CN104059166A - 一种从透明质酸发酵液制备寡聚透明质酸的方法 - Google Patents
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Abstract
一种从透明质酸发酵液制备寡聚透明质酸的方法,涉及从透明质酸发酵液中制备低分子量、低蛋白质含量的透明质酸钠。本发明采用透明质酸发酵液为原料,经过乙醇沉淀、脱水、沉淀物复溶、复溶液加热、活性炭吸附、碱性条件下水解得到寡聚透明质酸钠。本发明制备的寡聚透明质酸钠分子量在10000道尔顿以下,分布集中,蛋白质含量为0,提取收益率在95%以上。本发明操作简单,成本较低,尤其适合大规模工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种从透明质酸发酵液制备寡聚透明质酸的方法,尤其是从透明质酸发酵液中制备低分子量、分子量分布集中且低蛋白质含量的寡聚透明质酸。
背景技术
透明质酸(hyaluronic acid,HA)是一种在人体内广泛存在的生物大分子,其重复的二糖基本结构单元是由β-1,4-糖苷键和β-1,3-糖苷键连接的N-乙酰氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸。透明质酸在人体内一般以较低分子量存在,主要集中在10kDa至50kDa范围,主要在生理环境中起到组织润滑,免疫调节等作用,在医学上已广泛应用于防止术后粘连,填充剂和外用药物等。目前发现,透明质酸在体内的生物活性受到其相对分子量的影响。低分子量透明质酸和寡糖透明质酸有高分子没有的生物活性,如促进血管生成,促进伤口愈合等作用,特别的在某些肿瘤部位,透明质酸会大量富集,一方面在抑制肿瘤细胞的耐药性并参与免疫调节,另一方面由于其润滑作用可以使肿瘤快速扩散。由于低分子量透明质酸在人体有诸多作用,而且保持了优异的生物相容性和生物降解性,关于低分子量透明质酸的药物载体在研究受到了极大地关注。
现有降解高分子透明质酸的方法主要有化学法,物理法和酶解法。酶解法价格昂贵,工艺复杂,且无法回收透明质酸酶,需要除去蛋白和内毒素,因此不适合大规模的工业生产。物理法其降解力度有限,难以得到分子量在10000道尔顿以下的寡聚透明质酸。化学法主要包括水解法和氧化法,氧化法常采用的氧化剂为次氯酸钠和过氧化氢,但往往会产生氧化剂残留。水解法分为酸解法和碱解法,酸解法一般采用浓盐酸水解,平均分子量降至10000以下时,分子量分布较宽。所有上述方法都是采用成品透明质酸或盐做为原料通过讲解得到寡聚透明质酸或盐,虽然国内外研究比较深入,但存在的缺点有:1)利用成品透明质酸或盐作为原料成本较高;2)降解得到的寡聚透明质酸还需进一步分离纯化,难以提高,相比从发酵液中直接制备寡聚透明质酸增加了提取成本,并且难以提高提取率。
本发明通过将从发酵液中提取透明质酸的工艺和碱水解结合的方法,将发酵 液中的透明质酸降解为分子量在10000道尔顿以下且分布集中的寡聚透明质酸。
发明内容
针对现有技术的不足,本发明的目的是提供了一种利用透明质酸发酵液制备寡聚透明质酸的方法,该工艺操作简便、高效、费用低廉、成品得率高、分子量分布集中、易于工业化。
本发明的一种从透明质酸发酵液制备寡聚透明质酸的方法,包括:
(1)乙醇沉淀:向透明质酸发酵液中加入浓度为95%的乙醇,充分搅拌,得到透明质酸钠丝状沉淀物;
(2)脱水:取出透明质酸钠丝状沉淀物,用浓度为95%的乙醇洗涤沉淀3次后脱水;
(3)复溶:将已经脱水的透明质酸用与初始发酵液等体积的蒸馏水搅拌溶解;
(4)过滤:将复溶液加热至80~90℃,过滤得到滤液;
(5)去除杂质:在滤液中加入1%~5%的活性炭,在40~50℃下搅拌1~3h,加入1%~5%的硅藻土,搅匀过滤得到清液;
(6)水解:将清液在pH值为10~14,温度为80~100℃下水解2~6h,得到寡聚透明质酸;
(7)除菌过滤:在1.5MPa以下,将上述得到的寡聚透明质酸经过0.22μm的微孔过滤器过滤得到成品寡聚透明质酸。
步骤(6)所述清液中透明质酸钠浓度为0.1%~0.4%,进一步优选为0.15%~3%。
步骤(6)所述清液优选通过添加pH值调节剂以调节pH值,优选所述pH值调节剂为氢氧化钠。
