CN112251483A - 一种小分子透明质酸钠的生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种小分子透明质酸钠的生产方法，以发酵法生产透明质酸所得的发酵液为原料，直接进行降解处理，通过对工艺参数的调整，可以利用同样的工艺流程，在同一套设备上实现不同分子量透明质酸钠的生产。本发明利用透明质酸钠的前期降解使溶解工序透明质酸钠的浓度可放大至10～50g/L，很大程度的缩短了后面各工序的耗时，降低了乙醇与无机盐的用量，同时，溶解体积的减少使产品的收率高于普通分子量透明质酸钠和现行小分子量透明质酸钠生产工艺。
Description
技术领域
本发明属于透明质酸钠生产技术领域，涉及一种小分子透明质酸钠的生产方法。
背景技术
透明质酸钠是人体内一种固有的成分，是一种葡聚糖醛酸，没有种属特异性，它广泛存在于胎盘、羊水、晶状体、关节软骨、皮肤真皮层等组织；器官中它分布在细胞质、细胞间质中，对其中所含的细胞和细胞器官本身起润滑与滋养作用。
透明质酸钠本身是人体皮肤的构成之一，是人体内分布最广的一种酸性黏糖，存在于结缔组织的基质中，具有良好的保湿作用，透明质酸钠在水溶液中具有很高的粘度，其1％的水溶液呈凝胶状，添加在化妆品中可起增稠和稳定作用，透明质酸钠溶液具有高黏弹性及仿形性，为眼科手术的辅助剂，药液注入前房后维持一定的眼前房深度，便于手术操作，并有保护角膜内皮细胞及眼内组织，减少手术并发症，促进伤口愈合的作用。
透明质酸钠分子量的大小与其生理功能密切相关，与大分子透明质酸钠相比，小分子透明质酸钠会表现出不同的生物学功能，比如刺激血管增生，诱导发炎调节因子的表达，抑制肿瘤的增殖和抗菌作用等。另外，小分子透明质酸钠在保健食品和美容方面具有更好的应用价值和医疗价值。
小分子透明质酸钠包括分子量小于一万道尔顿的透明质酸钠寡糖和分子量一到八十万道尔顿之间的透明质酸钠。分子量越高的透明质酸钠溶于水后，溶液的粘度越高。
现有技术方案是将含透明质酸钠发酵液通过提取工艺生产为常规分子量(100～200万道尔顿)透明质酸钠成品，然后通过化学降解、酶解、辐照等手段使大分子透明质酸钠降解至小分子。但是现有工艺普遍存在生产效率低等问题。
另外，由于透明质酸钠生产过程中需要用水溶解至适当粘度来实现过滤、沉淀等除杂工艺，而越大分子量的透明质酸钠溶解后粘度越高，所以需要通过较低的透明质酸钠溶解浓度来使溶解液的粘度降低以满足过滤、沉淀等工艺设备要求，而较低的溶解浓度使溶解体积增加，使下一步的醇沉工序中消耗的乙醇量增加。目前生产工艺中透明质酸钠的溶解浓度约为2.5g/L至3.5g/L。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种小分子透明质酸钠的生产方法，大大提高了生产效率，避免溶剂等的浪费。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种小分子透明质酸钠的生产方法，具体步骤如下：
(1)先采用发酵法生产透明质酸，发酵结束后，搅拌加热，使得含有透明质酸的发酵液的动力粘度降低；
(2)然后将步骤(1)处理后的发酵液分别使用乙醇溶液Ⅰ和乙醇溶液Ⅱ处理，获得沉淀Ⅱ；
(3)接着将沉淀Ⅱ与乙醇溶液Ⅲ混合，并进行降解处理，得到沉淀Ⅲ；
(4)最后将沉淀Ⅲ用水溶解，使其浓度为10～50g/L，后处理成盐，即得所述的一种小分子透明质酸钠
；
其中，在发酵法生产透明质酸开始3～4小时后，加入分别为发酵罐中培养基重量
0.8～1％和0.3～0.5％的西黄蓍胶和聚乙烯醇，搅拌均匀，控制pH＝4.8～5.2，保持该pH直
至发酵结束前2～3小时，调整pH＝6.5～7。
优选的，所述小分子透明质酸钠包含：分子量小于10kDa的透明质酸钠寡糖；分子量10～800kDa之间的透明质酸钠。
优选的，步骤(1)的具体方法是：先采用发酵法生产透明质酸，发酵结束后，在搅拌状态下，将含有透明质酸的发酵液加热至40～80℃，调节pH＝10.5～11.0，保持搅拌8～10小时，停止加热，使得含有透明质酸的发酵液的动力粘度降低。
优选的，步骤(1)中，发酵法生产透明质酸的具体方法如下：
(A)先取斜面菌种接种于种子培养基，37℃培养12～16小时；
(B)然后接种于发酵罐的液体培养基中，接种体积比为1：10，通气量0.3～1.0vvm(每分钟相对于单位发酵体积的通气量)，120rpm和37℃条件下发酵40～46小时，即得含有透明质酸的发酵液。
进一步优选的，种子培养基的配方组成为：葡萄糖5g，蛋白胨10.5g，牛肉膏5.5g，酵母膏7.14g，酵母粉2.5g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁0.5g，琼脂1g，水补足至1000g；液体培养基的配方组成为：葡萄糖30～60g，蛋白胨10.5g，牛肉膏5.5g，酵母膏7.14g，酵母粉2.5g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁0.5g，水补足至1000g。
