CN115873144B - 一种乙酰化小分子透明质酸钠及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本申请提供一种乙酰化小分子透明质酸钠及其制备方法和应用，涉及化妆品技术领域。该制备方法将小分子透明质酸钠与乙酰氯在甲酰胺溶液中反应，使用的试剂为非受管控试剂，制备安全，利于工业化生产，并且可在无催化剂条件下，较短时间内完成乙酰化反应，同时甲酰胺可与反应产生地盐酸结合，起到缚酸剂的作用，减少了盐酸对乙酰化小分子透明质酸钠的糖苷键的破坏；反应得到的乙酰化小分子透明质酸钠采用离子树脂进行纯化，无需碱液调节pH，从而避免了碱液加入过程中可能引起地乙酰化小分子透明质酸钠的乙酰基脱落风险，保证乙酰化小分子透明质酸钠的高乙酰基取代度，高收率。
Description
技术领域
本申请涉及化妆品技术领域，尤其涉及一种乙酰化小分子透明质酸钠及其制备方法和应用。
背景技术
透明质酸(Hyaluronic acid，HA)是D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺组成的双糖单位糖胺聚糖，具有很强的生物活性。分子量大小对透明质酸的生物活性影响较大，不同分子量范围的透明质酸表现出截然不同的生理学功能。高分子量的透明质酸(相对分子量>1000KDa)由于具有较好的粘弹性、保湿性、抑制炎性反应、润滑等功能，可应用于高端化妆品行业、眼科手术黏弹剂和关节腔内注射治疗。中低分子量的透明质酸(相对分子量介于10KDa-1000KDa)具有良好的保湿性、润滑和药物缓释作用，可广泛用于化妆品、滴眼液、皮肤烧伤愈合及术后防粘连。小分子量的透明质酸(oHA，相对分子量低于5KDa)，表现出非常强的生物活性，具有抑制肿瘤扩散、促进创伤愈合、促进骨和血管生成、免疫调节等作用，且易于渗透到真皮中，作为免疫细胞、细胞因子的激活剂。
乙酰化透明质酸钠(Ac-HA)是将不同分子量透明质酸钠(相对分子量10KDa-3000KDa)经过乙酰化反应而得到的一种透明质酸衍生物，由于大量乙酰基的引入使得Ac-HA在原有亲水性的同时增加了其亲脂性，可发挥双倍保湿功效，并带有修复角质屏障、提高皮肤弹性等生物活性功能。但是现有Ac-HA制备工艺主要围绕分子量大于10KDa的HA进行，对于小分子量的透明质酸的乙酰化制备工艺尚未有研究。
发明内容
本申请的目的在于提供一种乙酰化小分子透明质酸钠及其制备方法和应用，旨在解决现有Ac-HA制备工艺主要围绕分子量大于10KDa的HA进行，对于小分子量的透明质酸的乙酰化制备工艺尚未有研究的问题。
为实现以上目的，本申请提供一种乙酰化小分子透明质酸钠的制备方法，包括：
将小分子透明质酸钠与乙酰氯在甲酰胺溶液中反应，得到产物；
将所述产物使用强碱性阴离子树脂进行吸附、洗脱，得到所述乙酰化小分子透明质酸钠。
优选地，所述小分子透明质酸钠包括：透明质酸二糖、透明质酸四糖、透明质酸六糖；平均分子量为800-1500Da。
优选地，所述小分子透明质酸钠按质量百分比计包括：13.5％-23.4％的透明质酸二糖，55.7％-65.4％的透明质酸四糖，11.2％-30.8％的透明质酸六糖。
优选地，所述小分子透明质酸钠与所述乙酰氯、所述甲酰胺的质量体积比例为1g：(1～3)ml：(2～5)ml。
优选地，所述反应温度为20-30℃，所述反应时间为15-60min。
优选地，将所述产物使用强碱性阴离子树脂进行吸附、洗脱，包括：
将所述产物使用强碱性阴离子树脂进行吸附；
