CN114288308A - 一种以四糖为主的透明质酸寡糖组合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种透明质酸寡糖组合物,在所述透明质酸寡糖组合物中,透明质酸四糖所占的质量比大于等于70%。与现有技术相比,本发明的透明质酸寡糖组合物组成简单,其中透明质酸四糖所占的质量比在70%以上。本发明的透明质酸寡糖组合物具有促进皮肤神经酰胺合成的能力,在食品保健、化妆品及临床医疗领域有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域,具体地,涉及一种以四糖为主的透明质酸寡糖组合物及其制备方法和应用。
背景技术
透明质酸(HA)是一种由D-葡糖醛酸和N-乙酰氨基葡糖的双糖单位重复连接构成的酸性黏多糖,广泛存在于动物的组织细胞间质和某些细菌的夹膜中。国内外已经对HA的分布、化学结构、理化性质以及应用进行了广泛而深入的研究,其在医药、化妆品、食品等领域有广泛而独特的应用价值。透明质酸寡糖(o-HA)属于小分子多糖,其性质与普通HA有很大不同,甚至具有完全相反的作用。透明质酸寡糖(单糖残基数量为2~40(一般为4~16))的表现出非常强的生物活性,具有促进创口愈合、促进骨和血管生成、逆转肿瘤细胞耐药性等作用,且易于渗透到真皮中。因此,HA寡糖在食品保健、化妆品及临床医疗领域有广阔的应用前景。
专利CN 111040048 A公开了一种利用大分子透明质酸为原料,经过透明质酸酶水解、加热灭活、活性炭过滤及喷雾干燥等生产工艺,可得到平均分子量低于1200道尔顿的超低分子量透明质酸,虽然其中含有一定比例的HA4和HA6,但是还含有很高比例的HA2、HA8、HA10等。
专利CN 103484513A公开了一种通过控制加酶量和酶解时间酶解高分子透明质酸制备四糖、六糖、八糖、十糖等特定小分子寡聚透明质酸,但是该方法是利用经镍柱纯化的纯酶来酶解的,酶的成本高,难以实现工业化。该方法仅仅是在1ml体系下进行的酶反应,放大后的酶解效果尚未可知。
专利CN 104610467 B公开了一种利用Q琼脂糖凝胶FF填充的离子交换柱分离,利用Super Peptide 10/300GL凝胶柱脱盐,分离HA寡糖的方法。专利CN 109517012公开了一种利用离子交换柱对透明质酸寡糖组合物进行分离、脱盐制备克级寡糖的方法。但是,利用这两种方法因纯化成本的限制,很难实现HA寡糖的工业化制备和市场应用。
发明内容
针对现有技术存在的问题,本发明提供一种透明质酸寡糖组合物及其制备方法和用途。
具体来说,本发明涉及如下方面:
1.一种透明质酸寡糖组合物,其特征在于,在所述透明质酸寡糖组合物中,透明质酸四糖所占的质量比大于等于70%,优选大于等于70.5%。
2.根据项1所述的透明质酸寡糖组合物,其特征在于,在所述透明质酸寡糖组合物中,透明质酸寡糖的还原末端均为糖醛酸或均为N-乙酰葡糖胺。
3.根据项1所述的透明质酸寡糖组合物,其特征在于,所述透明质酸寡糖组合物还包括透明质酸二糖、透明质酸六糖、透明质酸八糖和透明质酸十糖中的一种或两种以上。
4.根据项3所述的透明质酸寡糖组合物,其特征在于,在所述透明质酸寡糖组合物中,透明质酸二糖所占的质量比为17-19%,透明质酸六糖所占的质量比为1-3%,透明质酸八糖所占的质量比为0-1%,透明质酸十糖所占的质量比为0-1%。
5.一种如项1-4中任一项所述的透明质酸寡糖组合物的制备方法,其特征在于,所述制备方法包括以下步骤:
将透明质酸用透明质酸酶进行酶解反应;
分离酶解反应物以得到产物原液;
对所述产物原液进行浓缩以得到产物浓缩液;
将所述产物浓缩液干燥得到透明质酸寡糖组合物。
6.根据项5所述的方法,其特征在于,在所述酶解反应中,所述透明质酸的初始浓度为10-30g/L,优选地,所述透明质酸的分子量为1300-2000kDa。
