CN115386608B - 一种实时调控酶活制备高活性透明质酸寡糖组合物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种实时调控酶活制备高活性透明质酸寡糖组合物的方法，属于透明质酸寡糖技术领域，所述方法包括：酶解，层析纯化，纳滤，除菌与物料干燥；该方法制备的产品具有结构完好，生物活性高，纯度高，含量可达95%以上，回收率高，效率高，是一种绿色低碳经济效益非常高的工业化方法。本发明制备的寡糖具有明显的透皮吸收效果；可以显著降低氧化应激细胞内活性氧的含量、显著提高细胞内过氧化氢酶的酶活力；有效防止细胞内脂质氧化水平的提高、提高细胞内一型胶原的含量、提高细胞内透明质酸的含量；可以显著降低炎症因子。本发明制备的产品可以广泛的应用于食品、化妆品、药品、医疗器械等领域。

Description

一种实时调控酶活制备高活性透明质酸寡糖组合物的方法
技术领域
本发明属于透明质酸寡糖技术领域,具体涉及一种实时调控酶活高效制备高活性透明质酸寡糖组合物的方法。
背景技术
透明质酸，又名玻璃酸或玻尿酸，是一种直链聚阴离子多糖，由(1→4)-β-D-葡萄糖醛酸和 (1→3)-β-D-N-乙酰氨基葡萄糖双糖重复单元组成，其平均pKa 值为2.91，透明质酸分子链充分伸展的，其链长度为15μm。在透明质酸分子链中，两个连续的羧基之间的距离为12Å，其固有持续长度为45至90Å，在水溶液里其扩展成随机的线圈状，线圈的直径为500 nm。透明质酸被认为是唯一几乎存在于从细菌到人类所有动物体之中的粘多糖，它广泛存在于动物的各种组织中，具有特殊的生理功能。大量的研究证明透明质酸除保水作用外，还具有调节渗透压、维持组织形态、屏障扩散、润滑关节和缓冲应力等生理功能，更重要的是，透明质酸能够被特定的细胞受体识别，如CD44，从而调控细胞的粘附、生长、分化和激活特异性细胞类型，调控免疫反应、血管化和愈合过程由于其独特的性质而被广泛应用于医药、临床诊治、化妆品和食品保健行业。
透明质酸寡糖具有免疫活性、促进血管内皮细胞增殖和逆转肿瘤细胞多药耐药性等作用，透明质酸寡糖可涵盖还原末端为糖醛酸结构或N-乙酰葡糖胺结构的寡糖，即其中的透明质酸寡糖可以均为糖醛酸结构、均为N-乙酰葡糖胺结构，或者是糖醛酸结构和N-乙酰葡糖胺结构的混合物。
目前，通过降解透明质酸制备透明质酸寡糖的方法主要有物理降解、化学降解、生物降解三大类。其中，物理降解法很难将分子量降至10kDa以下；化学降解法需要较剧烈的反应条件（如较高的酸、碱浓度等）才能达到最大程度的降解，化学降解法不但会导致糖链上的糖苷键断裂，而且单糖（葡糖酸酸和乙酰氨基葡）残基的结构也可能遭到破坏，如乙酰基被水解掉、单糖六元环断裂等，对制得的的生物活性会产生一定影响，而且生产过程会污染环境；酶法降解的特异性高，只断裂单糖分子间的连接键，不会对其结构造成破坏，并且酶解法反应条件温和，制备的活性优于化学法的产品，为环境友好型技术，但是酶解法制备寡糖时存在酶用量大，酶解时间长的缺点，而且制备的是透明质酸寡糖组合物，里面含有二糖、四糖、六糖、八糖、十糖，透明质酸寡糖组合物中的二糖比例低，分子量分布大。
为了缩短酶解时间，目前最常用的方法之一为将酶解法与超声联用，但是酶解与超声联用过程中，存在空化作用，空化会导致瞬间局部高温和高压，影响酶的活性，从而造成酶的用量增大，而且超声还会导致制备的透明质酸寡糖组合物的分子量分布大，从而影响透明质酸寡糖组合物的使用效果。
发明内容