再使用纯水对所述强碱性阴离子树脂进行预洗脱；
最后使用氯化钠对所述强碱性阴离子树脂进行洗脱。
优选地，得到所述乙酰化小分子透明质酸钠后，还包括：
将所述乙酰化小分子透明质酸钠用有机膜设备浓缩，再经低温冷冻干燥制得乙酰化小分子透明质酸钠粉剂；
优选地，所述有机膜设备的纳滤膜孔径为150-250Da。
本申请还提供一种乙酰化小分子透明质酸钠，由上述的乙酰化小分子透明质酸钠的制备方法制备得到。
本申请还提供上述的乙酰化小分子透明质酸钠在制备化妆品中的应用。
优选地，所述化妆品包括：精华液、清洁霜、润肤霜、润肤乳液中的任一种。
与现有技术相比，本申请的有益效果包括：
本申请提供的乙酰化小分子透明质酸钠的制备方法将小分子透明质酸钠与乙酰氯在甲酰胺溶液中反应，该制备方法使用的试剂为非受管控试剂，制备安全，利于工业化生产，并且可在无催化剂条件下，较短时间内完成乙酰化反应，同时甲酰胺可与反应产生地盐酸结合，起到缚酸剂的作用，减少了盐酸对乙酰化小分子透明质酸钠的糖苷键的破坏；反应得到的乙酰化小分子透明质酸钠采用离子树脂进行纯化，无需碱液调节pH，从而避免了碱液加入过程中可能引起地乙酰化小分子透明质酸钠的乙酰基脱落风险，保证乙酰化小分子透明质酸钠的高乙酰基取代度。通过本申请制备工艺制备所得乙酰化小分子透明质酸钠的乙酰基取代度高，制备收率高，产废水量少，环境友好。
用强碱性阴离子树脂纯化乙酰化小分子透明质酸钠，树脂上季铵基团在水中的解离使其自身成正电，从而与乙酰化小分子透明质酸钠羧基(带负电)吸附结合，而甲酰胺不带负电荷，无法与树脂吸附结合，从而使乙酰化小分子透明质酸钠与甲酰胺分离，用少量纯水去除残留于树脂间的甲酰胺，再用一定浓度氯化钠将乙酰化小分子透明质酸钠从树脂上完全解析下来，再经有机纳滤膜(膜孔径150-250Da)截留乙酰化小分子透明质酸钠，水和氯化钠等杂质透过纳滤膜，纳滤前期浓缩并少量脱盐，后期加少量水透析氯化钠，从而提高乙酰化小分子透明质酸钠的质量。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本申请的某些实施例，因此不应被看作是对本申请范围的限定。
图1为本申请的乙酰化小分子透明质酸钠的制备方法的流程示意图；
图2为不同浓度的本申请的乙酰化小分子透明质酸钠处理细胞后的细胞活力结果图；
图3为本申请的乙酰化小分子透明质酸钠的体外透皮吸收结果图；
图4为乙酰化反应过程的示意图。
具体实施方式
如本文所用之术语：
“由……制备”与“包含”同义。本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
连接词“由……组成”排除任何未指出的要素、步骤或组分。如果用于权利要求中，此短语将使权利要求为封闭式，使其不包含除那些描述的材料以外的材料，但与其相关的常规杂质除外。当短语“由……组成”出现在权利要求主体的子句中而不是紧接在主题之后时，其仅限定在该子句中描述的要素；其它要素并不被排除在作为整体的所述权利要求之外。
当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1～5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1～4”、“1～3”、“1～2”、“1～2和4～5”、“1～3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。
在这些实施例中，除非另有指明，所述的份和百分比均按质量计。
