CN108410927B - 一种发酵法生产高分子量透明质酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于透明质酸生物发酵领域，公开了一种发酵法生产高分子量透明质酸的方法，其包括以下步骤：步骤1)菌株活化，步骤2)发酵，步骤3)过滤、醇沉、离心以及干燥。本发明方法简单可行，生产的透明质酸产量和分子量高，外观洁白透亮，达到化妆品级产品的要求。
Description
技术领域
本发明属于透明质酸生物发酵领域，具体涉及一种发酵法生产高分子量透明质酸的方法。
背景技术
透明质酸(hyaluronic acid，HA)化学名称为糖醛(玻璃)酸，它是以D-葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖单体为结构单元，通过β-1，4糖苷键反复交替连接而形成的链状高分子酸性粘多糖。HA通常溶于水，不溶于醇、酮、乙醚等有机溶剂，具有保湿、抗衰老、润滑等功能，广泛用于日化、保健食品、医药等领域；如在医药领域，HA在药物中可作为药物载体可将各类药物靶向送至病理部位，具有促进骨折愈合及一定抗癌作用等功效。
透明质酸钠产品因其分子量的不同而体现出不同的生物特性。
(1)大分子透明质酸(分子量范围180万～260万)可在皮肤表面形成一层透气的薄膜，使皮肤光滑湿润，并可阻隔外来细菌、灰尘、紫外线的侵入，保护皮肤免受侵害。
(2)中分子透明质酸(分子量范围100万～180万)可以紧致肌肤，长久保湿。
(3)小分子透明质酸(分子量范围40万～100万)能渗入真皮，具有轻微扩张毛细血管，增加血液循环、改善中间代谢、促进皮肤营养吸收作用，具有较强的消皱功能，可增加皮肤弹性，延缓皮肤衰老。相对于中小分子量的透明质酸来说，高分子量透明质酸对肌肤的保护作用更大，更适用于化妆品及美容行业，市场前景广阔。
透明质酸的生产方法主要包括动物来源的透明质酸提取和发酵法制备透明质酸；相较于动物提取，发酵法具有不受原料来源限制、工艺简便、易形成生产规模并且无病毒交叉感染的风险，更为重要的是，该方法大大降低了生产成本，使透明质酸的应用范围得到了极大地推广。
申请人之前的专利技术CN105368912A采用两菌株混合发酵，大大提高了发酵效率，但是该方法对培养条件要求较高，可能导致不能形成优势菌株，而且产生的透明质酸包括小、中、大三种分子量的透明质酸，不能形成纯度较高的单一产品，降低了产品附加值。高分子透明质酸的产生与发酵培养基类型、发酵条件以及菌株细胞通透性等条件的影响。如何提高高分子透明质酸的产率以及纯度是我们需要解决的技术问题。
发明内容
为了克服现有技术存在的缺陷，本发明提供了一种发酵法生产高分子量透明质酸的方法。
本发明是通过如下技术方案来实现的：
一种发酵法生产高分子量透明质酸的方法，其包括以下步骤：步骤1)菌株活化，步骤2) 发酵，步骤3)过滤、醇沉、离心以及干燥。
具体地，
所述方法包括如下步骤：
步骤1)菌株活化：将兽疫链球菌取出，接种于活化培养基进行活化；
步骤2)发酵：将活化好的菌种接种于发酵罐中进行发酵，发酵温度为39-40℃，溶氧为 3.1L/min；发酵至6-7h，往发酵罐中添加甘油；发酵至14-15h，超声处理，然后继续发酵 2h，终止发酵；发酵过程中，通过流加蔗糖溶液将残糖浓度控制在不低于30g/L；
步骤3)过滤、醇沉、离心以及干燥：利用板框过滤去除菌体，得到上清液，向上清液中加入2-3倍体积的无水乙醇进行沉淀90-120min，收集沉淀得到湿物料；将湿物料进行离心、真空冷冻干燥、粉碎得高分子量透明质酸。
优选地，
所述甘油在发酵罐中的浓度为200-300mg/L。
优选地，
所述超声处理的参数：超声功率分别为300-400w，作用时间为每次3s，间隔时间为3s，超声处理的总时间为90-120s。
优选地，