本发明提供一种实时调控酶活高效制备高活性透明质酸寡糖组合物的方法，能够降低透明质酸酶的使用量，缩短酶解时间，减小分子量分布，降低制备的透明质酸寡糖组合物的分子量，提高透明质酸寡糖组合物的使用效果。
为解决以上技术问题，本发明采取的技术方案如下：
一种实时调控酶活高效制备高活性透明质酸寡糖组合物的方法，包括：酶解，层析纯化，纳滤，除菌与物料干燥。
所述酶解，将透明质酸酶、透明质酸或其盐、纯化水加入超声设备中,维持pH为6.0-8.0，控制温度为30-45℃，然后将超声波的频率控制至50kHz-1.7MHz，酶解8-12h后，得到酶解液；
所述透明质酸或其盐中的透明质酸盐优选为可溶性的盐，例如透明质酸钠盐、透明质酸钾盐、透明质酸钙盐、透明质酸锌盐、透明质酸镁盐、透明质酸胺盐等；
其中，透明质酸酶、透明质酸钠、纯化水的重量比为1:2-2.5:20-22；
所述透明质酸的分子量为40-160万。
所述层析纯化，利用色谱层析技术对酶解液进行分离纯化，使用的仪器：蛋白纯化层析仪，层析柱：7.7-100BV=4.65ml，上样量：1-20mg/ml，流动相A：5-50mMNaAc-HAc，流动相B：5-50mMNaAc-HAc+0.5-1.5mMNaCl，流动相C：5-50mMNaAc-HAc+0.5-1.5mMNaCl，控制流动相pH为4-8，流速0.5-3ml/min，波长210nm；
所述层析纯化，首先把样品溶液pH调节至与流动相pH一致后，梯度洗脱条件：经流动相A平衡柱子30-60min，平衡柱子后逐步在1-1.5 h内逐步提高B的比例至50%，后继续洗脱提高至B的比例至100%，继续洗脱1h，调高至流动相C的比例至100%，将目标峰对应的洗脱液进行收集，得到目标洗脱液；
通过以上层析技术，可以精确制备透明质酸寡糖或其组合物包括但不限于二糖、四糖、六糖、八糖；
所述纳滤，将目标洗脱液进行超滤脱盐浓缩，控制超滤脱盐浓缩中膜的孔径为100-200Da，温度在40℃以下，超滤脱盐浓缩结束得到纳滤液。
所述除菌与物料干燥，将纳滤液经过0.25µm的聚偏氟乙烯材质滤芯过滤后，进行真空冷冻干燥，真空冷冻干燥结束得到透明质酸寡糖；
所述真空冷冻干燥共分七个阶段，具体为：阶段一的温度为-28℃至-32℃，时间为3.5-4.5h；阶段二的温度为-18℃至-22℃，时间为1.5-2.5h；阶段三的温度为-7℃至-3℃，时间为1.5-2.5h；阶段四的温度为-2℃至2℃，时间为3.5-4.5h；阶段五的温度为3-7℃，时间为1.5-2.5h；阶段六的温度为18-22℃，时间为1.5-2.5h；阶段七的温度为28-32℃，时间为8-12h；
所述真空冷冻干燥过程中的真空度为25Pa。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
（1）本发明的实时调控酶活高效制备高活性透明质酸寡糖组合物的方法，通过加入促酶解剂，以及分两次酶解，在二次酶解中加入氧化铝和透明质酸或其盐水溶液，能够降低透明质酸酶的用量；
（2）本发明的实时调控酶活高效制备高活性透明质酸寡糖组合物的方法，通过加入促酶解剂，以及分两次酶解，在二次酶解中加入氧化铝和透明质酸或其盐水溶液，能够缩短酶解时间；
（3）本发明的实时调控酶活高效制备高活性透明质酸寡糖组合物的方法，通过加入促酶解剂，以及分两次酶解，在二次酶解中加入氧化铝和透明质酸或其盐水溶液，能够提高透明质酸寡糖的使用效果，将本发明制备的透明质酸寡糖进行透皮测试，于涂抹0.5h后的渗透量为7.50-7.85%，于涂抹1h后的渗透量为14.12-14.56%，于涂抹8h后的渗透量为63.81-65.41%；皮中残余量为2763-3024µg，皮上残余量为1352-1640µg；