“质量份”指表示多个组分的质量比例关系的基本计量单位，1份可表示任意的单位质量，如可以表示为1g，也可表示2.689g等。假如我们说A组分的质量份为a份，B组分的质量份为b份，则表示A组分的质量和B组分的质量之比a：b。或者，表示A组分的质量为aK，B组分的质量为bK(K为任意数，表示倍数因子)。不可误解的是，与质量份数不同的是，所有组分的质量份之和并不受限于100份之限制。
“和/或”用于表示所说明的情况的一者或两者均可能发生，例如，A和/或B包括(A和B)和(A或B)。
本申请提供一种乙酰化小分子透明质酸钠的制备方法，请参阅图1，包括：
S100：将小分子透明质酸钠与乙酰氯在甲酰胺溶液中反应，得到产物。
其中，该小分子透明质酸钠的制备方法包括：使用水蛭来源的透明质酸酶将透明质酸水解，经超滤除蛋白、纳滤浓缩后，喷雾干燥制得所述小分子透明质酸钠。该小分子透明质酸钠包括：透明质酸二糖、透明质酸四糖、透明质酸六糖；平均分子量为800-1500Da。该小分子透明质酸钠的平均分子量例如可以为800-1200Da，或800-1000Da，或1000-1500Da，更具体例如可以为(800、900、1000、1100、1200、1300、1400或1500)Da，或800-1500Da之间的任一值。
更具体的，该小分子透明质酸钠按质量百分比计包括：13.5％-23.4％的透明质酸二糖，55.7％-65.4％的透明质酸四糖，11.2％-30.8％的透明质酸六糖。
其中，透明质酸钠是以二糖为基准单元组成直链多糖，单个二糖上含有四个羟基，四个羟基可与乙酰化试剂发生取代反应，从而生成乙酰化透明质酸钠。
将小分子透明质酸钠与乙酰氯在甲酰胺溶液中反应，具体为：先将小分子透明质酸钠与甲酰胺溶液混合，以将小分子透明质酸钠溶解在甲酰胺溶液中，然后在溶解了小分子透明质酸钠的甲酰胺溶液中加入乙酰氯，进行乙酰化反应，乙酰氯的乙酰基与小分子透明质酸钠的羟基发生取代反应，乙酰化反应过程如图4所示。
其中，小分子透明质酸钠与乙酰氯、甲酰胺的质量体积比例为1g：(1～3)ml：(2～5)ml，例如可以为1g：(1～2)ml：(2～4)ml，或1g：(1～1.5)ml：(2～3)ml，更具体的例如可以为1g：1ml：2ml，或1g：2ml：3ml，或1g：2ml：4ml，或1g：3ml：5ml。
其中，反应温度为20-30℃，反应时间为15-60min，例如可以为20-50min，或20-40min，或30-40min，更具体的例如可以为15min、20min、25min、30min、35min、40min、45min、50min、55min或60min。
本申请提供的乙酰化小分子透明质酸钠的制备方法将小分子透明质酸钠与乙酰氯在甲酰胺溶液中反应，该制备方法使用的试剂为非受管控试剂，制备安全，利于工业化生产，并且可在无催化剂条件下，较短时间内完成乙酰化反应，同时甲酰胺可与反应产生地盐酸结合，起到缚酸剂的作用，减少了盐酸对乙酰化小分子透明质酸钠的糖苷键的破坏。
S200：将产物使用强碱性阴离子树脂进行吸附、洗脱，得到乙酰化小分子透明质酸钠。
反应得到的乙酰化小分子透明质酸钠采用强碱性阴离子树脂进行纯化，强碱性阴离子树脂可以吸附乙酰化小分子透明质酸钠，甲酰胺无法与强碱性阴离子树脂吸附交换，从而将乙酰化小分子透明质酸钠与甲酰胺分开，吸附了乙酰化小分子透明质酸钠的强碱性阴离子树脂再经少量纯水预洗脱，可完全去除甲酰胺，再经低浓度氯化钠洗脱，将乙酰化小分子透明质酸钠从强碱性阴离子树脂解析下来，得到高纯乙酰化小分子透明质酸钠，此步离子层析收率高，废水量少，环境友好。