进一步优选的，在发酵过程中，pH值不断下降，在此过程中控制pH＝6.5～7，发酵后期，葡萄糖浓度下降至0.5％以下，pH值下降很慢或不再下降时，即为发酵终点。
进一步优选的，步骤(A)中，所述菌种为马链球菌兽疫亚种，ATCC39920，购自上海沪峥生物科技有限公司。
进一步优选的，步骤(B)中，在120rpm和37℃条件下发酵开始3～4小时后，加入分
别为发酵罐中培养基重量0.8～1％和0.3～0.5％的西黄蓍胶和聚乙烯醇，搅拌均匀，控制
pH＝4.8～5.2，保持该pH直至发酵结束前2～3小时，调整pH＝6.5～7并控制该pH直至发酵
结束。
优选的，步骤(2)的具体方法是：将将步骤(1)处理后的发酵液与乙醇溶液Ⅰ混合形成混合液，使得混合液中乙醇体积浓度为50～70％，静置分层取沉淀Ⅰ；再利用乙醇溶液Ⅱ洗涤沉淀Ⅰ，静置分层取沉淀Ⅱ。
优选的，步骤(3)的具体方法是：接着将沉淀Ⅱ转移至耐酸可加热罐体内，将沉淀Ⅱ与1～5倍体积的乙醇溶液Ⅲ混合，继续加入有机酸或无机酸，加热至40～80℃，持续搅拌，使得透明质酸降解为低分子量；停止加热，调节pH＝5～10，静置分层取沉淀Ⅲ。
进一步优选的，在开始加热搅拌的同时，进行γ射线照射和电子束辐照的交替处理，其中，γ射线照射的剂量为5～8kGy，电子束辐照的剂量为12～15kGy，各处理3次，每次处理时间均为5分钟。起到辅助降解作用，有利于产品收率和纯度的双重提高。
进一步优选的，所述有机酸或无机酸选自醋酸、盐酸或硫酸的任一种。
进一步优选的，所述有机酸或无机酸为盐酸、抗坏血酸、2-氨基乙烷亚磺酸的组合，三者的质量比为1：0.3～0.5：0.1～0.2。该组合可以获得更好的降解效果，产品收率和纯度高，分子量分布范围窄。
进一步优选的，乙醇溶液Ⅱ的体积为沉淀Ⅰ体积的1倍以上，乙醇溶液Ⅰ的体积浓度为80～90％，乙醇溶液Ⅱ、乙醇溶液Ⅲ的体积浓度均大于50％。
进一步优选的，通过对降解温度、降解时间、有机酸或无机酸浓度的工艺条件调整，获得不同分子量范围的透明质酸钠；具体如下：
(a)分子量小于10kDa的透明质酸钠寡糖：降解温度70～80℃，降解时间8～10小时，有机酸或无机酸在体系中的质量浓度为50～60％，范围值中的下限值均为不包含；
(b)分子量10～100kDa之间的透明质酸钠：降解温度60～70℃，降解时间6～8小时，有机酸或无机酸在体系中的质量浓度为40～50％，范围值中的下限值均为不包含；
(c)分子量100～800kDa之间的透明质酸钠：降解温度40～60℃，降解时间2～6小时，有机酸或无机酸在体系中的质量浓度为30～40％。(本发明未特别指出的均为重均分子量)
优选的，步骤(4)中，后处理成盐包括：过滤，沉淀成盐，脱水，离心，干燥，粉碎，成品。
进一步优选的，采用板框过滤得到滤液Ⅰ，以除去菌体，在过滤前调节pH＝4～4.5。
进一步优选的，沉淀成盐的具体方法是：先利用乙醇溶液Ⅳ进行沉淀处理，乙醇溶液Ⅳ的体积浓度为90～95％，其用量为过滤所得滤液Ⅰ体积的3～3.5倍，在沉淀处理前调节pH＝6～6.5；然后利用与发酵液等体积的0.1mol/L氯化钠水溶液溶解所得沉淀，边搅拌边加入质量浓度1％氯化十六烷基吡啶水溶液以与其中的透明质酸发生络合沉淀，静置取沉淀Ⅳ，再将沉淀Ⅳ加入0.4mol/L氯化钠溶液中，搅拌10～12小时，过滤取滤液Ⅱ，最后将滤液Ⅱ利用乙醇溶液Ⅴ进行沉淀处理，乙醇溶液Ⅴ的体积浓度为85～90％，其用量为过滤所得滤液Ⅱ体积的3～3.5倍。
更进一步优选的，氯化十六烷基吡啶水溶液的用量为发酵液体积的1.5～2倍。
本发明的有益效果在于：
本发明以发酵法生产透明质酸所得的发酵液为原料，直接进行降解处理，通过对工艺参数的调整，可以利用同样的工艺流程，在同一套设备上实现不同分子量透明质酸钠的生产。本发明利用透明质酸的前期降解使溶解工序透明质酸钠的浓度可放大至10～50g/L，很大程度的缩短了后面各工序的耗时，降低了乙醇与无机盐的用量，同时，溶解体积的减少使产品的收率高于普通分子量透明质酸钠和现行小分子量透明质酸钠生产工艺。具体如下：
1、生产效率提升：发酵液粘度的降低是透明质酸钠分子量降低的表现，不同的降低程度代表着不同分子量透明质酸钠的形成。发酵液粘度的降低同时有利于提升发酵液的输送效率。本发明通过对发酵液的加热处理使得发酵液的动力粘度降低，大大提高了发酵液的输送效率。由于溶解体积的降低，相较于普通分子量透明质酸钠的生产工艺，使后续工艺中所需处理的溶液体积降低了3倍以上，且可以直接得到小分子透明质酸钠，可降低2倍以上的工艺耗时。而现有工艺需先生产出普通分子量透明质酸钠进行再加工。
2、节约大量原辅物料：溶解体积的降低，使后续的工艺中所需处理的溶液体积降低了3倍以上，后续工艺中所需使用的原辅物料、能源用量降低3倍以上。
3、降低环保压力：高盐废水是污水处理中的难题，本工艺技术降低了工艺中无机盐的使用量，大幅降低了企业耗能和污水环保压力。
4、提升经济效益：由于生产效率的提升和原辅物料、能源的节约，使生产成本大大降低。