（4）本发明的实时调控酶活高效制备高活性透明质酸寡糖组合物的方法，制备的透明质酸寡糖组合物能够降低氧化应激细胞内活性氧、IL-1β、IL-6、TNF-α的含量，提高细胞内一型胶原、透明质酸的含量；
（5）本发明的实时调控酶活高效制备高活性透明质酸寡糖组合物的方法，制备的透明质酸寡糖的干燥失重为6.96%，平均相对分子质量为770Da，pH值为6.8，透光率为99.7%，吸光度为0.02，菌落总数为5CFU/g，霉菌和酵母菌为10CFU/g，未检出金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌，葡萄糖醛酸含量为46.6%，透明质酸钠含量为96.4%。
附图说明
图1为实施例1制备的透明质酸寡糖组合物的液相色谱图；
图2为对比例1制备的透明质酸寡糖组合物的液相色谱图；
图3为相对荧光照片；
图4为1-3号培养皿内TNF-α测定图；
图5为1-3号培养皿内IL-1β测定图；
图6为1-3号培养皿内IL-6测定图；
图7为1-3号培养皿内上清液中CoL-I的含量测定图；
图8为1-3号培养皿内上清液中氧化应激细胞内一型胶原蛋白含量测定图；
图9为1-3号培养皿内上清液中HA的含量测定图；
图10为1-3号培养皿内1-3号培养皿内上清液中HA的含量测定图。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明，应当理解，实施例仅用于说明进一步说明和阐述本发明，并非用于限制本发明。
实施例1
一种实时调控酶活高效制备高活性透明质酸寡糖组合物的方法，具体为：
1.酶解：将透明质酸酶、透明质酸钠、纯化水加入超声设备中,维持pH为7.0，控制温度为37℃，然后将超声波的频率控制至50kHz，酶解12h后，得到酶解液；
其中，透明质酸酶、透明质酸钠、纯化水的重量比为1:2:20；
所述透明质酸的分子量为40万。
2.层析纯化：利用色谱层析技术对酶解液进行分离纯化，使用的仪器：蛋白纯化层析仪，层析柱：50BV=4.65ml，上样量：10mg/ml，流动相A：25mMNaAc-HAc，流动相B：25mMNaAc-HAc+0.3mMNaCl，流动相C：25mMNaAc-HAc+1mMNaCl，控制流动相pH为6，流速2ml/min，波长210nm；
在分离纯化时，首先把样品溶液pH调节至与流动相pH一致后，梯度洗脱条件：经流动相A平衡柱子45min，平衡柱子后逐步在1.2h内逐步提高B的比例至50%，后继续洗脱提高至B的比例至100%，继续洗脱1h，调高至流动相C的比例至100%，将目标峰对应的洗脱液进行收集，得到目标洗脱液。
3.纳滤：将目标洗脱液进行超滤脱盐浓缩，控制超滤脱盐浓缩中膜的孔径为100Da，温度为25℃，超滤脱盐浓缩结束得到纳滤液。
4.除菌与物料干燥：将纳滤液经过0.25µm的聚偏氟乙烯材质滤芯过滤后，进行真空冷冻干燥，真空冷冻干燥结束得到透明质酸寡糖；
所述真空冷冻干燥共分七个阶段，具体为：阶段一的温度为-30℃，时间为4h；阶段二的温度为-20℃，时间为2h；阶段三的温度为-5℃，时间为2h；阶段四的温度为0℃，时间为4h；阶段五的温度为5℃，时间为2h；阶段六的温度为20℃，时间为2h；阶段七的温度为30℃，时间为10h；