通过强碱性阴离子树脂交换层析纯化反应得到的乙酰化小分子透明质酸钠，无需碱液调节pH，从而避免了碱液加入过程中可能引起地乙酰化小分子透明质酸钠的乙酰基脱落风险，保证乙酰化小分子透明质酸钠的高乙酰基取代度，该制备工艺制备所得乙酰化小分子透明质酸钠的乙酰基取代度高。
优选地，将所述产物使用强碱性阴离子树脂进行吸附、洗脱，包括：
先将产物使用强碱性阴离子树脂进行吸附。
其中，在步骤S100的反应终止液中加入1-5倍体积的纯水，淬灭反应，然后将淬灭液直接上强碱性阴离子交换树脂(凝胶型苯乙烯系-季铵基团-OH-型)交换吸附，树脂量：450g(600ml)。
再使用纯水对所述强碱性阴离子树脂进行预洗脱。
其中，乙酰化小分子透明质酸钠上柱后，再以600-1200ml纯水进行预洗脱，除去树脂间残留的甲酰胺。
最后使用氯化钠对所述强碱性阴离子树脂进行洗脱。
其中，使用1200-2400ml浓度为0.1M的氯化钠溶液洗脱，解析吸附于树脂上的乙酰化小分子透明质酸钠。
上柱及洗脱流速均控制在1.5-2BV/H，层析收率达到95％。
用强碱性阴离子树脂纯化乙酰化小分子透明质酸钠，树脂上季铵基团在水中的解离使其自身成正电，从而与乙酰化小分子透明质酸钠羧基(带负电)吸附结合，而甲酰胺不带负电荷，无法与树脂吸附结合，从而使乙酰化小分子透明质酸钠与甲酰胺分离，用少量纯水去除残留于树脂间的甲酰胺，再用一定浓度氯化钠将乙酰化小分子透明质酸钠从树脂上完全解析下来。
在一优选方案中，得到所述乙酰化小分子透明质酸钠后，还包括：
将乙酰化小分子透明质酸钠用有机膜设备浓缩，再经低温冷冻干燥制得乙酰化小分子透明质酸钠粉剂。
其中，将离子树脂的洗脱收集液经有机膜设备浓缩处理，有机膜设备的纳滤膜膜孔径为150-250Da，纳滤膜截留乙酰化小分子透明质酸钠，水和氯化钠等一价离子可透过纳滤膜，前期对物料浓缩，后期少量多次加水透析脱盐，以提高乙酰化小分子透明质酸钠纯度，纳滤收率可达95％。
本申请还提供一种乙酰化小分子透明质酸钠，由上述的乙酰化小分子透明质酸钠的制备方法制备得到。
本申请还提供上述的乙酰化小分子透明质酸钠在制备化妆品中的应用。
优选地，所述化妆品包括：精华液、清洁霜、润肤霜、润肤乳液中的任一种。
下面将结合具体实施例对本申请的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本申请，而不应视为限制本申请的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下述实施例和对比例使用的小分子透明质酸钠按质量百分比计为：13.5％-23.4％的透明质酸二糖、55.7％-65.4％的透明质酸四糖和11.2％-30.8％的透明质酸六糖。
实施例1
1)将50g oHA置入500ml三孔圆底烧瓶，再将150ml甲酰胺加入圆底烧瓶，常温密封状态下搅拌30min，使oHA完全溶解，再用分液漏斗将50ml乙酰氯缓慢加入圆底烧瓶溶液中，10min滴加完全，20-30℃反应30min。
2)将反应终止液加入800ml纯水中，使反应淬灭，再将1000ml混液进行离子交换树脂吸附(凝胶型苯乙烯系-季铵基团-活化成OH-型)，待物料吸附完全后，用1200ml去离子水除去残留于树脂间的甲酰胺，再用1800ml 0.1M氯化钠溶液洗脱，将Ac-oHA从树脂上解析，收集洗脱收集液。