5、透明质酸是由葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖以β-1,3和β-1,4糖苷键连接成
的二糖单元重复构建而成的高分子聚合物，本发明在发酵法生产透明质酸开始一段时间后
加入少量西黄蓍胶和聚乙烯醇，在pH＝4.8～5.2的条件下，西黄蓍胶吸水溶胀形成凝胶颗
粒，宏观上成为物理屏障，阻碍前述二糖单元的重复构建，聚乙烯醇含有大量羟基，可与重
复构建二糖单元的原料形成氢键作用，降低糖苷键成键活性，微观上阻碍二糖单元重复构
建，两者共同作用，使得发酵过程中形成的透明质酸分子量就相对较低。结合后续发酵液的
加热处理、γ射线照射和电子束辐照的交替处理等大大降低了所得透明质酸钠的分子量。
在发酵结束前2～3小时，调整pH＝6.5～7并控制该pH直至发酵结束，西黄蓍胶在该pH条件
下粘度显著下降，可促进透明质酸的形成，以免影响透明质酸收率。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为本发明的工艺流程图。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。
实施例1：
如图1所示的一种小分子透明质酸钠的生产方法，具体步骤如下：
(1)先采用发酵法生产透明质酸，发酵结束后，搅拌加热，使得含有透明质酸的发酵液的动力粘度降低；
(2)然后将步骤(1)处理后的发酵液分别使用乙醇溶液Ⅰ和乙醇溶液Ⅱ处理，获得沉淀Ⅱ；
(3)接着将沉淀Ⅱ与乙醇溶液Ⅲ混合，并进行降解处理，得到沉淀Ⅲ；
(4)最后将沉淀Ⅲ用水溶解，使其浓度为10g/L，后处理成盐，即得所述的一种小分子透明质酸钠。
步骤(1)的具体方法是：先采用发酵法生产透明质酸，发酵结束后，在搅拌状态下，将含有透明质酸的发酵液加热至80℃，调节pH＝10.5，保持搅拌10小时，停止加热，使得含有透明质酸的发酵液的动力粘度降低。
步骤(1)中，发酵法生产透明质酸的具体方法如下：
(A)先取斜面菌种接种于种子培养基，37℃培养12小时；
(B)然后接种于发酵罐的液体培养基中，接种体积比为1：10，通气量1.0vvm(每分钟相对于单位发酵体积的通气量)，120rpm和37℃条件下发酵40小时，即得含有透明质酸的发酵液。
种子培养基的配方组成为：葡萄糖5g，蛋白胨10.5g，牛肉膏5.5g，酵母膏7.14g，酵母粉2.5g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁0.5g，琼脂1g，水补足至1000g；液体培养基的配方组成为：葡萄糖60g，蛋白胨10.5g，牛肉膏5.5g，酵母膏7.14g，酵母粉2.5g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁0.5g，水补足至1000g。
在发酵过程中，pH值不断下降，在此过程中控制pH＝6.5，发酵后期，葡萄糖浓度下降至0.5％以下，pH值下降很慢或不再下降时，即为发酵终点。
步骤(A)中，所述菌种为马链球菌兽疫亚种，ATCC39920，购自上海沪峥生物科技有限公司。
步骤(2)的具体方法是：将将步骤(1)处理后的发酵液与乙醇溶液Ⅰ混合形成混合液，使得混合液中乙醇体积浓度为70％，静置分层取沉淀Ⅰ；再利用乙醇溶液Ⅱ洗涤沉淀Ⅰ，静置分层取沉淀Ⅱ。
步骤(3)的具体方法是：接着将沉淀Ⅱ转移至耐酸可加热罐体内，将沉淀Ⅱ与1倍体积的乙醇溶液Ⅲ混合，继续加入有机酸或无机酸，加热至80℃，持续搅拌，使得透明质酸钠降解为低分子量；停止加热，调节pH＝5，静置分层取沉淀Ⅲ。
所述有机酸或无机酸为醋酸。
乙醇溶液Ⅱ的体积为沉淀Ⅰ体积的1倍以上，乙醇溶液Ⅰ的体积浓度为90％，乙醇溶液Ⅱ、乙醇溶液Ⅲ的体积浓度均大于50％。
通过对降解温度、降解时间、有机酸或无机酸浓度的工艺条件调整，获得不同分子量范围的透明质酸钠；具体如下：
(a)分子量小于10kDa的透明质酸钠寡糖：降解温度71℃，降解时间10小时，有机酸或无机酸在体系中的质量浓度为51％；
(b)分子量10～100kDa之间的透明质酸钠：降解温度70℃，降解时间7小时，有机酸或无机酸在体系中的质量浓度为50％；
(c)分子量100～800kDa之间的透明质酸钠：降解温度40℃，降解时间6小时，有机酸或无机酸在体系中的质量浓度为30％。
步骤(4)中，后处理成盐包括：过滤，沉淀成盐，脱水，离心，干燥，粉碎，成品。
采用板框过滤得到滤液Ⅰ，以除去菌体，在过滤前调节pH＝4.5。
沉淀成盐的具体方法是：先利用乙醇溶液Ⅳ进行沉淀处理，乙醇溶液Ⅳ的体积浓度为90％，其用量为过滤所得滤液Ⅰ体积的3.5倍，在沉淀处理前调节pH＝6；然后利用与发酵液等体积的0.1mol/L氯化钠水溶液溶解所得沉淀，边搅拌边加入质量浓度1％氯化十六烷基吡啶水溶液以与其中的透明质酸发生络合沉淀，静置取沉淀Ⅳ，再将沉淀Ⅳ加入0.4mol/L氯化钠溶液中，搅拌12小时，过滤取滤液Ⅱ，最后将滤液Ⅱ利用乙醇溶液Ⅴ进行沉淀处理，乙醇溶液Ⅴ的体积浓度为85％，其用量为过滤所得滤液Ⅱ体积的3倍。