所述真空冷冻干燥过程中的真空度为25Pa。
实施例2
一种实时调控酶活高效制备高活性透明质酸寡糖组合物的方法，具体为：
1.溶解：将透明质酸钠溶于纯化水中,然后于30℃下,以100rpm的搅拌速度搅拌30min,得到透明质酸钠水溶液；
其中，透明质酸钠与纯化水的重量比为1:10；
所述透明质酸钠的分子量为40万。
2.制备促酶解剂：将凹凸棒土粘土、醋酸加入去离子水中，然后升温至40℃，以300rpm的搅拌速度搅拌1h，加入质量浓度为7%的硝酸锰水溶液、质量浓度为4%的氯化锌水溶液、醋酸钠、醋酸锌，继续搅拌30min，然后加入质量分数为10%的氢氧化钠水溶液，继续搅拌35min后，于45℃下静置45min，得到初级反应液，将初级反应液进行降温加压处理，控制降温加压处理过程中的温度为10℃，压力为0.2MPa，时间为20min，降温加压处理结束，得到反应液，对反应液进行离心，控制离心过程中的转速为5000rpm，时间为5min，离心结束得到初级促酶解剂，使用去离子水对初级促酶解剂清洗3次后，于60℃下干燥50min，然后破碎至粒径为1mm，得到促酶解剂；
其中，凹凸棒土粘土、醋酸、去离子水、质量浓度为7%的硝酸锰水溶液、质量浓度为4-5%的氯化锌水溶液、醋酸钠、醋酸锌、质量分数为10%的氢氧化钠水溶液的重量比为100:120:1800:60:75:40:28:55。
3.一次酶解：向透明质酸钠水溶液中加入促酶解剂、透明质酸酶，将温度控制至36℃，然后进行超声处理，控制超声处理的频率为50kHz，时间为2h，超声处理结束，得到一次酶解液；
其中，透明质酸钠水溶液、促酶解剂、透明质酸酶的重量比为20:0.1:0.2；
所述透明质酸酶的活性为20000U/mL；
所述透明质酸酶为根据专利申请号为2019113654980，专利名称为一种肠杆菌及其应用中实施例1的方法制备的透明质酸粗酶液进行纯化后制得。
4.二次酶解：向一次酶解液中加入氧化铝、透明质酸钠水溶液，将温度控制至42℃，然后进行超声处理，控制超声处理的频率为35kHz，时间为2h，超声处理结束，在95℃下灭酶处理10min，得到二次酶解液，将二次酶解液进行离心，控制离心过程中的转速为4000rpm，时间为6min，离心结束去除沉淀部分，得到二次酶解液；
其中，一次酶解液、氧化铝、透明质酸钠水溶液的重量比为600:10:60。
5.层析纯化：利用色谱层析技术对二次酶解液进行分离纯化，使用的仪器：蛋白纯化层析仪，层析柱：50BV=4.65ml，上样量：10mg/ml，流动相A：25mMNaAc-HAc，流动相B：25mMNaAc-HAc+0.3mMNaCl，流动相C：25mMNaAc-HAc+1mMNaCl，控制流动相pH为6，流速2ml/min，波长210nm；
在分离纯化时，首先把样品溶液pH调节至与流动相pH一致后，梯度洗脱条件：经流动相A平衡柱子45min，平衡柱子后逐步在1.2h内逐步提高B的比例至50%，后继续洗脱提高至B的比例至100%，继续洗脱1h，调高至流动相C的比例至100%，将目标峰对应的洗脱液进行收集，得到目标洗脱液。
6.纳滤：将目标洗脱液进行超滤脱盐浓缩，控制超滤脱盐浓缩中膜的孔径为100Da，温度为25℃，超滤脱盐浓缩结束得到纳滤液。
7.除菌与物料干燥：将纳滤液经过0.25µm的聚偏氟乙烯材质滤芯过滤后，进行真空冷冻干燥，真空冷冻干燥结束得到透明质酸寡糖；