7.根据项5所述的方法,其特征在于,所述透明质酸酶的含量为1×105-5×105U/mL。项
8.根据项5所述的方法,其特征在于,所述酶解反应的时间为44-48h,酶解温度为44-46℃。
9.根据项5所述的方法,其特征在于,对所述产物原液进行浓缩以得到产物浓缩液包括:
使所述产物原液通过截留分子量为900-1100Da的超滤膜,收集透过液;
将所述透过液通过截留分子量为500-700Da的超滤膜,收集截留液得到产物浓缩液。
10.项1-4中任一项所述的透明质酸寡糖组合物在促进神经酰胺合成中的用途。
与现有技术相比,本发明的透明质酸寡糖组合物组成简单,其中透明质酸四糖所占的质量比在70%以上。本发明的透明质酸寡糖组合物具有促进皮肤神经酰胺合成的能力,在食品保健、化妆品及临床医疗领域有广阔的应用前景。
附图说明
图1为实施例1中透明质酸寡糖组合物的高效液相色谱图。
图2为实施例2中透明质酸寡糖组合物的高效液相色谱图。
图3为实施例3中透明质酸寡糖组合物的高效液相色谱图。
图4为对比例1中透明质酸寡糖组合物的高效液相色谱图。
图5为对比例2中透明质酸寡糖组合物的高效液相色谱图。
图6为对比例3中透明质酸寡糖组合物的高效液相色谱图。
图7为实施例的透明质酸寡糖组合物的还原端鉴定结果。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明,应当理解,实施例仅用于进一步说明和阐释本发明,并非用于限制本发明。
除非另外定义,本说明书中有关技术的和科学的术语与本领域内的技术人员所通常理解的意思相同。虽然在实验或实际应用中可以应用与此间所述相似或相同的方法和材料,本文还是在下文中对材料和方法做了描述。在相冲突的情况下,以本说明书包括其中定义为准,另外,材料、方法和例子仅供说明,而不具限制性。以下结合具体实施例对本发明作进一步的说明,但不用来限制本发明的范围。
透明质酸寡糖或透明质酸寡聚糖(oligosaccharides of HA,简称oligo-HA)为分子量在104Da以下,单糖残基数量为2~25(一般为4~16)的透明质酸分子片段。oligo-HA属于小分子多糖,其性质与普通透明质酸有很大不同。研究表明,Oligo-HA具有抗氧化、免疫调节、抗炎症和促进伤口愈合、促血管生成和抗肿瘤等生物活性。尤为重要的是,因其分子尺寸较小,可渗入到皮肤角质层发挥深层保湿和滋润的功效,可广泛应用到化妆品中。
本发明中的透明质酸寡糖可涵盖还原末端为糖醛酸结构或N-乙酰葡糖胺结构的寡糖,即其中的透明质酸寡糖可以均为糖醛酸结构、均为N-乙酰葡糖胺结构,或者是糖醛酸结构和N-乙酰葡糖胺结构的混合物。
在一个具体的实施方式中,在所述透明质酸寡糖组合物中,透明质酸寡糖的还原末端均为糖醛酸。
在一个具体的实施方式中,在所述透明质酸寡糖组合物中,透明质酸寡糖的还原末端均为N-乙酰葡糖胺。
其中,透明质酸四糖是最小级别的透明质酸,是普通透明质酸的1750分之一,具有促进皮肤中神经酰胺的合成,促进角质细胞分化,促血管生成,推动神经再生等功能。透明质酸六糖具有促血管生长、逆转肿瘤细胞耐药性等功效。
本发明提供一种透明质酸寡糖组合物,在所述透明质酸寡糖组合物中,透明质酸四糖所占的质量比大于等于70%,例如可以为70%、70.5%、71%、71.5%、72%、72.5%、73%、73.5%、74%等。
进一步地,所述透明质酸寡糖组合物还包括透明质酸二糖、透明质酸六糖、透明质酸八糖和透明质酸十糖中的一种或两种以上。
在一个具体的实施方式中,所述透明质酸寡糖组合物包括透明质酸四糖、透明质酸二糖、透明质酸六糖、透明质酸八糖和透明质酸十糖。