氯化十六烷基吡啶水溶液的用量为发酵液体积的1.5倍。
实施例2：
一种小分子透明质酸钠的生产方法，具体步骤如下：
(1)先采用发酵法生产透明质酸，发酵结束后，搅拌加热，使得含有透明质酸的发酵液的动力粘度降低；
(2)然后将步骤(1)处理后的发酵液分别使用乙醇溶液Ⅰ和乙醇溶液Ⅱ处理，获得沉淀Ⅱ；
(3)接着将沉淀Ⅱ与乙醇溶液Ⅲ混合，并进行降解处理，得到沉淀Ⅲ；
(4)最后将沉淀Ⅲ用水溶解，使其浓度为50g/L，后处理成盐，即得所述的一种小分子透明质酸钠。
步骤(1)的具体方法是：先采用发酵法生产透明质酸，发酵结束后，在搅拌状态下，将含有透明质酸的发酵液加热至40℃，调节pH＝11.0，保持搅拌8小时，停止加热，使得含有透明质酸的发酵液的动力粘度降低。
步骤(1)中，发酵法生产透明质酸的具体方法如下：
(A)先取斜面菌种接种于种子培养基，37℃培养16小时；
(B)然后接种于发酵罐的液体培养基中，接种体积比为1：10，通气量0.3vvm(每分钟相对于单位发酵体积的通气量)，120rpm和37℃条件下发酵46小时，即得含有透明质酸的发酵液。
种子培养基的配方组成为：葡萄糖5g，蛋白胨10.5g，牛肉膏5.5g，酵母膏7.14g，酵母粉2.5g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁0.5g，琼脂1g，水补足至1000g；液体培养基的配方组成为：葡萄糖30g，蛋白胨10.5g，牛肉膏5.5g，酵母膏7.14g，酵母粉2.5g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁0.5g，水补足至1000g。
在发酵过程中，pH值不断下降，在此过程中控制pH＝7，发酵后期，葡萄糖浓度下降至0.5％以下，pH值下降很慢或不再下降时，即为发酵终点。
步骤(A)中，所述菌种为马链球菌兽疫亚种，ATCC39920，购自上海沪峥生物科技有限公司。
步骤(2)的具体方法是：将将步骤(1)处理后的发酵液与乙醇溶液Ⅰ混合形成混合液，使得混合液中乙醇体积浓度为50％，静置分层取沉淀Ⅰ；再利用乙醇溶液Ⅱ洗涤沉淀Ⅰ，静置分层取沉淀Ⅱ。
步骤(3)的具体方法是：接着将沉淀Ⅱ转移至耐酸可加热罐体内，将沉淀Ⅱ与5倍体积的乙醇溶液Ⅲ混合，继续加入有机酸或无机酸，加热至40℃，持续搅拌，使得透明质酸钠降解为低分子量；停止加热，调节pH＝10，静置分层取沉淀Ⅲ。
所述有机酸或无机酸为盐酸。
乙醇溶液Ⅱ的体积为沉淀Ⅰ体积的1倍以上，乙醇溶液Ⅰ的体积浓度为80％，乙醇溶液Ⅱ、乙醇溶液Ⅲ的体积浓度均大于50％。
通过对降解温度、降解时间、有机酸或无机酸浓度的工艺条件调整，获得不同分子量范围的透明质酸钠；具体如下：
(a)分子量小于10kDa的透明质酸钠寡糖：降解温度80℃，降解时间9小时，有机酸或无机酸在体系中的质量浓度为60％；
(b)分子量10～100kDa之间的透明质酸钠：降解温度61℃，降解时间8小时，有机酸或无机酸在体系中的质量浓度为41％；
(c)分子量100～800kDa之间的透明质酸钠：降解温度60℃，降解时间2小时，有机酸或无机酸在体系中的质量浓度为40％。
步骤(4)中，后处理成盐包括：过滤，沉淀成盐，脱水，离心，干燥，粉碎，成品。
采用板框过滤得到滤液Ⅰ，以除去菌体，在过滤前调节pH＝4。
沉淀成盐的具体方法是：先利用乙醇溶液Ⅳ进行沉淀处理，乙醇溶液Ⅳ的体积浓度为95％，其用量为过滤所得滤液Ⅰ体积的3倍，在沉淀处理前调节pH＝6.5；然后利用与发酵液等体积的0.1mol/L氯化钠水溶液溶解所得沉淀，边搅拌边加入质量浓度1％氯化十六烷基吡啶水溶液以与其中的透明质酸发生络合沉淀，静置取沉淀Ⅳ，再将沉淀Ⅳ加入0.4mol/L氯化钠溶液中，搅拌10小时，过滤取滤液Ⅱ，最后将滤液Ⅱ利用乙醇溶液Ⅴ进行沉淀处理，乙醇溶液Ⅴ的体积浓度为90％，其用量为过滤所得滤液Ⅱ体积的3.5倍。
氯化十六烷基吡啶水溶液的用量为发酵液体积的2倍。
实施例3：
一种小分子透明质酸钠的生产方法，具体步骤如下：
(1)先采用发酵法生产透明质酸，发酵结束后，搅拌加热，使得含有透明质酸的发酵液的动力粘度降低；
(2)然后将步骤(1)处理后的发酵液分别使用乙醇溶液Ⅰ和乙醇溶液Ⅱ处理，获得沉淀Ⅱ；
(3)接着将沉淀Ⅱ与乙醇溶液Ⅲ混合，并进行降解处理，得到沉淀Ⅲ；
(4)最后将沉淀Ⅲ用水溶解，使其浓度为10g/L，后处理成盐，即得所述的一种小分子透明质酸钠。
步骤(1)的具体方法是：先采用发酵法生产透明质酸，发酵结束后，在搅拌状态下，将含有透明质酸的发酵液加热至80℃，调节pH＝10.5，保持搅拌10小时，停止加热，使得含有透明质酸的发酵液的动力粘度降低。
步骤(1)中，发酵法生产透明质酸的具体方法如下：
(A)先取斜面菌种接种于种子培养基，37℃培养12小时；
(B)然后接种于发酵罐的液体培养基中，接种体积比为1：10，通气量1.0vvm(每分钟相对于单位发酵体积的通气量)，120rpm和37℃条件下发酵40小时，即得含有透明质酸的发酵液。