3)将洗脱收集液纳滤(膜孔径150-250Da)浓缩脱盐，物料浓缩至固含为6％时，少量多次加水透析至物料电导无明显下降后停止透析，再将浓缩液用0.22um膜除菌，放置于冷冻干燥机中冷冻干燥。
4)干燥完全后，收得60.21g白色晶状Ac-oHA，乙酰基取代度3.50。
实施例2
1)将50g oHA置入500ml三孔圆底烧瓶，再将150ml甲酰胺加入圆底烧瓶，常温密封状态下搅拌30min，使oHA完全溶解，再用分液漏斗将60ml乙酰氯缓慢加入圆底烧瓶溶液中，10min滴加完全，20-30℃反应30min。
2)将反应终止液加入800ml纯水中，使反应淬灭，再将1000ml混液进行离子交换树脂吸附(凝胶型苯乙烯系-季铵基团-活化成OH-型)，待物料吸附完全后，用1200ml去离子水除去残留于树脂间的甲酰胺，再用1800ml 0.1M氯化钠溶液洗脱，将Ac-oHA从树脂上解析，收集洗脱收集液。
3)将洗脱收集液纳滤(膜孔径150-250Da)浓缩脱盐，物料浓缩至固含为6％时，少量多次加水透析至物料电导无明显下降后停止透析，再将浓缩液用0.22um膜除菌，放置于冷冻干燥机中冷冻干燥。
4)干燥完全后，收得63.75g白色晶状Ac-oHA，乙酰基取代度3.74。
实施例3
1)将50g oHA置入500ml三孔圆底烧瓶，再将150ml甲酰胺加入圆底烧瓶，常温密封状态下搅拌30min，使oHA完全溶解，再用分液漏斗将70ml乙酰氯缓慢加入圆底烧瓶溶液中，10min滴加完全，20-30℃反应30min。
2)将反应终止液加入800ml纯水中，使反应淬灭，再将1000ml混液进行离子交换树脂吸附(凝胶型苯乙烯系-季铵基团-活化成OH-型)，待物料吸附完全后，用1200ml去离子水除去残留于树脂间的甲酰胺，再用1800ml 0.1M氯化钠溶液洗脱，将Ac-oHA从树脂上解析，收集洗脱收集液。
3)将洗脱收集液纳滤(膜孔径150-250Da)浓缩脱盐，物料浓缩至固含为6％时，少量多次加水透析至物料电导无明显下降后停止透析，再将浓缩液用0.22um膜除菌，放置于冷冻干燥机中冷冻干燥。
4)干燥完全后，收得64.05g白色晶状Ac-oHA，乙酰基取代度3.88。
实施例4
1)将50g oHA置入500ml三孔圆底烧瓶，再将150ml甲酰胺加入圆底烧瓶，常温密封状态下搅拌30min，使oHA完全溶解，再用分液漏斗将60ml乙酰氯缓慢加入圆底烧瓶溶液中，10min滴加完全，20-30℃反应30min。
2)将反应终止液加入800ml纯水中，使反应淬灭，再将1000ml混液进行离子交换树脂吸附(苯乙烯系－NR3OH-活化成OH-型)，待物料吸附完全后，用1200ml去离子水除去残留于树脂间的甲酰胺，再用1800ml0.1M氯化钠溶液洗脱，将Ac-oHA从树脂上解析，收集洗脱收集液。
3)将洗脱收集液纳滤(膜孔径150-250Da)浓缩脱盐，物料浓缩至固含为6％时，少量多次加水透析至物料电导无明显下降后停止透析，再将浓缩液用0.22um膜除菌，放置于冷冻干燥机中冷冻干燥。
4)干燥完全后，收得58.05g白色晶状Ac-oHA，乙酰基取代度3.84。
对比例1
1)将50g oHA置入500ml三孔圆底烧瓶，再将150ml甲酰胺加入圆底烧瓶，常温密封状态下搅拌30min，使oHA完全溶解，再用分液漏斗将20ml乙酰氯缓慢加入圆底烧瓶溶液中，10min滴加完全，20-30℃反应30min。
