CN104651340A - 微杆菌来源的桃胶多糖裂解酶及其分离纯化方法与应用 - Google Patents

微杆菌来源的桃胶多糖裂解酶及其分离纯化方法与应用 Download PDF

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王伟
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Abstract

本发明公开了一种微杆菌来源的桃胶多糖裂解酶及其分离纯化方法与应用。本发明通过对微杆菌A5驯化后发酵培养，对发酵上清用硫酸铵沉淀，将沉淀物复溶后依次用苯基琼脂糖凝胶6FF柱和Toyopearl DEAE-650S柱纯化，得到微杆菌来源的桃胶多糖裂解酶。该桃胶多糖裂解酶能有效分解桃胶，因此，其能用于分解桃胶，得到功能性低聚糖。

Description

微杆菌来源的桃胶多糖裂解酶及其分离纯化方法与应用
技术领域
本发明属于蛋白质分离纯化与酶学特性研究及应用技术领域，特别涉及一种微杆菌来源的桃胶多糖裂解酶及其分离纯化方法与应用。
背景技术
桃胶系桃、李、杏、樱桃等蔷薇科植物树干受机械伤(如虫咬、切伤等)或致病后分泌出来的胶质半透明物质，为多糖类物质，由半乳糖和阿拉伯糖构成其多糖骨架的主要成分。桃胶已被用于食品、医药等领域。
近年来，低聚糖因具有抗凝血、抗氧化、抗肿瘤、抗菌等生物学活性而备受关注，成为糖生物学新的研究热点。利用酶解法加工原桃胶，不仅可以使原桃胶分解、生产具有广泛工业用途的可溶性商品桃胶，更可以使桃胶多糖的骨架裂解，获得功能性低聚糖。利用酶解法加工原桃胶，先决条件在于得到能裂解原桃胶的酶以及该酶在以桃胶为底物时的最佳酶解条件。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种微杆菌来源的桃胶多糖裂解酶的分离纯化方法。
本发明的另一目的在于提供通过上述分离纯化方法得到的微杆菌来源的桃胶多糖裂解酶。
本发明的再一目的在于提供所述微杆菌来源的桃胶多糖裂解酶的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种微杆菌来源的桃胶多糖裂解酶的分离纯化方法，包括如下步骤：
(1)菌种的驯化：
①第一次驯化：将微杆菌A5种子液接种到含有质量百分比2％桃胶的LB培养基中，于摇床中培养至桃胶溶解，得到第一次驯化液；
②第二次驯化：将第一次驯化液接种到含有质量百分比4％桃胶的LB培养基中，于摇床中培养至桃胶溶解，得到第二次驯化液；
③第三次驯化：将第二次驯化液接种到含有质量百分比6％桃胶的LB培养基中，于摇床中培养至桃胶溶解，得到第三次驯化液；
④第四次驯化：将第三次驯化液接种到含有质量百分比8％桃胶的LB培养基中，于摇床中培养至桃胶溶解，得到第四次驯化液；
⑤第五次驯化：将第四次驯化液接种到含有质量百分比10％桃胶的LB培养基中，于摇床中培养至桃胶溶解，得到驯化好的种子液；
(2)发酵培养：将驯化好的种子液接种到发酵培养基中，于摇床中培养至桃胶完全溶解；发酵培养基为含有质量百分比6％桃胶的LB培养基，初始pH值为6；
(3)分离纯化：
①将发酵液离心，去除菌体，取上清；
②在上清中加入硫酸铵至饱和，于4℃静置过夜；离心收集沉淀，随后用磷酸缓冲液将沉淀复溶；接着用磷酸缓冲液进行透析，期间更换磷酸缓冲液数次直至透析完全；透析结束后，透析液离心除去不溶杂蛋白，收集上清液待纯化；
③将步骤②得到的上清液上样到苯基琼脂糖凝胶6FF(Phenyl Sepharose 6Fast Flow)柱中，收集第二个穿柱峰；
④对第二个穿柱峰上样到Toyopearl DEAE-650S柱中，接着用磷酸缓冲液进行平衡，而后再用0.6M NaCl溶液进行洗脱，收集第一个洗脱峰；
⑤将第一个洗脱峰透析后冻干，得到桃胶多糖裂解酶。
步骤(1)①中所述的微杆菌A5已在专利号为“200910193340.X”、名称为“桃胶分解酶生产菌株及其在制备桃胶多糖中的应用”中公开；
步骤(1)①中所述的微杆菌A5种子液优选通过如下步骤得到：首先将微杆菌A5于LB平板上划线；再挑菌落接种到LB液体培养基中，摇床中进行培养，得到微杆菌A5种子液；
本发明中所述的摇床的条件优选设置为28～30℃、180～200rpm；更优选为30℃、180rpm；