在一个具体的实施方式中,在所述透明质酸寡糖组合物中,透明质酸二糖所占的质量比为17-19%,例如可以为17%、17.5%、18%、18.5%、19%,透明质酸六糖所占的质量比为1-3%,例如可以为1%、1.5%、2%、2.5%、3%,透明质酸八糖所占的质量比为0-1%,例如可以为0、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%,透明质酸十糖所占的质量比为0-1%,例如可以为0、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%。
在一个具体的实施方式中,在所述透明质酸寡糖组合物中,透明质酸二糖所占的质量比为17-19%,透明质酸四糖所占的质量比为70-75%,透明质酸六糖所占的质量比为1-3%,透明质酸八糖所占的质量比为0-1%,透明质酸十糖所占的质量比为0-1%。
在一个具体的实施方式中,在所述透明质酸寡糖组合物中,透明质酸二糖所占的质量比为18-19%,透明质酸四糖所占的质量比为70-75%,透明质酸六糖所占的质量比为1-3%,透明质酸八糖所占的质量比为0-1%,透明质酸十糖所占的质量比为0-1%。
本发明的透明质酸寡糖组合物可以促进神经酰胺合成或内源性透明质酸合成。其中,神经酰胺(Ceramide)是以神经酰胺为骨架的一类磷脂,主要有神经酰胺磷酸胆碱和神经酰胺磷酸乙醇胺,磷脂是细胞膜的主要成分,角质层中40%~50%的皮脂由神经酰胺构成,神经酰胺是细胞间基质的主要部分,在保持角质层水分的平衡中起着重要作用。神经酰胺具有很强缔合水分子能力,它通过在角质层中形成网状结构维持皮肤水分。因此,神经酰胺具有保持皮肤水分作用。
本发明还提供一种透明质酸寡糖组合物的制备方法,所述制备方法包括以下步骤:将透明质酸用透明质酸酶进行酶解反应;分离酶解反应物以得到产物原液;对所述产物原液进行浓缩以得到产物浓缩液;将所述产物浓缩液干燥得到透明质酸寡糖组合物。
制备方法中所使用的透明质酸酶为可以为酶切β-1,3糖苷键或β-1,4糖苷键的透明质酸酶。其中使用酶切β-1,3糖苷键的透明质酸酶,如本发明中的水蛭源透明质酸酶,对透明质酸进行酶解反应时,得到的透明质酸寡糖的还原端为糖醛酸结构。使用酶切β-1,4糖苷键的透明质酸酶,如本发明中的动物源透明质酸酶,对透明质酸进行酶解反应时,得到的透明质酸寡糖的还原端为N-乙酰葡糖胺结构。
在一个具体的实施方式中,所述透明质酸酶为利用毕赤酵母工程菌表达的水蛭透明质酸水解酶。其制备方法可以参照CN103695448A所描述的方法。
在一个具体的实施方式中,所述透明质酸酶为动物源透明质酸酶。
在一个具体的实施方式中,在酶解反应中,所述透明质酸的初始浓度为10-30g/L,例如可以为10g/L、12g/L、14g/L、16g/L、18g/L、20g/L、22g/L、24g/L、26g/L、28g/L、30g/L。例如,反应体系为1L,则透明质酸的初始含量为10-30g,即没有发生水解时的含量为10-30g。
在一个具体的实施方式中,所述透明质酸的初始分子量为1300-2000kDa,例如可以为1300kDa、1400kDa、1500kDa、1600kDa、1700kDa、1800kDa、1900kDa、2000kDa。
在一个具体的实施方式中,在酶解反应中,所述透明质酸酶的含量为1×105-5×105U/mL,例如可以为1×105U/mL、1.1×105U/mL、1.2×105U/mL、1.3×105U/mL、1.4×105U/mL、1.5×105U/mL、1.6×105U/mL、1.7×105U/mL、1.8×105U/mL、1.9×105U/mL、2×105U/mL、2.1×105U/mL、2.2×105U/mL、2.3×105U/mL、2.4×105U/mL、2.5×105U/mL、2.6×105U/mL、2.7×105U/mL、2.8×105U/mL、2.9×105U/mL、3×105U/mL、3.1×105U/mL、3.2×105U/mL、3.3×105U/mL、3.4×105U/mL、3.5×105U/mL、3.6×105U/mL、3.7×105U/mL、3.8×105U/mL、3.9×105U/mL、4×105U/mL、4.1×105U/mL、4.2×105U/mL、4.3×105U/mL、4.4×105U/mL、4.5×105U/mL、4.6×105U/mL、4.7×105U/mL、4.8×105U/mL、4.9×105U/mL、5×105U/mL。