o-HAs蛋白除杂为最优。

D)离子交换层析

色谱法(chromatography)又称“色谱分析”、“色谱分析法”、“层析法”，是一种分离和分析方法，在分析化学、有机化学、生物化学等领域有着非常广泛的应用。色谱法利用不同物质在不同相态的选择性分配，以流动相对固定相中的混合物进行洗脱，混合物中不同的物质会以不同的速度沿固定相移动，最终达到分离的效果。

离子交换柱是指用来进行离子交换反应的柱状压力容器，离子交换反应是指离子交换剂功能基中的阳离子或阴离子与溶液中同性离子进行可逆交换的过程。离子交换剂分为有机和无机的离子交换剂。无机离子交换剂分为天然和例如合成沸石等人造的材料。有机离子交换剂中有离子交换树脂，离子交换树脂按照物理结构分类可以分为孔径为5nm的凝胶型和孔径为20-100nm的大孔型，按照合成的树脂所用原料单体分类可以分为苯乙烯系、酚醛系、丙烯酸系、环氧系、乙烯吡啶系等。离子交换树脂最常用的分类是依据树脂离子交换功能团分类，分为包括强酸性阳离子型离子交换树脂、弱酸性阳离子型离子交换树脂、强碱性阴离子型离子交换树脂和弱碱性的阴离子型离子交换树脂以及其他类型。

本实验通过筛选合适离子交换剂及工艺开发，可高质量分离纯化HA4、HA6及低浓度HA2。

D1)离子交换剂筛选

①离子交换剂活化步骤：量取50ml离子交换剂(见表5)于玻璃层析柱中，采用100ml 4％NaOH活化(流速2BV/h)，水洗至PH＜10，100ml4％HCl活化(流速2BV/h)，水洗PH＞5后待用；

②离子交换剂静态吸附与解析：将3K超滤处理后o-HAs加入500ml玻璃烧杯中，与离子交换剂混溶(V_{离子交换剂}：V_物料＝1：5)，在100rpm/min转速下搅拌4h，取上清液进液相检测各透明质酸寡糖(o-HA)峰面积(暂无透明质酸各寡糖标准品，不能对各寡糖定量，以峰面积作为判断指标)；

③终止吸附后，经布氏漏斗将离子交换剂与o-HAs分离，取样检测吸附后各寡糖峰面积，同时以100ml去离子水清洗离子交换剂10min，再经布氏漏斗抽滤将离子交换剂与水洗液分开，液相检测水洗液中各透明质酸寡糖峰面积；

④以0.2MNaCl作为解析剂，将离子交换剂与0.2M NaCl混溶(V_{离子交换剂}：V_解析剂＝1：5)，在100rpm/min转速下搅拌0.5h，取上清液进液相检测；结果如表6所示；

表5不同离子交换剂性质数据表

表6不同离子交换剂的吸附、解析数据表

由以上数据可知：LXT-298对HA2、HA4、HA6的吸附能力均高于其它几款离子交换剂，大致估算，1T LXT-298可完全吸附60kg o-HAs(3T 2％HA酶解液)，吸附量极高；以0.2MNaCl进行解析验证，结果显示，LXT-298对HA2、HA4、HA6的解析能力也高于其它几款离子交换剂，LXT-298在低离子强度下对透明质酸寡糖的高解析率，会减少物料中盐含量和其它杂质的富集，降低后续纯化压力，纯化质量得到提高。综上，优选LXT-298进行HA4与HA6及HA2分离纯化。

D2)离子交换柱高径比优化实验

①将已活化LXT-298离子交换剂等量(1000ml)装入三组不同柱径比玻璃层析柱中，构成离子交换剂高径比为：8：1、5：1、3：1；

②物料上柱：通过蠕动泵将3K超滤处理后o-HAs滴入已活化离子交换剂中，使透明质酸寡糖与其进行动态吸附交换(V_物料：V_树脂＝2.5：1)，取流穿液进液相检测；

③预洗脱：终止吸附后，以2000ml 0.02M NaCl进行预洗脱，除去离子交换剂间杂质，取预洗脱收集液进液相检测；

④梯度洗脱：配制不同浓度NaCl(0.04M-0.16M，浓度增幅为0.02M/3BV)溶液进行梯度洗脱，每BV取样液相检测；

⑤物料上柱、预洗脱及洗脱速度均控制在2.5-3.5BV/H。结果如表7所示：

表7不同离子交换剂高径比的洗脱数据表

注：BV表示柱体积，按上述洗脱工艺1BV＝1000ml。

由上述数据可知，1)将离子交换柱高径比提高至8：1，可使离子交换剂形成地塔板层数增加，高塔板层数可提高对相对分子质量差别不大物质地分离质量(HA2与HA4相对分子质量仅相差397)，从液相图谱可知，分离所得HA2、HA4、HA6纯度均达到100％。液相检测图谱如2～5；2)采用低浓度NaCl梯度洗脱，洗脱条件温和，洗脱剂pH适中，分离所得透明质酸寡糖性质稳定，同时氯离子及钠离子易被去除，可以减轻后续脱盐压力；3)常压下，无需改变洗脱速度，可将上料吸附、洗脱的速度控制在60ml/min，洗脱工艺简单、洗脱效率高；4)HA2洗脱收率94.2％，HA4洗脱收率95.6％，HA6洗脱收率95.8％，整体洗脱收率近95％，收率较高。