所述真空冷冻干燥共分七个阶段，具体为：阶段一的温度为-30℃，时间为4h；阶段二的温度为-20℃，时间为2h；阶段三的温度为-5℃，时间为2h；阶段四的温度为0℃，时间为4h；阶段五的温度为5℃，时间为2h；阶段六的温度为20℃，时间为2h；阶段七的温度为30℃，时间为10h；
所述真空冷冻干燥过程中的真空度为25Pa。
对比例1
与实施例1相同的实时调控酶活高效制备高活性透明质酸寡糖组合物的方法，其不同之处在于：第1步酶解步骤中省略超声处理，即将第1步酶解改为：
将透明质酸酶、透明质酸钠、纯化水加入超声设备中,维持pH为7.0，控制温度为37℃，酶解12h后，得到酶解液；
其中，透明质酸酶、透明质酸钠、纯化水的重量比为1:2:20；
所述透明质酸的分子量为40万。
试验例1液相色谱分析
对实施例1和对比例1制备的透明质酸寡糖组合物进行液相色谱分析，液相色谱分析条件如下所示：
仪器：Thermo U3000高效液相色谱仪
色谱柱：ChromCore HILIC-Amide色谱柱 (250×4.6mm，5μm）
流动相：0.1mol/L磷酸二氢铵溶液（10%乙腈）流速：0.5ml/min
波长：210nm
柱温：30℃
液相色谱分析结果见图1和图2所示；其中，图1为实施例1制备的透明质酸寡糖组合物的液相色谱图，图2为对比例1制备的透明质酸寡糖组合物的液相色谱图。
由图1可以看出，实施例1制备的透明质酸寡糖组合物的二糖比例高达97.8%，而对比例1制备的透明质酸寡糖组合物中二糖的比例仅仅为7.76%，四糖的比例为22.49%，六糖的比例为27.87%，八糖的比例为22.73%，十糖的比例为19.04%。
将冷冻的猪皮解冻后，用生理盐水洗净，剪成3块猪皮样品，每块大小为2cm×2cm，编号1-3号猪皮样品，然后分别使用实施例1-2和对比例1制备的透明质酸寡糖组合物对1-3号猪皮样品进行透皮测试，测试方法及结果如下：
将猪皮样品夹在接收池和供给室之间（皮肤外层表皮朝向供给室），固定后在接收池中加入 15mL PBS缓冲液，使皮肤和PBS缓冲液紧密接触，调整PBS缓冲液的温度为 32±1℃，对PBS缓冲液进行搅拌并将搅拌速率控制为350r/min；
将透明质酸寡糖组合物添加至皮肤内皮表面并涂抹均匀，每块猪皮样品的涂抹量为500mg，涂抹后开始计时，于涂抹后 0.5h、1h、8h 分别取样 2mL，用 0.45μm滤膜过滤检测透明质酸钠含量。在时间点取样完毕后立即补充等量磷酸盐缓冲液。透气试验结果如下所示：
8h后用一定量 PBS 缓冲液冲洗皮上残留溶液并收集，用胶带重复多次将残留粘下，并入收集液，定容至 10mL，浸泡 24h。将接触面猪皮剪碎溶入10mL的磷酸盐缓冲液内，搅拌24h，测定以上溶液含量。采用高效液相色谱法进行透明质酸钠含量的检测，色谱条件如下：
检测波长：220nm
进样体积：10μL
流速：0.8mL/min
流动相：0.1mol/L磷酸盐
柱温：室温
色谱柱：C18（150mm*4.6mm*5μm）
由上述结果可以看出，加入促酶解剂，促酶解剂中的锌离子和锰离子能够促进酶解的进行，生成更多小分子的透明质酸寡糖；通过一次酶解和二次酶解结合，在一次酶解和二次酶解中使用不同的超声频率，先使用频率较强的超声，再使用频率较弱的超声，能够更好的激发透明质酸酶的酶解能力，同时在二次酶解中加入氧化铝，氧化铝不溶于透明质酸或其盐水溶液，但是却有很好的吸附作用，能够吸附水中多余的离子，吸附后的离子既能够进一步促进酶解，又不会对透明质酸寡糖的纯度造成影响，在二次酶解中加入透明质酸，进行分批酶解，既能够避免一次性加入透明质酸，导致酶解不彻底，又能够在二次酶解中形成浓度差，更好地促进酶解的进行，从而降低透明质酸酶的用量，缩短酶解时间；因此，实施例2与实施例1相比，虽然酶解时间短，透明质酸酶用量少，但是实施例2的透皮试验结果要略高于实施例1，对比例1中既没有在酶解过程中进行超声处理，也没有加入促酶解剂及使用一次酶解和二次酶解结合，所以透皮试验结果要低于实施例1和实施例2。