在反应过程中,可以在反应开始时一次投放透明质酸酶,也可以在反应过程中补加透明质酸酶。
其中,透明质酸酶活力单位定义(U)为:在pH 5.5和38℃条件下,每小时从透明质酸糖链中释放出1μg葡萄糖还原当量的还原糖所需的酶量。
所述酶解反应的时间为46-50h,例如可以为46h、47h、48h、49h、50h。酶解温度为44-46℃。
上述步骤中,对所述产物原液进行浓缩以得到产物浓缩液包括:
使所述产物原液通过截留分子量为900-1100Da的超滤膜,收集透过液;
将所述透过液通过截留分子量为500-700Da的超滤膜,收集截留液得到产物浓缩液。
即通过先后使用截留分子量为900-1100Da和500-700Da的超滤膜,使得得到的产物浓缩液中透明质酸寡糖的分子量大于500-700Da且小于900-1100Da。
其中超滤是一种膜分离技术,(UItrafil-tration,简称UF)。能够将溶液净化,分离或者浓缩。超滤是介于微滤与纳滤之间,且三者之间无明显的分界线。一般来说,超滤膜的孔径在0.05μm–1nm之间,操作压力为0.1–0.5Mpa。主要用于截留去除水中的悬浮物、胶体、微粒、细菌和病毒等大分子物质。超滤膜根据膜材料,可分为有机膜和无机膜。按膜的外型,又可分为:平板式、管式、毛细管式、中空纤维和多孔式。目前家用超滤净水器,多以中空膜为主。
本发明所述的截留分子是使用分子量大小表示的超滤膜的截留性能,又称作切割分子量。由于直接测定超滤膜或纳滤膜的孔径相当困难,所以使用已知分子量的球状物质进行测定。如膜对被截留物质的截留率大于90%时,就用被截留物质的分子量表示膜的截留性能,称为膜的截留分子量。例如截留分子量为1000Da的膜可以截留分子量大于1000Da的物质,而允许分子量小于1000Da的物质通过。
在将所述产物浓缩液干燥之前,还可以将浓缩液经过0.22μm的滤芯过滤以除菌。
所述方法中的干燥可以采用现有技术中的各种方式的干燥。在一个具体的实施方式中,所采用的干燥为喷雾干燥。
进一步地,所述方法得到的透明质酸寡糖组合物中,透明质酸四糖所占的质量比大于等于70%。
透明质酸寡糖产物中各种寡糖的鉴定可以采用质谱进行检测,各种寡糖的含量可以采用高效液相色谱进行检测。
本发明还提供上述透明质酸寡糖组合物在促进神经酰胺合成中的用途。
实施例
实施例1透明质酸寡糖组合物制备
在3L玻璃烧杯中,加入纯化水2L,控制搅拌50rpm,控制温度45℃,加入水蛭源透明质酸酶(该酶为利用毕赤酵母工程菌表达的水蛭透明质酸酶,制备方法参照CN 103695448A中描述的方法)。初始体系酶活控制在1.6×105U/mL,将分子量为1.3×103KDa-1.5×103KDa的大分子透明质酸钠,按照10g/L的浓度添加到烧杯内,调节转速至200rpm,搅拌反应48h。其中在第8h和20h时补加水蛭源透明质酸酶,每次补加到体系的酶量为1.6×105U/mL。酶解结束后,将酶解液调pH到9-10,45℃静置维持60min,加入1.5%活性炭,45℃200rpm维持60min,过滤后收集滤液。将滤液用截留分子量为1000Da的超滤膜充分浓缩,收集透过液,然后将透过液用截留分子量为600Da的超滤膜充分浓缩,收集浓缩液。
将浓缩液经过0.22μm滤芯过滤后进行喷雾干燥,得到透明质酸寡糖组合物。