种子培养基的配方组成为：葡萄糖5g，蛋白胨10.5g，牛肉膏5.5g，酵母膏7.14g，酵母粉2.5g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁0.5g，琼脂1g，水补足至1000g；液体培养基的配方组成为：葡萄糖60g，蛋白胨10.5g，牛肉膏5.5g，酵母膏7.14g，酵母粉2.5g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁0.5g，水补足至1000g。
在发酵过程中，pH值不断下降，在此过程中控制pH＝6.5，发酵后期，葡萄糖浓度下降至0.5％以下，pH值下降很慢或不再下降时，即为发酵终点。
步骤(A)中，所述菌种为马链球菌兽疫亚种，ATCC39920，购自上海沪峥生物科技有限公司。
步骤(2)的具体方法是：将将步骤(1)处理后的发酵液与乙醇溶液Ⅰ混合形成混合液，使得混合液中乙醇体积浓度为70％，静置分层取沉淀Ⅰ；再利用乙醇溶液Ⅱ洗涤沉淀Ⅰ，静置分层取沉淀Ⅱ。
步骤(3)的具体方法是：接着将沉淀Ⅱ转移至耐酸可加热罐体内，将沉淀Ⅱ与1倍体积的乙醇溶液Ⅲ混合，继续加入有机酸或无机酸，加热至80℃，持续搅拌，使得透明质酸钠降解为低分子量；停止加热，调节pH＝5，静置分层取沉淀Ⅲ。
在开始加热搅拌的同时，进行γ射线照射和电子束辐照的交替处理，其中，γ射线照射的剂量为5kGy，电子束辐照的剂量为15kGy，各处理3次，每次处理时间均为5分钟。
所述有机酸或无机酸为硫酸。乙醇溶液Ⅱ的体积为沉淀Ⅰ体积的1倍以上，乙醇溶液Ⅰ的体积浓度为90％，乙醇溶液Ⅱ、乙醇溶液Ⅲ的体积浓度均大于50％。
通过对降解温度、降解时间、有机酸或无机酸浓度的工艺条件调整，获得不同分子量范围的透明质酸钠；具体如下：
(a)分子量小于10kDa的透明质酸钠寡糖：降解温度71℃，降解时间10小时，有机酸或无机酸在体系中的质量浓度为51％；
(b)分子量10～100kDa之间的透明质酸钠：降解温度70℃，降解时间7小时，有机酸或无机酸在体系中的质量浓度为50％；
(c)分子量100～800kDa之间的透明质酸钠：降解温度40℃，降解时间6小时，有机酸或无机酸在体系中的质量浓度为30％。
步骤(4)中，后处理成盐包括：过滤，沉淀成盐，脱水，离心，干燥，粉碎，成品。
采用板框过滤得到滤液Ⅰ，以除去菌体，在过滤前调节pH＝4.5。
沉淀成盐的具体方法是：先利用乙醇溶液Ⅳ进行沉淀处理，乙醇溶液Ⅳ的体积浓度为90％，其用量为过滤所得滤液Ⅰ体积的3.5倍，在沉淀处理前调节pH＝6；然后利用与发酵液等体积的0.1mol/L氯化钠水溶液溶解所得沉淀，边搅拌边加入质量浓度1％氯化十六烷基吡啶水溶液以与其中的透明质酸发生络合沉淀，静置取沉淀Ⅳ，再将沉淀Ⅳ加入0.4mol/L氯化钠溶液中，搅拌12小时，过滤取滤液Ⅱ，最后将滤液Ⅱ利用乙醇溶液Ⅴ进行沉淀处理，乙醇溶液Ⅴ的体积浓度为85％，其用量为过滤所得滤液Ⅱ体积的3倍。
氯化十六烷基吡啶水溶液的用量为发酵液体积的1.5倍。
实施例4：
一种小分子透明质酸钠的生产方法，具体步骤如下：
(1)先采用发酵法生产透明质酸，发酵结束后，搅拌加热，使得含有透明质酸的发酵液的动力粘度降低；
(2)然后将步骤(1)处理后的发酵液分别使用乙醇溶液Ⅰ和乙醇溶液Ⅱ处理，获得沉淀Ⅱ；
(3)接着将沉淀Ⅱ与乙醇溶液Ⅲ混合，并进行降解处理，得到沉淀Ⅲ；
(4)最后将沉淀Ⅲ用水溶解，使其浓度为50g/L，后处理成盐，即得所述的一种小分子透明质酸钠。
步骤(1)的具体方法是：先采用发酵法生产透明质酸，发酵结束后，在搅拌状态下，将含有透明质酸的发酵液加热至40℃，调节pH＝11.0，保持搅拌8小时，停止加热，使得含有透明质酸的发酵液的动力粘度降低。
步骤(1)中，发酵法生产透明质酸的具体方法如下：
(A)先取斜面菌种接种于种子培养基，37℃培养16小时；
(B)然后接种于发酵罐的液体培养基中，接种体积比为1：10，通气量0.3vvm(每分钟相对于单位发酵体积的通气量)，120rpm和37℃条件下发酵46小时，即得含有透明质酸的发酵液。
种子培养基的配方组成为：葡萄糖5g，蛋白胨10.5g，牛肉膏5.5g，酵母膏7.14g，酵母粉2.5g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁0.5g，琼脂1g，水补足至1000g；液体培养基的配方组成为：葡萄糖30g，蛋白胨10.5g，牛肉膏5.5g，酵母膏7.14g，酵母粉2.5g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁0.5g，水补足至1000g。
在发酵过程中，pH值不断下降，在此过程中控制pH＝7，发酵后期，葡萄糖浓度下降至0.5％以下，pH值下降很慢或不再下降时，即为发酵终点。
步骤(A)中，所述菌种为马链球菌兽疫亚种，ATCC39920，购自上海沪峥生物科技有限公司。
步骤(2)的具体方法是：将将步骤(1)处理后的发酵液与乙醇溶液Ⅰ混合形成混合液，使得混合液中乙醇体积浓度为50％，静置分层取沉淀Ⅰ；再利用乙醇溶液Ⅱ洗涤沉淀Ⅰ，静置分层取沉淀Ⅱ。