所述活化培养基的组分包括：蔗糖75g/L、蛋白胨2.5g/L以及硫酸镁1.5g/L。
优选地，
所述发酵罐中发酵培养基的组分包括：蔗糖70g/L，蛋白胨2.0g/L，硫酸镁1.8g/L，硫酸钾1.5g/L，pH 7.0-7.5。
本发明取得的有益效果主要包括但是并不限于以下几个方面：
本发明在发酵制备透明质酸的方法中，对多种因素进行优化和改进，提高了透明质酸的产量、分子量，纯度也大大提高；
本发明在发酵过程中，通过添加甘油可以显著改善透明质酸的结果，甘油浓度在200mg/L 发酵产量最高，随着甘油浓度的增加，透明质酸的产量逐渐下降；随着甘油浓度在增加，透明质酸的分子量增大，300mg/L以后分子量增幅并不明显，为了实现了高产量和高分子量结果的统一，选择甘油浓度为200-300mg/L为最佳。
超声的空化作用可以导致细胞的非热生物效应，使细胞膜短时局部破裂，从而改变细胞质膜的通透性，使胞内物质释放到细胞外；随着超声强度的增加，透明质酸的产量先升后降，；而分子量随着强度的增加会降低，最终选择超声强度在200-400w最为合适，能够实现高产量和高分子量结果的统一。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合本申请具体实施例，对本发明进行更加清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
实施例1
一种发酵法生产高分子量透明质酸的方法，包括以下步骤：
将兽疫链球菌取出，接种于成分为蔗糖75g/L，蛋白胨2.5g/L，硫酸镁1.5g/L的活化培养基进行活化；
将活化好的菌种接种于5L的发酵罐中进行发酵，发酵配方为蔗糖70g/L，蛋白胨2.0g/L，硫酸镁1.8g/L，硫酸钾1.5g/L，pH 7.1，温度39.5℃，溶氧3.1L/min；发酵6h，往发酵罐中添加甘油，控制甘油的浓度为200mg/L；发酵14h，超声处理，超声处理的参数：超声功率分别为400w，超声的作用时间为每次3s，间隔时间为3s，超声处理的总时间为90s；然后继续发酵2h，终止发酵；发酵总时间为16h；发酵过程中，通过流加浓度为100g/L的蔗糖溶液将残糖浓度控制在不低于30g/L；
利用板框去除菌体，得到上清液，向上清液中加入3倍体积的无水乙醇进行沉淀90min，收集沉淀得到湿物料；将湿物料进行离心、真空冷冻干燥干燥、粉碎得高分子量透明质酸。
经检测，发酵液中透明质酸的含量为3.79g/L，获得的透明质酸经粘度法检测分子量为239 万Da，收率为95％，纯度为96.2％，透光率为99.8％，菌落数＜50且外观洁白透亮，达到化妆品级产品的要求。
实施例2
一种发酵法生产高分子量透明质酸的方法，包括以下步骤：
将兽疫链球菌取出，接种于主要成分为蔗糖75g/L，蛋白胨2.5g/L，硫酸镁1.5g/L的活化培养基进行活化；
将活化好的菌种接种于10L的发酵罐中进行发酵，发酵配方为蔗糖70g/L，蛋白胨2.0g/L，硫酸镁1.8g/L，硫酸钾1.5g/L，pH 7.0，温度39.8℃，溶氧3.0L/min；
发酵至7h，往发酵罐中添加甘油，甘油的浓度为300mg/L；发酵至15h，超声处理，超声处理的参数：超声功率分别为300w，超声的作用时间为每次3s，间隔时间为3s，超声处理的总时间为120s；然后继续发酵2h，终止发酵；发酵过程中，通过流加浓度为100g/L的蔗糖溶液将残糖浓度控制在不低于30g/L；
发酵结束后，利用板框去除菌体，得到上清液，向上清液中加入两倍体积的无水乙醇进行沉淀120min，收集沉淀得到湿物料；将湿物料进行离心、真空冷冻干燥干燥、粉碎得高分子量透明质酸。
经检测，发酵液中透明质酸的含量为3.67g/L，获得的透明质酸经粘度法检测分子量为 237万Da，收率为96％，纯度为96.8％，透光率为99.9％，菌落数＜50且外观洁白透亮，达到化妆品级产品的要求。