试验例3活性氧含量测试
取4个96孔培养皿，编号1-4号培养皿，取对数生长期状态良好的人成纤维细胞计数并分别接种于1-4号培养皿中，控制每皿细胞数为1×104个细胞，在37℃，5% CO2环境下培养过夜，弃培养基，分别将过氧化氢加入1-4号培养皿中，每个培养皿的加入量均控制在5g，对细胞作用6h，然后分别向1-4号培养皿中加入无血清DMEM培养液，6h后去掉培养液加入少量的磷酸盐缓冲液（PBS, pH 7.4, 0.01 mol/L），以刚好覆盖细胞为宜，然后以UVB刺激2-4号培养皿的细胞，控制UVB的辐射量为10 mJ/cm2，1号不使用UVB刺激，作为空白对照，结束后继续将实施例1制备的透明质酸寡糖样品和VC加入3-4号培养皿中，每个培养皿的加入量均控制在5g，培养24h后，使用磷酸盐缓冲液（PBS, pH 7.4, 0.01 mol/L）清洗细胞，然后向1-4号培养皿中加入质量分数为0.25%胰酶，将细胞从六孔板中消化，离心收集细胞沉淀，参照ROS检测试剂盒说明书操作，以激发波长488 nm，发射波长525 nm进行荧光的检测，记录荧光强度数值，记录结果如下：
#：P<0.05模型 VS 空白##：P<0.01模型 VS 空白###：P<0.001模型 VS 空白
*: P<0.05 vs M(模型)，**: P<0.01 vs M (模型),***:P<0.001vs M(模型）
图3为相对荧光照片（10×），图片越亮，细胞内活性氧含量越高，经过氧化氢处理后，细胞内活性氧显著增高，使用VC及实施例1制备的透明质酸寡糖样品处理后，细胞内活性氧含量显著降低，结果表明实施例1制备的透明质酸寡糖样品能显著降低氧化应激细胞内活性氧的含量。
试验例4活性氧含量测试
取3个96孔培养皿，编号1-3号培养皿，取对数生长期状态良好的人成纤维细胞计数并分别接种于1-3号培养皿中，控制每皿细胞数为1×104个细胞，在37℃，5% CO2环境下培养过夜，弃培养基，将实施例1制备的透明质酸寡糖样品加入3号培养皿中，加入量为5g，对细胞作用6h，然后分别向1-3号培养皿中加入无血清DMEM培养液，6h后去掉培养液加入少量的磷酸盐缓冲液（PBS, pH 7.4, 0.01 mol/L），以刚好覆盖细胞为宜，然后以UVB刺激2-3号培养皿的细胞，控制UVB的辐射量为10 mJ/cm2，1号不使用UVB刺激，作为空白对照，结束后继续将实施例1制备的透明质酸寡糖样品加入3号培养皿中，加入量为5g，培养24h后，分别取1-3号培养皿的上清液，测定上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量，图4为1-3号培养皿内TNF-α变化，由图4可知，经UVB照射后，细胞内TNF-α含量显著增加，经过实施例1制备的透明质酸寡糖样品处理后，TNF-α显著降低；图5为1-3号培养皿内IL-1β的变化，由图5可知，经UVB照射后，细胞内IL-1β含量显著增加，经过实施例1制备的透明质酸寡糖样品处理后，IL-1β显著降低；图6为1-3号培养皿内IL-6的变化，由图6可知，经UVB照射后，细胞内IL-6含量显著增加，经过实施例1制备的透明质酸寡糖样品处理后，IL-6显著降低。