步骤(3)的具体方法是：接着将沉淀Ⅱ转移至耐酸可加热罐体内，将沉淀Ⅱ与5倍体积的乙醇溶液Ⅲ混合，继续加入有机酸或无机酸，加热至40℃，持续搅拌，使得透明质酸钠降解为低分子量；停止加热，调节pH＝10，静置分层取沉淀Ⅲ。
所述有机酸或无机酸为盐酸、抗坏血酸、2-氨基乙烷亚磺酸的组合，三者的质量比为1：0.5：0.1。
乙醇溶液Ⅱ的体积为沉淀Ⅰ体积的1倍以上，乙醇溶液Ⅰ的体积浓度为80％，乙醇溶液Ⅱ、乙醇溶液Ⅲ的体积浓度均大于50％。
通过对降解温度、降解时间、有机酸或无机酸浓度的工艺条件调整，获得不同分子量范围的透明质酸钠；具体如下：
(a)分子量小于10kDa的透明质酸钠寡糖：降解温度80℃，降解时间9小时，有机酸或无机酸在体系中的质量浓度为60％；
(b)分子量10～100kDa之间的透明质酸钠：降解温度61℃，降解时间8小时，有机酸或无机酸在体系中的质量浓度为41％；
(c)分子量100～800kDa之间的透明质酸钠：降解温度60℃，降解时间2小时，有机酸或无机酸在体系中的质量浓度为40％。
步骤(4)中，后处理成盐包括：过滤，沉淀成盐，脱水，离心，干燥，粉碎，成品。
采用板框过滤得到滤液Ⅰ，以除去菌体，在过滤前调节pH＝4。
沉淀成盐的具体方法是：先利用乙醇溶液Ⅳ进行沉淀处理，乙醇溶液Ⅳ的体积浓度为95％，其用量为过滤所得滤液Ⅰ体积的3倍，在沉淀处理前调节pH＝6.5；然后利用与发酵液等体积的0.1mol/L氯化钠水溶液溶解所得沉淀，边搅拌边加入质量浓度1％氯化十六烷基吡啶水溶液以与其中的透明质酸发生络合沉淀，静置取沉淀Ⅳ，再将沉淀Ⅳ加入0.4mol/L氯化钠溶液中，搅拌10小时，过滤取滤液Ⅱ，最后将滤液Ⅱ利用乙醇溶液Ⅴ进行沉淀处理，乙醇溶液Ⅴ的体积浓度为90％，其用量为过滤所得滤液Ⅱ体积的3.5倍。
氯化十六烷基吡啶水溶液的用量为发酵液体积的2倍。
实施例5：
一种小分子透明质酸钠的生产方法，具体步骤如下：
(1)先采用发酵法生产透明质酸，发酵结束后，搅拌加热，使得含有透明质酸的发酵液的动力粘度降低；
(2)然后将步骤(1)处理后的发酵液分别使用乙醇溶液Ⅰ和乙醇溶液Ⅱ处理，获得沉淀Ⅱ；
(3)接着将沉淀Ⅱ与乙醇溶液Ⅲ混合，并进行降解处理，得到沉淀Ⅲ；
(4)最后将沉淀Ⅲ用水溶解，使其浓度为30g/L，后处理成盐，即得所述的一种小分子透明质酸钠。
步骤(1)的具体方法是：先采用发酵法生产透明质酸，发酵结束后，在搅拌状态下，将含有透明质酸的发酵液加热至60℃，调节pH＝10.5，保持搅拌9小时，停止加热，使得含有透明质酸的发酵液的动力粘度降低。
步骤(1)中，发酵法生产透明质酸的具体方法如下：
(A)先取斜面菌种接种于种子培养基，37℃培养14小时；
(B)然后接种于发酵罐的液体培养基中，接种体积比为1：10，通气量0.8vvm(每分钟相对于单位发酵体积的通气量)，120rpm和37℃条件下发酵43小时，即得含有透明质酸的发酵液。
种子培养基的配方组成为：葡萄糖5g，蛋白胨10.5g，牛肉膏5.5g，酵母膏7.14g，酵母粉2.5g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁0.5g，琼脂1g，水补足至1000g；液体培养基的配方组成为：葡萄糖50g，蛋白胨10.5g，牛肉膏5.5g，酵母膏7.14g，酵母粉2.5g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁0.5g，水补足至1000g。
在发酵过程中，pH值不断下降，在此过程中控制pH＝7，发酵后期，葡萄糖浓度下降至0.5％以下，pH值下降很慢或不再下降时，即为发酵终点。
步骤(A)中，所述菌种为马链球菌兽疫亚种，ATCC39920，购自上海沪峥生物科技有限公司。
步骤(B)中，120rpm和37℃条件下发酵开始3.5小时后，加入分别为发酵罐中培养
基重量0.9％和0.4％的西黄蓍胶和聚乙烯醇，搅拌均匀，控制pH＝5，保持该pH直至发酵结
束前2.5小时，调整pH＝6.8并控制该pH直至发酵结束。
步骤(2)的具体方法是：将将步骤(1)处理后的发酵液与乙醇溶液Ⅰ混合形成混合液，使得混合液中乙醇体积浓度为60％，静置分层取沉淀Ⅰ；再利用乙醇溶液Ⅱ洗涤沉淀Ⅰ，静置分层取沉淀Ⅱ。
步骤(3)的具体方法是：接着将沉淀Ⅱ转移至耐酸可加热罐体内，将沉淀Ⅱ与3倍体积的乙醇溶液Ⅲ混合，继续加入有机酸或无机酸，加热至60℃，持续搅拌，使得透明质酸钠降解为低分子量；停止加热，调节pH＝8，静置分层取沉淀Ⅲ。
在开始加热搅拌的同时，进行γ射线照射和电子束辐照的交替处理，其中，γ射线照射的剂量为7kGy，电子束辐照的剂量为13kGy，各处理3次，每次处理时间均为5分钟。
所述有机酸或无机酸为盐酸、抗坏血酸、2-氨基乙烷亚磺酸的组合，三者的质量比为1：0.4：0.15。乙醇溶液Ⅱ的体积为沉淀Ⅰ体积的1倍以上，乙醇溶液Ⅰ的体积浓度为85％，乙醇溶液Ⅱ、乙醇溶液Ⅲ的体积浓度均大于50％。