2)将反应终止液加入800ml纯水中，使反应淬灭，再将1000ml混液进行离子交换树脂吸附(凝胶型苯乙烯系-季铵基团-OH-型)，待物料吸附完全后，用1200ml去离子水除去残留于树脂间的甲酰胺，再用1800ml 0.1M氯化钠溶液洗脱，将Ac-oHA从树脂上解析，收集洗脱收集液。
3)将洗脱收集液纳滤(膜孔径150-250Da)浓缩脱盐，物料浓缩至固含为6％时，少量多次加水透析至物料电导无明显下降后停止透析，再将浓缩液用0.22um膜除菌，放置于冷冻干燥机中冷冻干燥。
4)干燥完全后，收得25.5g白色晶状Ac-oHA，乙酰基取代度1.71。与实施例1相比，对比例1使用20ml乙酰氯，过低的乙酰氯会使乙酰基取代度和回收率均降低。
对比例2
1)将50g oHA置入500ml三孔圆底烧瓶，再将150ml甲酰胺加入圆底烧瓶，常温密封状态下搅拌30min，使oHA完全溶解，再用分液漏斗将50ml乙酰氯缓慢加入圆底烧瓶溶液中，10min滴加完全，60-70℃反应30min。
2)将反应终止液加入800ml纯水中，使反应淬灭，再将1000ml混液进行离子交换树脂吸附(凝胶型苯乙烯系-季铵基团-OH-型)，待物料吸附完全后，用1500ml去离子水除去残留于树脂间的甲酰胺，再用2400ml 0.1M氯化钠溶液洗脱，将Ac-oHA从树脂上解析，收集洗脱收集液。
3)将洗脱收集液纳滤(膜孔径150-250Da)浓缩脱盐，物料浓缩至固含为6％时，少量多次加水透析至物料电导无明显下降。
4)干燥完全后，收得40.1g淡黄色颗粒状Ac-oHA，乙酰基取代度2.45。与实施例1相比，对比例2采用的反应温度为60-70℃，乙酰基取代度和回收率均降低。
对比例3
1)将50g oHA置入500ml三孔圆底烧瓶，再将150ml甲酰胺加入圆底烧瓶，常温密封状态下搅拌30min，使oHA完全溶解，再用分液漏斗将50ml乙酰氯缓慢加入圆底烧瓶溶液中，10min滴加完全，20-30℃反应30min。
2)将反应终止液加入800ml纯水中，使反应淬灭，再将1000ml混液进行离子交换树脂吸附(凝胶型苯乙烯系-季铵基团-Cl-型)，待物料吸附完全后，用1200ml去离子水除去残留于树脂间的甲酰胺，再用1800ml 0.1M氯化钠溶液洗脱，将Ac-oHA从树脂上解析，收集洗脱收集液。
3)将洗脱收集液纳滤(膜孔径150-250Da)浓缩脱盐，物料浓缩至固含为6％时，少量多次加水透析至物料电导无明显下降后停止透析，再将浓缩液用0.22um膜除菌，放置于冷冻干燥机中冷冻干燥。
4)干燥完全后，收得32.5g白色晶状Ac-oHA，乙酰基取代度2.61。相对于实施例1，对比例3采用凝胶型苯乙烯系-季铵基团-Cl-型离子交换树脂进行纯化，Cl-型是采用HCl转换而来，交换过程会有适量H+产生而使物料过酸，过酸易使乙酰基脱落或糖苷键断裂，使得乙酰基取代度和回收率均降低。
对比例4
1)将50g oHA置入500ml三孔圆底烧瓶，再将150ml甲酰胺加入圆底烧瓶，常温密封状态下搅拌30min，使oHA完全溶解，再用分液漏斗将40ml乙酰氯缓慢加入圆底烧瓶溶液中，10min滴加完全，20-30℃反应30min。
2)将反应终止液加入800ml纯水中，使反应淬灭，再将1000ml混液进行离子交换树脂吸附(苯乙烯-二乙烯系-仲胺基-活化成OH-型)，待物料吸附完全后，用1200ml去离子水除去残留于树脂间的甲酰胺，再用1800ml 0.1M氯化钠溶液洗脱，将Ac-oHA从树脂上解析，收集洗脱收集液。
3)将洗脱收集液纳滤(膜孔径150-250Da)浓缩脱盐，物料浓缩至固含为6％时，少量多次加水透析至物料电导无明显下降后停止透析，再将浓缩液用0.22um膜除菌，放置于冷冻干燥机中冷冻干燥。