实施例3
发酵工艺中各因素对透明质酸产量和分子量的影响：
影响因素一：甘油。以实施例1为例，设置多个甘油浓度组别，分别是0mg/L，100mg/L， 200mg/L，300mg/L，400mg/L，500mg/L，其余同实施例1。检测发酵液中透明质酸的产量以及分子量，具体见表1：
表1
| 甘油浓度mg/L | 透明质酸产量g/L | 透明质酸分子量(万Da) |
| 0 | 2.53 | 182 |
| 100 | 2.98 | 197 |
| 200 | 3.79 | 239 |
| 300 | 3.64 | 243 |
| 400 | 3.27 | 248 |
| 500 | 3.01 | 251 |
结论：如表1所示，添加甘油可以显著改善透明质酸的结果，甘油浓度在200mg/L发酵产量最高，随着甘油浓度的增加，透明质酸的产量逐渐下降；随着甘油浓度在增加，透明质酸的分子量增大，300mg/L以后分子量增幅并不明显，
为了实现了高产量和高分子量结果的统一，选择甘油浓度为200-300mg/L为最佳。上述原因可能是甘油能够对细胞膜结构和空隙产生影响，从而会对糖链分泌的正向作用，但是浓度过高可能会抑制菌株产透明质酸的途径。
影响因素二：超声处理。以实施例1为例，设置多个超声强度组别，分别是0，100w，200w， 300w，400w，500w，其余同实施例1。检测发酵液中透明质酸的产量以及分子量，具体见表2：
表2
| 超声强度w | 透明质酸产量g/L | 透明质酸分子量(万Da) |
| 0 | 2.78 | 253 |
| 100 | 3.09 | 248 |
| 200 | 3.34 | 241 |
| 300 | 3.63 | 237 |
| 400 | 3.79 | 230 |
| 500 | 3.06 | 204 |
结论：超声的空化作用可以导致细胞的非热生物效应，使细胞膜短时局部破裂，从而改变细胞质膜的通透性，使胞内物质释放到细胞外；如表2所示，随着超声强度的增加，透明质酸的产量先升后降，可能是超声波能够改变细胞膜结构，对细菌产生不利影响，从而导致透明质酸产量提高，但是随着强度的增大，对菌株产生了部分致死，导致产量下降；而分子量随着强度的增加会降低，最终选择超声强度在200-400w最为合适，能够实现高产量和高分子量结果的统一。
以上列举的仅是本发明的最佳具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (1)
1.一种发酵法生产高分子量透明质酸的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
步骤1)菌株活化：将兽疫链球菌取出，接种于活化培养基进行活化；所述活化培养基的组分包括：蔗糖75g/L、蛋白胨2.5g/L以及硫酸镁1.5g/L；
步骤2)发酵：将活化好的菌种接种于发酵罐中进行发酵，发酵温度为39-40℃，溶氧为3.1L/min；发酵至6-7h，往发酵罐中添加甘油；发酵至14-15h，超声处理，然后继续发酵2h，终止发酵；发酵过程中，通过流加蔗糖溶液将残糖浓度控制在不低于30g/L；所述发酵罐中发酵培养基的组分包括：蔗糖70g/L，蛋白胨2.0g/L，硫酸镁1.8g/L，硫酸钾1.5g/L，pH7.0-7.5；所述甘油在发酵罐中的浓度为200-300mg/L；所述超声处理的参数：超声功率为300-400w，作用时间为每次3s，间隔时间为3s，超声处理的总时间为90-120s；
步骤3)过滤、醇沉、离心以及干燥：利用板框过滤去除菌体，得到上清液，向上清液中加入2-3倍体积的无水乙醇进行沉淀90-120min，收集沉淀得到湿物料；将湿物料进行离心、真空冷冻干燥、粉碎得高分子量透明质酸。
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