通过对降解温度、降解时间、有机酸或无机酸浓度的工艺条件调整，获得不同分子量范围的透明质酸钠；具体如下：
(a)分子量小于10kDa的透明质酸钠寡糖：降解温度75℃，降解时间9小时，有机酸或无机酸在体系中的质量浓度为55％，范围值中的下限值均为不包含；
(b)分子量10～100kDa之间的透明质酸钠：降解温度65℃，降解时间7小时，有机酸或无机酸在体系中的质量浓度为45％，范围值中的下限值均为不包含；
(c)分子量100～800kDa之间的透明质酸钠：降解温度50℃，降解时间4小时，有机酸或无机酸在体系中的质量浓度为35％。
步骤(4)中，后处理成盐包括：过滤，沉淀成盐，脱水，离心，干燥，粉碎，成品。
采用板框过滤得到滤液Ⅰ，以除去菌体，在过滤前调节pH＝4。
沉淀成盐的具体方法是：先利用乙醇溶液Ⅳ进行沉淀处理，乙醇溶液Ⅳ的体积浓度为93％，其用量为过滤所得滤液Ⅰ体积的3.2倍，在沉淀处理前调节pH＝6；然后利用与发酵液等体积的0.1mol/L氯化钠水溶液溶解所得沉淀，边搅拌边加入质量浓度1％氯化十六烷基吡啶水溶液以与其中的透明质酸发生络合沉淀，静置取沉淀Ⅳ，再将沉淀Ⅳ加入0.4mol/L氯化钠溶液中，搅拌11小时，过滤取滤液Ⅱ，最后将滤液Ⅱ利用乙醇溶液Ⅴ进行沉淀处理，乙醇溶液Ⅴ的体积浓度为88％，其用量为过滤所得滤液Ⅱ体积的3.2倍。
氯化十六烷基吡啶水溶液的用量为发酵液体积的1.8倍。
对比例
一种小分子透明质酸钠的生产方法，具体步骤如下：
(1)先采用发酵法生产透明质酸，发酵结束后，得到含有透明质酸的发酵液；
(2)然后将发酵液分别使用乙醇溶液Ⅰ和乙醇溶液Ⅱ处理，获得沉淀Ⅱ；
(3)接着将沉淀Ⅱ与乙醇溶液Ⅲ混合，并进行降解处理，得到沉淀Ⅲ；
(4)最后将沉淀Ⅲ用水溶解，使其浓度为10g/L，后处理成盐，即得所述的一种小分子透明质酸钠。
步骤(1)中，发酵法生产透明质酸的具体方法如下：
(A)先取斜面菌种接种于种子培养基，37℃培养12小时；
(B)然后接种于发酵罐的液体培养基中，接种体积比为1：10，通气量1.0vvm(每分钟相对于单位发酵体积的通气量)，120rpm和37℃条件下发酵40小时，即得含有透明质酸的发酵液。
种子培养基的配方组成为：葡萄糖5g，蛋白胨10.5g，牛肉膏5.5g，酵母膏7.14g，酵母粉2.5g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁0.5g，琼脂1g，水补足至1000g；液体培养基的配方组成为：葡萄糖60g，蛋白胨10.5g，牛肉膏5.5g，酵母膏7.14g，酵母粉2.5g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁0.5g，水补足至1000g。
在发酵过程中，pH值不断下降，在此过程中控制pH＝6.5，发酵后期，葡萄糖浓度下降至0.5％以下，pH值下降很慢或不再下降时，即为发酵终点。
步骤(A)中，所述菌种为马链球菌兽疫亚种，ATCC39920，购自上海沪峥生物科技有限公司。
步骤(2)的具体方法是：将将步骤(1)处理后的发酵液与乙醇溶液Ⅰ混合形成混合液，使得混合液中乙醇体积浓度为70％，静置分层取沉淀Ⅰ；再利用乙醇溶液Ⅱ洗涤沉淀Ⅰ，静置分层取沉淀Ⅱ。
步骤(3)的具体方法是：接着将沉淀Ⅱ转移至耐酸可加热罐体内，将沉淀Ⅱ与1倍体积的乙醇溶液Ⅲ混合，继续加入有机酸或无机酸，加热至80℃，持续搅拌，使得透明质酸钠降解为低分子量；停止加热，调节pH＝5，静置分层取沉淀Ⅲ。
所述有机酸或无机酸为醋酸。
乙醇溶液Ⅱ的体积为沉淀Ⅰ体积的1倍以上，乙醇溶液Ⅰ的体积浓度为90％，乙醇溶液Ⅱ、乙醇溶液Ⅲ的体积浓度均大于50％。
通过对降解温度、降解时间、有机酸或无机酸浓度的工艺条件调整，获得不同分子量范围的透明质酸钠；具体如下：
(a)分子量小于10kDa的透明质酸钠寡糖：降解温度71℃，降解时间10小时，有机酸或无机酸在体系中的质量浓度为51％；
(b)分子量10～100kDa之间的透明质酸钠：降解温度70℃，降解时间7小时，有机酸或无机酸在体系中的质量浓度为50％；
(c)分子量100～800kDa之间的透明质酸钠：降解温度40℃，降解时间6小时，有机酸或无机酸在体系中的质量浓度为30％。
步骤(4)中，后处理成盐包括：过滤，沉淀成盐，脱水，离心，干燥，粉碎，成品。
采用板框过滤得到滤液Ⅰ，以除去菌体，在过滤前调节pH＝4.5。
沉淀成盐的具体方法是：先利用乙醇溶液Ⅳ进行沉淀处理，乙醇溶液Ⅳ的体积浓度为90％，其用量为过滤所得滤液Ⅰ体积的3.5倍，在沉淀处理前调节pH＝6；然后利用与发酵液等体积的0.1mol/L氯化钠水溶液溶解所得沉淀，边搅拌边加入质量浓度1％氯化十六烷基吡啶水溶液以与其中的透明质酸发生络合沉淀，静置取沉淀Ⅳ，再将沉淀Ⅳ加入0.4mol/L氯化钠溶液中，搅拌12小时，过滤取滤液Ⅱ，最后将滤液Ⅱ利用乙醇溶液Ⅴ进行沉淀处理，乙醇溶液Ⅴ的体积浓度为85％，其用量为过滤所得滤液Ⅱ体积的3倍。
氯化十六烷基吡啶水溶液的用量为发酵液体积的1.5倍。
试验例