试验例5成纤维细胞中CoL-I的测定
取3个96cm培养皿，编号1-3号培养皿，取对数生长期状态良好的人成纤维细胞计数并分别接种于1-3号培养皿中，控制每皿细胞数为1×105个细胞，在37℃，5% CO2环境下培养过夜，弃培养基，将实施例1制备的透明质酸寡糖样品加入3号培养皿中，加入量为5g，对细胞作用6h，然后分别向1-3号培养皿中加入无血清DMEM培养液，6h后去掉培养液加入少量的磷酸盐缓冲液（PBS, pH 7.4, 0.01 mol/L），以刚好覆盖细胞为宜，然后以UVA刺激2-3号培养皿的细胞，控制UVA的辐射量为10 mJ/cm2，1号不使用UVA刺激，作为空白对照，结束后继续将实施例1制备的透明质酸寡糖样品加入3号培养皿中，加入量为5g，培养24h后，阳性药为50µg/ml的维生素C溶液，取出，置于冰上，PBS洗涤2次；加入500 uL裂解液裂解细胞，12000 g 4℃下离心5 min，取上清得到细胞裂解上清液，对上清液中CoL-I的含量测定，测定结果见图7所示；其中，X为胶原蛋白含量，单位是ng/ml，Y轴是吸光度。
图8为氧化应激细胞内一型胶原蛋白含量的影响，由图8可以看出，实施例1制备的透明质酸寡糖样品能提高细胞内一型胶原的含量。
试验例6成纤维细胞中HA的测定
取3个96cm培养皿，编号1-3号培养皿，取对数生长期状态良好的人成纤维细胞计数并分别接种于1-3号培养皿中，控制每皿细胞数为1×105个细胞，在37℃，5% CO2环境下培养过夜，弃培养基，将实施例1制备的透明质酸寡糖样品加入3号培养皿中，加入量为5g，对细胞作用6h，然后分别向1-3号培养皿中加入无血清DMEM培养液，6h后去掉培养液加入少量的磷酸盐缓冲液（PBS, pH 7.4, 0.01 mol/L），以刚好覆盖细胞为宜，以过氧化氢刺激1-3号培养皿，刺激浓度为1000μmol/ml，作用两h，结束后继续将实施例1制备的透明质酸寡糖样品加入3号培养皿中，加入量为5g，作用24h后，阳性药为50μg/ml的维生素C溶液，取出，置于冰上，磷酸盐缓冲液（PBS, pH 7.4, 0.01 mol/L）洗涤2次；加入500 uL裂解液裂解细胞，12000g 4℃下离心5min，取上清得到细胞裂解上清液。上清液中HA的含量测定参考ELISA试剂盒 （南京建成）检测步骤，结果需要BCA含量校正，见图9所示，X为胶原蛋白含量，单位是ng/ml，Y轴是吸光度。
图10为样品对过氧化氢引起的氧化应激细胞内透明质酸含量的影响，由图10可以看出，实施例1制备的透明质酸寡糖样品能提高细胞内透明质酸的含量。
试验例7实施例1制备的透明质酸寡糖样品的检测结果
试验例8由实施例1制备的透明质酸寡糖制备的寡糖玻尿酸修护次抛精华液配方
根据本试验例中配方，加入实施例1制备的透明质酸寡糖，能够得到良好保持皮肤状态的次抛精华液。

Claims (1)

1.一种实时调控酶活制备高活性透明质酸寡糖组合物的方法，其特征在于，所述方法具体为：
（1）溶解
将透明质酸钠溶于纯化水中,然后于30℃下,以100rpm的搅拌速度搅拌30min,得到透明质酸钠水溶液；
其中，透明质酸钠与纯化水的重量比为1:10；
所述透明质酸钠的分子量为40万；
（2）制备促酶解剂