4)干燥完全后，收得23.2g白色乙酰化oHA粉末，乙酰基取代度3.11。相对于实施例1，对比例4采用苯乙烯-二乙烯系-仲胺基-OH-型离子交换树脂进行纯化，苯乙烯-二乙烯系-仲胺基-OH-型离子交换树脂为弱阴离子树脂，对Ac-OHA吸附量偏低，使得乙酰基取代度和回收率均降低。
试验例1细胞毒理测试
1)细胞接种：按8×103个/孔的接种密度接种细胞至96孔板，培养箱(37℃、5％CO2)中孵育过夜。
2)实验分组：实验设置调零组、对照组、阳性对照组与样品组。样品组中，每个样品设置8个浓度梯度，每个浓度梯度下设置3个重复孔，以实施例2制备所得Ac-oHA进行测试。
3)配液：按测试浓度设定表(表1)配制不同浓度的样品工作液。
表1测试浓度设定表
4)给药：待96孔板中细胞铺板率达到40％～60％时进行给药。对照组每孔加入200μL含10％PBS的培养液；阳性对照组每孔加入200μL含10％DMSO的培养液；样品组每孔加入200μL含有相应浓度样品的培养液；调零组无细胞接种，仅加入200μL细胞培养液。给药完成后将96孔板放置在培养箱(37℃、5％CO2)中培养。
5)检测：细胞孵育培养24h后，弃掉上清，加入含0.5mg/mL的MTT的培养基，37℃避光孵育4h，孵育结束后，弃掉上清每孔加100μL DMSO，在490nm处读取OD值。
6)细胞相对活力计算：根据如下公式计算。
7)细胞毒性检测结果：
样品设定6个给药浓度，在成纤维细胞上开展细胞毒性检测实验，MTT检测结果如表2所示。
以样品所选6个浓度为横坐标，细胞相对活力值为纵坐标，绘制细胞相对活力图，如图2所示。故根据MTT结果，样品Ac-oHA在2.00％(m/V)浓度范围内未表现出成纤维细胞毒性。
表2样品MTT检测结果
试验例2透皮吸收测试
测定采用改良的Franz扩散池，将皮肤固定在供给池与接受池之间，皮肤表层向上，供给池中分别加入6mg/mL乙酰大分子透明质酸钠(Ac-HA)、小分子透明质酸钠(oHA)和实施例2制备的乙酰小分子透明质酸钠(Ac-oHA)的样品溶液1mL，接受池中加入10mL 0.8％的生理盐水，设置搅拌转速350r/min，温度32±0.5℃，分别于2h、4h、6h、8h、10h、12h和24h取1mL接受液，并补加等量的新鲜接受液。测定样品中糖醛酸含量，并以此计算单位面积累计透过量。
具体计算公式如下：
式中Qn：t时间样品的单位面积累计透过量(μg/cm2)；A：透皮扩散面积(3cm2)；Cn：t时间浓度测定值；Ci：t时间之前浓度测定值；V：接受池总体积(10mL)；Vo：取样体积(1mL)；J：透皮速率常数。作Qn对t的曲线得回归方程，斜率即为透皮速率常数。测试数据如表3所示，并根据表3的数据制得图3。
表3透皮吸收测试结果
体外透皮吸收实验表明：因Ac-HA的分子量相对较大，导致其单位面积累积透过量低，10h累计透过量为0.24μg/cm2，而且随着时间的延长，单位面积累积透过量增长缓慢，24h达到0.31μg/cm2；而oHA和Ac-oHA的单位面积累积透过量随着时间的延长呈线性增加，Ac-oHA的单位面积累积透过量高于oHA，而且两者明显高于Ac-HA，在12h时单位面积累积透过量分别为0.81μg/cm2(oHA)和1.1μg/cm2(Ac-oHA)，而且随着时间的延长，单位面积累积透过量持续增加，在24小时分别达到1.3μg/cm2(oHA)和1.6μg/cm2(Ac-oHA)，两者均表现出了良好的持久透皮吸收性。