步骤(6)所述水解过程中优选溶液pH值为10.5~13,进一步优选为11~13。
步骤(6)所述水解过程中温度优选为85~98℃,进一步优选为90~95℃。所述水解时间优选为3~5h,进一步优选为3~4h。
本发明的有益效果:(1)本发明将透明质酸的纯化工艺和寡聚透明质酸的制 备方法结合在一起,从透明质酸发酵液中制备寡聚透明质酸的操作工序,大大简化了生产工艺流程,降低了生产成本,适合大规模工业化生产;(2)水解过程中通过碱解,进行广泛的蛋白质水解,能很好的去处蛋白质;(2)本发明制备的寡聚透明质酸分子量分布集中,收益率在95%以上。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解,在阅读了本发明讲授的内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
在10L的发酵罐中发酵得到5L透明质酸发酵液,其中透明质酸含量为5.2g/L,加入15L95%的乙醇并不断搅拌,静置10min后取出丝状透明质酸沉淀物,再用95%的乙醇洗涤沉淀物3次后脱水;将沉淀物放入5L的纯化水中搅拌直至完全溶解,将复溶液加热至85℃,装配好抽滤瓶,在布氏漏斗中放入滤板,先用纯化水润湿滤板,然后均匀倒入料液,同时开启真空泵,对溶液进行抽滤;抽滤结束后,缓慢在溶液中加入60g针用活性炭,在45℃下进行活性炭吸附2h,吸附结束后在溶液中加入60g硅藻土,在搅拌速度50rpm下混合搅拌15min,按照上述步骤对溶液进行抽滤得到清液;用10%的NaOH调溶液的pH至11.4,缓慢升温至95℃水解3.5h即可得到寡聚透明质酸;最后将上述得到的寡聚透明质酸经过0.22μm的微孔过滤器过滤得到成品寡聚透明质酸。
实施例2
在实施例中,用10%的NaOH调溶液的pH至12,缓慢升温至90℃水解3.5h,其他操作同实施例1。
实施例3
在实施例中,用10%的NaOH调溶液的pH至12.5,缓慢升温至95℃水解3h,其他操作同实施例1。
实施例4
在实施例中,用10%的NaOH调溶液的pH至12.5,缓慢升温至90℃水解 3h,其他操作同实施例1。
对比实施例5
在实施例中,采用HCl调溶液pH至1.8,缓慢升温至95℃水解3h,其他操作同实施例1。
下表是利用本发明工艺得到的产品与对比实施例得到的产品检验结果
。
Claims (6)
1.一种从透明质酸发酵液制备寡聚透明质酸的方法,其特征在于将透明质酸发酵液经过乙醇沉淀,过滤处理去除杂质得到清液,在pH值为11~14,温度为80~100℃下水解2~5h,得到寡聚透明质酸。
2.根据权利要求1所述的制备寡聚透明质酸的方法,其特征在于其具体步骤为:
(1)乙醇沉淀:向透明质酸发酵液中加入浓度为95%的乙醇,充分搅拌,得到透明质酸钠丝状沉淀物;
(2)脱水:取出透明质酸钠丝状沉淀物,用浓度为95%的乙醇洗涤沉淀3次后脱水;
(3)复溶:将已经脱水的透明质酸用与初始发酵液等体积的蒸馏水搅拌溶解;
(4)过滤:将复溶液加热至80~90℃,过滤得到滤液;
(5)去除杂质:在滤液中加入1%~5%的活性炭,在40~50℃下搅拌1~3h,加入1%~5%的硅藻土,搅匀过滤得到清液;
(6)水解:将清液在pH值为10~14,温度为80~100℃下水解2~6h,得到寡聚透明质酸;
(7)除菌过滤:在1.5MPa以下,将上述得到的寡聚透明质酸经过0.22μm的微孔过滤器过滤得到成品寡聚透明质酸。
3.根据权利要求2所述的制备寡聚透明质酸的方法,其特征在于:步骤(6)所述清液中透明质酸钠浓度为0.1%~0.4%,进一步优选为0.15%~3%。
4.根据权利要求2所述的制备寡聚透明质酸的方法,其特征在于:步骤(6)所述清液优选通过添加pH值调节剂以调节pH值,优选所述pH值调节剂为氢氧化钠。
5.根据权利要求2所述的制备寡聚透明质酸的方法,其特征在于:步骤(6)所述水解过程中优选溶液pH值为10.5~13,进一步优选为11~12。
6.根据权利要求2所述的制备寡聚透明质酸的方法,其特征在于:步骤(6)所述水解过程中温度优选为85~98℃,进一步优选为90~95℃。所述水解时间优选为3~5h,进一步优选为4~4.5h。
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