步骤(1)中所述的接种的量优选为体积百分比7.5％；
步骤(2)中所述的接种的量优选为体积百分比10％；
步骤(3)中所述的离心的条件优选为4℃、10000rpm离心20min；
步骤(3)②中所述的磷酸缓冲液优选为20mmol/L、pH6.0的磷酸缓冲液；
步骤(3)②中所述的透析完全为往磷酸缓冲液中滴入硝酸银溶液时无沉淀；
步骤(3)③中所述的第二个穿柱峰的获得条件优选为：使用规格为 的苯基琼脂糖凝胶6FF层析柱，上样流速为1.0ml/min，紫外检测器的检测条件为280nm；
步骤(3)④中所述的上样的速度优选为1.0ml/min；
步骤(3)④中所述的磷酸缓冲液的平衡的速度优选为1.0ml/min；所述的磷酸缓冲液优选为pH6、20mM的磷酸缓冲液；
步骤(3)④中所述的洗脱的速度优选为1.0ml/min；
步骤(3)④中所述的洗脱峰为通过280nm的紫外检测器进行监测。
一种微杆菌来源的桃胶多糖裂解酶，通过上述分离纯化方法得到。
所述的微杆菌来源的桃胶多糖裂解酶用于裂解桃胶，使用条件优选为：30～40℃、pH值为5～7的磷酸缓冲液；更优选为30℃、pH值为6的磷酸缓冲液；最优选为30℃、pH值为6的磷酸缓冲液，配以1mM的K+、Ca2+和Mn2+中的一种或至少两种离子，或配以10mM的Na+和Mg2+中的一种或两种离子。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明提供的方法在发酵之前先经过2％、4％、6％、8％、10％桃胶质量百分比的前期驯化，有利于诱导菌株产生桃胶多糖裂解酶；然后以质量百分比6％原桃胶的发酵液进行发酵产酶；接着通过Phenyl Sepharose Fast Flow将发酵上清液中的疏水性蛋白进行吸附起到除去杂蛋白的目的，具有分解桃胶多糖的裂解酶以穿柱液的形式保留在穿柱液中，结合Toyopearl DEAE-650S的使用，将具有分解桃胶多糖活性的裂解酶吸附在柱子上，利用浓度为0.6M的NaCl溶液进行洗脱，得到具有活性的裂解酶，而且利用本方法制取分解桃胶多糖的裂解酶国内外文献还没有报道。
(2)本发明提供的方法不仅操作方便，而且通过该方法得到的桃胶多糖裂解酶能保持酶活。
(3)本发明提供的桃胶多糖裂解酶的使用条件是该桃胶多糖裂解酶的最佳反应条件，能很好地分解原桃胶。
附图说明
图1是HPLC对酶解产物进行分析时标准糖类的图谱图。
图2是酶解反应时对照组样品的HPLC分析结果图。
图3是酶解反应时反应组样品的HPLC分析结果图。
图4是温度对桃胶多糖裂解酶活性的影响的结果图。
图5是pH值对桃胶多糖裂解酶活性的影响的结果图。
图6是金属离子及抑制剂对酶催化活性的影响的结果图。
图7是桃胶多糖裂解酶作用于底物桃胶的米氏方程图。
图8是桃胶多糖裂解酶作用于底物桃胶的双倒数图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例
一、制备桃胶裂解酶
(1)菌体的前期驯化：用接种针挑取试管斜面保藏的菌株(微杆菌A5，已在专利号为“200910193340.X”、名称为“桃胶分解酶生产菌株及其在制备桃胶多糖中的应用”中公开)于LB平板培养基上划线，随后将平板放置于30℃的恒温培养箱中培养。待平板上长出单克隆，挑取单克隆于LB液体培养基中，于180rpm、30℃的摇床中培养，作为第一次驯化的种子液。第一次驯化，培养基为含有质量百分比2％桃胶的LB培养基(500mL三角瓶装液量为150mL)，接入种子液20mL，于180rpm、30℃的摇床中培养至桃胶溶解；第二次驯化，培养基为含有质量百分比4％桃胶的LB培养基(500mL三角瓶装液量为150mL)，接入第一次驯化液20mL，于180rpm、30℃的摇床中培养至桃胶溶解；第三次驯化，培养基为含有质量百分比6％桃胶的LB培养基(500mL三角瓶装液量为150mL)，接入第二次驯化液20mL，于180rpm、30℃的摇床中培养至桃胶溶解；第四次驯化，培养基为含有8％桃胶的LB培养基(500mL三角瓶装液量为150mL)，接入第三次驯化液20mL，于180rpm、30℃的摇床中培养至桃胶溶解；第五次驯化，培养基为含有10％桃胶的LB培养基(500mL三角瓶装液量为150mL)，接入第四次驯化液20mL，于180rpm、30℃的摇床中培养至桃胶溶解，这部分的菌液将作为摇瓶发酵培养的种子液。