透皮吸收系数反应透皮吸收率，Ac-oHA的24小时透皮吸收系数为0.0563，R2：0.9954，oHA的24小时透皮吸收系数为0.0496，R2：0.9935，两者线性优良；Ac-HA的24小时透皮吸收系数为0.0189，R2：0.8989，线性较差；透皮吸收系数表明Ac-oHA有更优于oHA和Ac-HA的透皮吸收性能。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本申请的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本申请进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本申请各实施例技术方案的范围。
此外，本领域的技术人员能够理解，尽管在此的一些实施例包括其它实施例中所包括的某些特征而不是其它特征，但是不同实施例的特征的组合意味着处于本申请的范围之内并且形成不同的实施例。例如，在上面的权利要求书中，所要求保护的实施例的任意之一都可以以任意的组合方式来使用。公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在加深对本申请的总体背景技术的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域技术人员所公知的现有技术。
Claims (6)
1.一种乙酰化小分子透明质酸钠的制备方法，其特征在于，包括：
将小分子透明质酸钠与乙酰氯在甲酰胺溶液中反应，得到产物；
将所述产物使用强碱性阴离子树脂进行吸附、洗脱，得到所述乙酰化小分子透明质酸钠；
所述小分子透明质酸钠包括：透明质酸二糖、透明质酸四糖和透明质酸六糖；
平均分子量为800-1500 Da；
所述小分子透明质酸钠与所述乙酰氯、所述甲酰胺的质量体积比例为1g：（1~3）ml：（2~5）ml；
所述反应温度为20-30℃，所述反应时间为15-60min；
所述强碱性阴离子树脂包括苯乙烯系－NR3OH -活化成OH-型和凝胶型苯乙烯系-季铵基团-活化成OH-型中的一种或多种；
将所述产物使用强碱性阴离子树脂进行吸附、洗脱，包括：
将所述产物使用强碱性阴离子树脂进行吸附；
再使用纯水对所述强碱性阴离子树脂进行预洗脱；
最后使用氯化钠对所述强碱性阴离子树脂进行洗脱；
将所述乙酰化小分子透明质酸钠用有机膜设备浓缩，再经低温冷冻干燥制得乙酰化小分子透明质酸钠粉剂。
2.根据权利要求1所述的乙酰化小分子透明质酸钠的制备方法，其特征在于，所述小分子透明质酸钠按质量百分比计包括：13.5%-23.4%的透明质酸二糖，55.7%-65.4%的透明质酸四糖，11.2%-30.8%的透明质酸六糖。
3.根据权利要求1所述的乙酰化小分子透明质酸钠的制备方法，其特征在于，所述有机膜设备的纳滤膜孔径为150-250 Da。
4.一种乙酰化小分子透明质酸钠，其特征在于，由权利要求1至3任一项所述的乙酰化小分子透明质酸钠的制备方法制备得到。
5.权利要求4所述的乙酰化小分子透明质酸钠在制备化妆品中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述化妆品包括：精华液、清洁霜、润肤霜、润肤乳液中的任一种。
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