将凹凸棒土粘土、醋酸加入去离子水中，然后升温至40℃，以300rpm的搅拌速度搅拌1h，加入质量浓度为7%的硝酸锰水溶液、质量浓度为4%的氯化锌水溶液、醋酸钠、醋酸锌，继续搅拌30min，然后加入质量分数为10%的氢氧化钠水溶液，继续搅拌35min后，于45℃下静置45min，得到初级反应液，将初级反应液进行降温加压处理，控制降温加压处理过程中的温度为10℃，压力为0.2MPa，时间为20min，降温加压处理结束，得到反应液，对反应液进行离心，控制离心过程中的转速为5000rpm，时间为5min，离心结束得到初级促酶解剂，使用去离子水对初级促酶解剂清洗3次后，于60℃下干燥50min，然后破碎至粒径为1mm，得到促酶解剂；
其中，凹凸棒土粘土、醋酸、去离子水、质量浓度为7%的硝酸锰水溶液、质量浓度为4-5%的氯化锌水溶液、醋酸钠、醋酸锌、质量分数为10%的氢氧化钠水溶液的重量比为100:120:1800:60:75:40:28:55；
（3）一次酶解
向透明质酸钠水溶液中加入促酶解剂、透明质酸酶，将温度控制至36℃，然后进行超声处理，控制超声处理的频率为50kHz，时间为2h，超声处理结束，得到一次酶解液；
其中，透明质酸钠水溶液、促酶解剂、透明质酸酶的重量比为20:0.1:0.2；
所述透明质酸酶的活性为20000U/mL；
所述透明质酸酶为根据专利申请号为2019113654980，专利名称为一种肠杆菌及其应用中实施例1的方法制备的透明质酸粗酶液进行纯化后制得；
（4）二次酶解
向一次酶解液中加入氧化铝、透明质酸钠水溶液，将温度控制至42℃，然后进行超声处理，控制超声处理的频率为35kHz，时间为2h，超声处理结束，在95℃下灭酶处理10min，得到二次酶解液，将二次酶解液进行离心，控制离心过程中的转速为4000rpm，时间为6min，离心结束去除沉淀部分，得到二次酶解液；
其中，一次酶解液、氧化铝、透明质酸钠水溶液的重量比为600:10:60；
（5）层析纯化
利用色谱层析技术对二次酶解液进行分离纯化，使用的仪器：蛋白纯化层析仪，层析柱：50BV=4.65ml，上样量：10mg/ml，流动相A：25mMNaAc-HAc，流动相B：25mMNaAc-HAc+0.3mMNaCl，流动相C：25mMNaAc-HAc+1mMNaCl，控制流动相pH为6，流速2ml/min，波长210nm；
在分离纯化时，首先把样品溶液pH调节至与流动相pH一致后，梯度洗脱条件：经流动相A平衡柱子45min，平衡柱子后逐步在1.2h内逐步提高B的比例至50%，后继续洗脱提高至B的比例至100%，继续洗脱1h，调高至流动相C的比例至100%，将目标峰对应的洗脱液进行收集，得到目标洗脱液；
（6）纳滤
将目标洗脱液进行超滤脱盐浓缩，控制超滤脱盐浓缩中膜的孔径为100Da，温度为25℃，超滤脱盐浓缩结束得到纳滤液；
（7）除菌与物料干燥
将纳滤液经过0.25µm的聚偏氟乙烯材质滤芯过滤后，进行真空冷冻干燥，真空冷冻干燥结束得到透明质酸寡糖；
所述真空冷冻干燥共分七个阶段，具体为：阶段一的温度为-30℃，时间为4h；阶段二的温度为-20℃，时间为2h；阶段三的温度为-5℃，时间为2h；阶段四的温度为0℃，时间为4h；阶段五的温度为5℃，时间为2h；阶段六的温度为20℃，时间为2h；阶段七的温度为30℃，时间为10h；
所述真空冷冻干燥过程中的真空度为25Pa。
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