E)纳滤

纳滤：纳滤(NF)是一种介于反渗透和超滤之间的压力驱动膜分离过程，纳滤膜的孔径范围在几个纳米左右。纳滤(NF)用于将相对分子质量较小的物质，如无机盐或葡萄糖、蔗糖等小分子有机物从溶剂中分离出来。纳滤又称为低压反渗透，是膜分离技术的一种新兴领域，其分离性能介于反渗透和超滤之间，允许一些无机盐和某些溶剂透过膜，从而达到分离的效果。

本工艺采用卷式纳滤膜处理层析分离所得HA2、HA4及HA6混液，在纳滤浓缩过程中，氯离子及钠离子由于粒径小，可透过纳滤膜，从而与HA2、HA4及HA6分离，浓缩后期可加入适量纯水，以带走少量被物料吸附或膜截留的氯离子及钠离子(通过浓缩物料电导率变化体现)，从而起到脱盐纯化目的。

纳滤机：BONA-GM-17，纳滤膜元件：GE(孔径150-250Da)，膜面积：0.22m²；电导仪：FiveEasy Plus FE38台式电导率仪；

物料：4L经层析分离所得HA2、HA4及HA6混液，均采用纳滤膜元件150-250Da进行浓缩脱盐验证，纳滤操作规程按设备使用说明进行，采用台式电导率仪检测物料离子强度，即相对含盐量。结果如表8所示；

表8透明质酸二四六糖纳滤后的数据表

采用纳滤方式分别处理HA2、HA4及HA6混液，既能高效浓缩(0.22m²纳滤膜1h处理量可达50L)，又可高质量脱盐(脱盐率均高于95％)，同时能保证透明质酸寡糖的稳定性及高收率，该方式优势明显。

F)喷雾干燥

喷雾干燥：通过机械作用，将需干燥的物料，分散成很细的像雾一样的微粒，(增大水分蒸发面积，加速干燥过程)与热空气接触，在瞬间将大部分水分除去，使物料中的固体物质干燥成粉末。

以纳滤浓缩脱盐后的HA2、HA4及HA6浓缩液为物料，采用常规喷雾干燥法来制备HA2、HA4、HA6单体。喷雾操作步骤按常规操作步骤进行。

经过优化实验，选择进风温度：100～120℃，出风温度60℃，流速300ml/h为最优，该条件下HA2、HA4及HA6单体纯度高(性质稳定)，含量高、含水量低。

采用HPLC面积归一法测定纯度，硫酸咔唑法测定含量，烘箱干燥法测定干燥失重，数据如下：

表9喷雾干燥后的数据表

通过以上工艺路线可以获得高质量HA2、HA4及HA6单体，HA2、HA4、HA6单体纯度分别为100％、100％、100％。

经验证，100g大分子HA，通过该工艺制备透明质酸二四六糖，可得到HA2单体8.6g，纯度为100％，收率为8.6％；HA4单体47.3g，纯度为100％，收率为47.3％；HA6单体36.8g，纯度为100％，收率为36.8％；以上工艺制备总收率为92.7％。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims

1.一种透明质酸二四六糖单体的制备方法，包括以下步骤：

A）将透明质酸、水和透明质酸酶进行酶解，再进行高温灭活，得到酶解液；将所述酶解液采用陶瓷膜处理，再采用3K卷式超滤膜处理；

所述透明质酸酶采用水蛭来源的内切糖苷酶，所述透明质酸酶的加入量U_酶液/V_反应体积≥48000U/ml；所述酶解的温度为20~40℃，时间为12~24h；

所述高温灭活的温度为70~80℃，时间为30~40min ；

B）将采用3K卷式超滤膜处理得到的酶解液于LXT-298层析柱中吸附，再进行洗脱，得到透明质酸二糖洗脱收集液、透明质酸四糖洗脱收集液和透明质酸六糖洗脱收集液；

所述LXT-298层析柱吸附前进行了活化，所述活化的过程具体为：

将LXT-298于玻璃层析柱中，采用氢氧化钠活化后水洗至pH＜10，然后采用盐酸活化后水洗至pH＞5；

所述LXT-298层析柱的高径比为8：1，所述LXT-298层析柱中的离子交换剂和所述酶解液的体积比为1：（5~10）；

所述洗脱为NaCl的预洗脱和NaCl的梯度洗脱；

C）将透明质酸二糖洗脱收集液、透明质酸四糖洗脱收集液和透明质酸六糖洗脱收集液分别进行纳滤浓缩，再分别进行喷雾干燥，分别得到透明质酸二糖、透明质酸四糖和透明质酸六糖。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述吸附的物料上柱、所述预洗脱和所述梯度洗脱的速度分别为2.5~3.5BV/H。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述纳滤浓缩的纳滤膜为150~250DaGE卷式纳滤膜。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述喷雾干燥的进风温度为100~120℃，出风温度为60~80℃，流速为300~500ml/h。