将得到的透明质酸寡糖组合物以0.5%的进样浓度进行高效液相色谱检测,结果如图1所示。在透明质酸寡糖组合物中,透明质酸四糖(HA4)所占的质量比为70.88%,透明质酸二糖(HA2)所占的质量比为18.38%,透明质酸六糖(HA6)所占的质量比为1.29%,透明质酸八糖(HA8)所占的质量比为0.47%,透明质酸十糖(HA10)所占的质量比为0.16%。
其中,具体的高效液相色谱条件为:
色谱柱:SuperdexTM 75Increase 10/300GL
柱温:25℃
检测器:紫外-可见分光检测器
流动相:0.005mol/L硫酸铵溶液
进样浓度:0.5%
进样量:20μL
流速:0.3ml/min
检测波长:200nm
实施例2透明质酸寡糖组合物制备
在3L玻璃烧杯中,加入纯化水2L,控制搅拌50rpm,控制温度45℃,加入水蛭源透明质酸酶(该酶为利用毕赤酵母工程菌表达的水蛭透明质酸酶,制备方法参照CN 103695448A中描述的方法)。体系初始酶活控制在1.6×105U/mL,将分子量为1.3×103KDa-1.5×103KDa的大分子透明质酸钠,按照30g/L的浓度添加到烧杯内,调节转速至200rpm,搅拌反应48h,第8h和20h时补加水蛭源透明质酸酶,每次补加到体系的酶量为8×104U/mL。酶解结束后,将酶解液调pH到9-10,45℃静置维持60min,加入2%活性炭,45℃200rpm维持60min,过滤后收集滤液。将滤液用1000Da的超滤膜充分浓缩,收集透过液,将透过液用600Da的超滤膜充分浓缩,收集浓缩液,将浓缩液经过0.22μm滤芯过滤后进行喷雾干燥,得到透明质酸寡糖组合物。
将得到的透明质酸寡糖组合物以0.5%的进样浓度进行高效液相色谱检测,具体的色谱条件同实施例1,结果如图2所示。在透明质酸寡糖组合物中,透明质酸四糖(HA4)所占的质量比为70.53%,透明质酸二糖(HA2)所占的质量比为21%,透明质酸六糖(HA6)所占的质量比为2.08%,透明质酸八糖(HA8)所占的质量比为0.54%。
实施例3透明质酸寡糖组合物制备
在3L玻璃烧杯中,加入纯化水2L,控制搅拌50rpm,控制温度45℃,加入动物源透明质酸酶(购自上海林叶生物科技有限公司),体系初始酶活控制在8×104U/mL,将分子量在1.3×103KDa-1.5×103KDa的大分子透明质酸钠,按照20g/L的浓度添加到烧杯内,调节转速至200rpm,搅拌反应48h。第20h和30h时补加动物源透明质酸酶,每次补加到体系的酶量为8×104U/mL。酶解结束后,将酶解液调pH到9-10,45℃静置维持120min,加入2%活性炭,45℃200rpm维持60min,过滤后收集滤液。将滤液用截留分子量为1000Da的超滤膜充分浓缩,收集透过液,将透过液用截留分子量为600Da的超滤膜充分浓缩,收集浓缩液,将浓缩液经过0.22μm滤芯过滤后进行喷雾干燥,得到透明质酸寡糖组合物。
将得到的透明质酸寡糖组合物以0.5%的进样浓度进行高效液相色谱检测,具体的色谱条件同实施例1,结果如图3所示。在透明质酸寡糖组合物中,透明质酸四糖(HA4)所占的质量比为70.19%,透明质酸二糖(HA2)所占的质量比为21.93%,透明质酸六糖(HA6)所占的质量比为1.65%,透明质酸八糖(HA8)所占的质量比为0.54%。
对比例1
对比例1与实施例1的区别在于将透明质酸的浓度由30g/L改为8g/L,酶解时间由48h改为24h,透明质酸酶的初始酶活为1.6×105U/ml,酶解过程中不再补加酶。
将得到的透明质酸寡糖组合物以0.5%的进样浓度进行高效液相色谱检测,具体的色谱条件同实施例1,结果如图4所示。在透明质酸寡糖组合物中,透明质酸四糖(HA4)所占的质量比为51.75%,透明质酸二糖(HA2)所占的质量比为8.40%,透明质酸六糖(HA6)所占的质量比为28.70%,透明质酸八糖(HA8)所占的质量比为4.48%,透明质酸十糖(HA10)所占的质量比为1.47%。