(2)摇瓶发酵培养：将第五次驯化好的菌液作为种子液，种子液100ml(10％接种量)接入到1L发酵培养基(初始pH为6、含有质量百分比6％桃胶的LB培养基)中，随后将其置于180rpm、30℃的摇床中培养，待培养基中的桃胶完全溶解时结束发酵。
(3)离心分离去除菌体与杂质：将培养好的发酵液分装到离心管中，置于高速冷冻离心机内，离心的条件为4℃下10000rpm离心20min，去除菌体与固体杂质保留上清，将上清混合再次以同样的离心条件离心，保留上清。
(4)饱和硫酸铵沉淀：在冰浴条件下边搅拌(速度为200rpm)边往发酵液中缓慢地加入研磨好的硫酸铵粉末至饱和，于4℃层析柜静置过夜；离心收集沉淀，沉淀用磷酸缓冲液(20mM、pH6.0)复溶，随后将复溶液装入透析袋，用20mM、pH6.0的磷酸缓冲液作为透析液进行透析，期间更换磷酸缓冲液数次直至透析完全；透析结束后，透析液于4℃下10000rpm离心20min除去不溶杂质，收集上清液待下一步的纯化。
(5)Phenyl Sepharose Fast Flow疏水层析：蛋白样品的第一步纯化利用了Phenyl Sepharose Fast Flow(广州浩码生物科技公司)疏水层析，整个上样过程流速控制在1.0ml/min，柱子规格为层析柱，紫外检测器的检测条件为280nm，整个上样的体积为30ml，整个纯化过程中疏水性的杂蛋白吸附在填料上，具有酶活的蛋白没有结合在填料上，在整个上样过程中先后出现了两个穿柱峰，具有活性的蛋白存在于第二个穿柱峰中；
(6)Toyopearl DEAE-650S离子交换层析：蛋白样品的第二步纯化采用了Toyopearl DEAE-650S(东曹生物科技有限公司)离子交换层析，上样的流速控制在1.0ml/min，上样的体积为18ml，用20mmol/L磷酸缓冲液(PH6.0)进行平衡，平衡时的流速控制在1.0ml/min，平衡5个柱床体积，接着用0.6M氯化钠溶液进行洗脱，洗脱速度控制在1.0ml/min，洗脱下来的蛋白具有酶活。
(7)冷冻干燥：将具有活性的蛋白洗脱液装入透析袋，用20mM、pH6的磷酸缓冲液作为透析液进行透析，透析完全后将蛋白溶液进行低温冷冻干燥，将得到的蛋白以干粉形式进行保存。
二、检测桃胶裂解酶的活性
(1)蛋白质量：通过该方法得到的桃胶裂解酶为11.04±1.0mg。
(2)酶活性的检测，分别使用了下列检测方法：
①采用郭金格、郑树朝在还原糖的测定方法的研究中使用的DNS显色法检测还原糖，方法如下：样品分9组分别编号为对照组1、对照组2、对照组3、反应组1、反应组2、反应组3、反应组4、反应组5、反应组6，各组样品均为1％桃胶液，对照组样品不加酶溶液，反应组1、2、3、4、5、6样品分别加入等量的酶溶液；将9组样品放在恒温孵育箱内40℃孵育6个小时；使用DNS显色法检测9组样品中的还原糖含量。
②采用HPLC对酶解产物进行分析，具体的实施方法如下：样品分3组分别编号为对照组1、对照组2、反应组3，对照组1为蔗糖、麦芽糖、果糖、葡萄糖和乳糖的混合样，用来作为对照；对照组2为1％的桃胶溶液、反应组3为1％的桃胶溶液和酶溶液的混合液；3组样品在恒温孵育箱内40℃孵育6个小时；之后进行高效液相色谱测定3组样品的组分。
色谱条件如下：分析仪器为1260UHPLC；柱温：25℃；柱子为分析柱ZORBAX NH2；检测器为UV检测器；流动相为乙腈：水＝70:30。
得到的分析结果如表1和图1～3所示：
表1DNS法检测桃胶裂解酶活性
由表1可以知道三组对照组的OD520的值都较小，分别为0.001、0.003和0.004，6组反应组的OD520与对照组相比都较大，分别为0.035、0.037、0.034、0.027、0.020和0.029，说明桃胶液在加入酶溶液之后产生了还原糖，说明本发明分离纯化得到的酶溶液是具有分解桃胶多糖的能力，产物为还原糖。
图1为对照组1是用蔗糖、麦芽糖、果糖、葡萄糖和乳糖做的标准曲线，根据保留时间从图谱上可以看出，5.298-果糖、5.726-葡萄糖、7.059-蔗糖、7.840-麦芽糖、8.450-乳糖；图2为反应组2的产物分析图，在保留时间5.070出现一个信号峰；图3为反应组3的产物分析图，图3中在保留时间5.111、5.5和8.473分别出现了三个信号峰，根据保留时间的分析，这三个信号峰所代表的产物可能为果糖、葡萄糖和乳糖。进一步说明本发明分离纯化得到的酶溶液是具有活性的。