参考YY/T 0606.9-2007《组织工程医疗产品第9部分：透明质酸钠》，对实施例1～5和对比例所得产品进行考察，包括葡萄糖醛酸含量和蛋白质含量。结果见表1。
表1.产品质量指标考察
计算产品收率，收率＝(产物质量/发酵液中所含透明质酸质量折算为透明质酸钠质量)×100％，其中，发酵液中所含透明质酸质量是利用CTAB浊度法测量确定。利用凝胶色谱法检测产品的分子量，并计算PD值，PD值＝重均分子量/数均分子量，PD值越小表明分子量分布范围越窄。结果见表2。
表2.产品收率和分子量分布范围考察
由表1和表2可知，实施例1～5所得产品收率和纯度高，并且分子量分布范围窄，其中，实施例3～5增加了γ射线照射和电子束辐照处理或者限定酸的特定组合，产品的收率、纯度等明显较高，分子量分布范围也较窄；实施例5还引入了西黄蓍胶、聚乙烯醇，各项指标 更优。对比例略去了发酵液的加热处理，体系粘度大，严重影响了产品收率和纯度等。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种小分子透明质酸钠的生产方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)先采用发酵法生产透明质酸，发酵结束后，搅拌加热，使得含有透明质酸的发酵液的动力粘度降低；
(2)然后将步骤(1)处理后的发酵液分别使用乙醇溶液Ⅰ和乙醇溶液Ⅱ处理，获得沉淀Ⅱ；
(3)接着将沉淀Ⅱ与乙醇溶液Ⅲ混合，并进行降解处理，得到沉淀Ⅲ；
(4)最后将沉淀Ⅲ用水溶解，使其浓度为10～50g/L，后处理成盐，即得所述的一种小分子透明质酸钠。
2.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，步骤(1)的具体方法是：先采用发酵法生产透明质酸，发酵结束后，在搅拌状态下，将含有透明质酸的发酵液加热至40～80℃，调节pH＝10.5～11.0，保持搅拌8～10小时，停止加热，使得含有透明质酸的发酵液的动力粘度降低。
3.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，步骤(1)中，发酵法生产透明质酸的具体方法如下：
(A)先取斜面菌种接种于种子培养基，37℃培养12～16小时；
(B)然后接种于发酵罐的液体培养基中，接种体积比为1：10，通气量0.3～1.0vvm，120rpm和37℃条件下发酵40～46小时，即得含有透明质酸的发酵液。
4.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，步骤(2)的具体方法是：将将步骤(1)处理后的发酵液与乙醇溶液Ⅰ混合形成混合液，使得混合液中乙醇体积浓度为50～70％，静置分层取沉淀Ⅰ；再利用乙醇溶液Ⅱ洗涤沉淀Ⅰ，静置分层取沉淀Ⅱ。
5.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，步骤(3)的具体方法是：接着将沉淀Ⅱ转移至耐酸可加热罐体内，将沉淀Ⅱ与1～5倍体积的乙醇溶液Ⅲ混合，继续加入有机酸或无机酸，加热至40～80℃，持续搅拌，使得透明质酸钠降解为低分子量；停止加热，调节pH＝5～10，静置分层取沉淀Ⅲ。
6.根据权利要求5所述的生产方法，其特征在于，所述有机酸或无机酸选自醋酸、盐酸或硫酸的任一种。
7.根据权利要求5所述的生产方法，其特征在于，乙醇溶液Ⅱ的体积为沉淀Ⅰ体积的1倍以上，乙醇溶液Ⅰ的体积浓度为80～90％，乙醇溶液Ⅱ、乙醇溶液Ⅲ的体积浓度均大于50％。
8.根据权利要求5所述的生产方法，其特征在于，通过对降解温度、降解时间、有机酸或无机酸浓度的工艺条件调整，获得不同分子量范围的透明质酸钠。
9.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，步骤(4)中，后处理成盐包括：过滤，沉淀成盐，脱水，离心，干燥，粉碎，成品。
10.根据权利要求9所述的生产方法，其特征在于，采用板框过滤得到滤液Ⅰ，以除去菌体，在过滤前调节pH＝4～4.5。
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| WO2024036637A1 (zh) * | 2022-08-19 | 2024-02-22 | 北京瑞济善健康科技有限公司 | 一种透明质酸钠寡糖组合物的制备方法及其制备得到的组合物与应用 |
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2020
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| WO2024036637A1 (zh) * | 2022-08-19 | 2024-02-22 | 北京瑞济善健康科技有限公司 | 一种透明质酸钠寡糖组合物的制备方法及其制备得到的组合物与应用 |
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