对比例2
对比例2与实施例1的区别在于将透明质酸的浓度由30g/L改为35g/L,酶解时间由48h改为36h,体系初始酶活控制在2×105U/mL,在10h时和20h补加透明质酸酶,每次补加到体系的酶量为1.8×105U/mL。
将得到的透明质酸寡糖组合物以0.5%的进样浓度进行高效液相色谱检测,具体的色谱条件同实施例1,结果如图5所示。在透明质酸寡糖组合物中,透明质酸四糖(HA4)所占的质量比为66.87%,透明质酸二糖(HA2)所占的质量比为18.84%,透明质酸六糖(HA6)所占的质量比为5.41%,透明质酸八糖(HA8)所占的质量比为1.04%,透明质酸十糖(HA10)所占的质量比为0.07%。
对比例3
对比例3与实施例1的区别在于将透明质酸的浓度由30g/L改为40g/L,酶解时间由48h改为40h,体系初始酶活控制在3×105U/mL,在20h时补加透明质酸酶,补加体系的酶量为3×105U/mL。
将得到的透明质酸寡糖组合物以0.5%的进样浓度进行高效液相色谱检测,具体的色谱条件同实施例1,结果如图6所示。在透明质酸寡糖组合物中,透明质酸四糖(HA4)所占的质量比为59.46%,透明质酸二糖(HA2)所占的质量比为24.25%,透明质酸六糖(HA6)所占的质量比为1.69%,透明质酸八糖(HA8)所占的质量比为0.44%。
具体地,上述各实施例和对比例的反应条件如表1所示。
表1
试验例
试验例1
基于乳猪皮-Franz扩散池体系,利用TK-12D型透皮扩散试验仪,主要结构包括恒温水浴箱、控制箱、操作台、透皮扩散池、补液管和连接管,具体操作步骤是将皮肤固定于Franz扩散池的扩散室和接收室之间,皮肤角质层面向扩散室,真皮层一侧朝向接受室,实施例1的样品配成浓度0.01g/mL的水溶液,将样品涂布在皮肤表面。通过高效液相色谱测定不同时间点接收液中样品各组分的渗透量,对照组为上述对比例1的样品,评价样品在乳猪背部皮肤的渗透行为。结果如表2所示,经过SPSS统计学分析软件,根据邓肯(Duncan)的测试方法,实施例1相比对照组具有显著性差异(p<0.05),使用实施例1样品后的表皮模型累积渗透量较高,说明了HA4占比70%以上的样品促透皮吸收效果更好。
表2
试验例2
基于乳猪皮-Franz扩散池体系,将实施例3获得的样品通过HPLC测定不同时间点接收液中样品各组分的渗透量。具体实验操作同试验例1。对照组为市售HA4(购自SIGMA公司,纯度98.4%,末端为N-乙酰葡糖胺)样品,评价样品在乳猪背部皮肤的渗透行为。其中,市售HA4中HA4的纯度为98.4%。结果如表3所示,经过SPSS统计学分析软件,根据邓肯(Duncan)的测试方法,实施例3相比对照组具有显著性差异(p<0.05),使用实施例3样品后的表皮模型,累积渗透量较高,说明了HA4占比70%以上的样品促透皮吸收效果更好。
表3
试验例3
基于3D表皮皮肤模型(购自广东博溪生物科技有限公司),往培养液里面添加实施例1的样品(分别为0.5mg/ml、1mg/ml和10mg/ml)连续作用6天后,提取皮肤模型中的神经酰胺,对照组为对比例1样品。结果如表4所示,经过SPSS统计学分析软件,使用T检验方法分析得出,实施例1相比对照组具有显著性差异(p<0.01),与对照组相比,使用实施例1后的表皮模型中神经酰胺的总含量提升,说明了HA4占比70%以上的样品能够提升表皮模型中的神经酰胺含量。
表4
试验例4
利用3D表皮皮肤模型,测试待测样品连续作用6天后,提取皮肤模型中的神经酰胺,具体实验操作同试验例3,对照组为市售HA4(购自SIGMA公司,纯度98.4%,末端为N-乙酰葡糖胺)样品。结果如表5所示,经过SPSS统计学分析软件,使用T检验方法分析得出,实施例3相比对照组具有显著性差异(p<0.01),与对照组相比,使用实施例3后的表皮模型中神经酰胺的总含量提升,说明了HA4占比70%以上的样品能够提升表皮模型中的神经酰胺含量。
表5
试验例5
对实施例1、实施例2和实施例3得到的透明质酸寡糖组合物进行还原端鉴定。
利用Morgan–Elson反应,根据比色法确定透明质酸寡糖组合物的还原端。如果变红证明还原端为N-乙酰葡糖胺,如果不变红证明还原端为糖醛酸。
反应缓冲液:碱性硼酸溶液(在10ml水中溶解1.73g H3BO3和0.78g KOH,在使用前加入其体积十分之一的0.8g/ml K2CO3。)对二甲基氨基苯甲醛溶液(将2克对二甲基氨基苯甲醛溶液溶于2.5ml浓盐酸和7.5ml冰醋酸中,使用前用4倍体积冰醋酸稀释)。
取400μl 10g/L的透明质酸寡糖组合物溶液,加入110μl碱性硼酸溶液,煮沸4min,加入了1.5ml的对二甲基氨基苯甲醛,在37℃下孵育20min。
透明质酸四糖(购自Sigma,还原端为N-乙酰葡糖胺)溶液作为对照。
结果如图7所示,其中图7由左至右为:市售HA4(末端是N-乙酰葡糖胺);实施例1寡糖混合物(末端是D-葡萄糖醛酸);实施例2寡糖混合物(末端是D-葡萄糖醛酸);实施例3寡糖混合物(末端是N-乙酰葡糖胺)。
实施例1和实施例2的透明质酸寡糖组合物经Moran-Elson反应没有显红色,证明还原端为糖醛酸。
Claims (10)
1.一种透明质酸寡糖组合物,其特征在于,在所述透明质酸寡糖组合物中,透明质酸四糖所占的质量比大于等于70%,优选大于等于70.5%。
2.根据权利要求1所述的透明质酸寡糖组合物,其特征在于,在所述透明质酸寡糖组合物中,透明质酸寡糖的还原末端均为糖醛酸或均为N-乙酰葡糖胺。
3.根据权利要求1所述的透明质酸寡糖组合物,其特征在于,所述透明质酸寡糖组合物还包括透明质酸二糖、透明质酸六糖、透明质酸八糖和透明质酸十糖中的一种或两种以上。
4.根据权利要求3所述的透明质酸寡糖组合物,其特征在于,在所述透明质酸寡糖组合物中,透明质酸二糖所占的质量比为17-19%,透明质酸六糖所占的质量比为1-3%,透明质酸八糖所占的质量比为0-1%,透明质酸十糖所占的质量比为0-1%。
5.一种如权利要求1-4中任一项所述的透明质酸寡糖组合物的制备方法,其特征在于,所述制备方法包括以下步骤:
将透明质酸用透明质酸酶进行酶解反应;
分离酶解反应物以得到产物原液;
对所述产物原液进行浓缩以得到产物浓缩液;
将所述产物浓缩液干燥得到透明质酸寡糖组合物。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,在所述酶解反应中,所述透明质酸的初始浓度为10-30g/L,优选地,所述透明质酸的分子量为1300-2000kDa。
7.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述透明质酸酶的含量为1×105-5×105U/mL。
8.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述酶解反应的时间为46-50h,酶解温度为44-46℃。
9.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,对所述产物原液进行浓缩以得到产物浓缩液包括:
使所述产物原液通过截留分子量为900-1100Da的超滤膜,收集透过液;
将所述透过液通过截留分子量为500-700Da的超滤膜,收集截留液得到产物浓缩液。
10.权利要求1-4中任一项所述的透明质酸寡糖组合物在促进神经酰胺合成中的用途。
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