(3)酶活性单位：39.6～63.3IU(注：一个酶活力单位定义为1min产生1μmol还原糖所需的酶量，所以可以根据反应时间、产生的还原糖的量以及所用的酶的量来计算酶活单位)。
三、桃胶裂解酶的酶学特性的研究
(1)温度对酶催化活性的影响：
在pH6.0条件下，按照酶活性测定方法DNS显色法测定酶在15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃等不同温度下的酶活性大小。
(2)pH对酶催化活性影响：
根据步骤(1)中得出的酶的最适作用温度，按照酶活性测定方法DNS显色法测定酶在pH3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0下的酶活性大小，考察pH对酶催化活性的影响。
(3)金属离子及抑制剂对酶催化活性的影响：
根据步骤(1)和(2)得出的酶的最适作用温度和pH条件，在酶的反应体系中分别加入不同的金属离子，分别为Na+、K+、Ca2+、Cu2+、Fe2+、Li+、Zn2+、Ni2+、Mg2+和Mn2+，抑制剂为SDS和金属螯合剂为EDTA，使金属离子和抑制剂的终浓度为1mmol/L和10mmol/L，考察不同金属离子和抑制剂对酶催化活性的影响，以反应体系中不加入金属离子和抑制剂作为对照，定义其酶活力为100％，然后按照酶活性测定方法测定相对酶活力。
(4)酶促反应动力学参数测定：
用20mM的磷酸缓冲液(pH6.0)配制不同浓度的可溶性桃胶溶液，然后分别与相同量的酶溶液反应，在30℃下测定不同底物浓度下的酶促反应初速度V0，然后拟合成经典的米氏方程模型，将米氏方程转换成双倒数图求解可溶性桃胶为底物时的米氏常数Km值和最大反应速度Vmax值。
得到的分析结果如下：
图4为不同温度下测得酶的活性，从图中可以得出，酶的活性随着温度的升高呈现出先升高后下降的趋势，温度在30℃～40℃之间活性最高，说明酶最适合在这个温度区间段发挥作用从图中可以看出酶的最适作用温度为30℃；图5为不同pH条件下测得酶的活性，酶的活性是随着pH的逐步升高呈现先升高后下降的趋势，在极低的pH和极高pH条件下酶的活性很低，在pH5～7酶的活性较高，从图中可以看出酶的最适作用pH为6.0；图6为不同金属离子及抑制剂对酶催化活性的影响，当金属离子的浓度为1mM时，Cu2+、Fe2+、Li+、Zn2+和Ni2+对酶的活性具有抑制作用，K+、Ca2+和Mn2+对酶的活性具有一定的激活作用，当金属离子的浓度为10mM时，Ca2+、Cu2+、Fe2+、Li+、Zn2+和Ni2+对酶的活性具有抑制作用，Na+和Mg2+对酶的活性具有一定的激活作用，SDS基本够完全抑制酶的活性，EDTA作为金属螯合剂基本不影响酶的活性；图7和图8为酶促反应动力学参数的测定，在温度30℃、pH6.0的条件下，测得了桃胶分解酶与不同浓度桃胶溶液的反应初速度，对酶促反应初速度数据进行了米氏方程的模型拟合，获得了米氏方程及双倒数图，从图中可以得出，米氏常数的Km＝1.8mg/mL，最大反应速度Vmax＝0.00308mmol/L.min。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种微杆菌来源的桃胶多糖裂解酶的分离纯化方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)菌种的驯化：
①第一次驯化：将微杆菌A5种子液接种到含有质量百分比2％桃胶的LB培养基中，于摇床中培养至桃胶溶解，得到第一次驯化液；
②第二次驯化：将第一次驯化液接种到含有质量百分比4％桃胶的LB培养基中，于摇床中培养至桃胶溶解，得到第二次驯化液；
③第三次驯化：将第二次驯化液接种到含有质量百分比6％桃胶的LB培养基中，于摇床中培养至桃胶溶解，得到第三次驯化液；
④第四次驯化：将第三次驯化液接种到含有质量百分比8％桃胶的LB培养基中，于摇床中培养至桃胶溶解，得到第四次驯化液；
⑤第五次驯化：将第四次驯化液接种到含有质量百分比10％桃胶的LB培养基中，于摇床中培养至桃胶溶解，得到驯化好的种子液；
(2)发酵培养：将驯化好的种子液接种到发酵培养基中，于摇床中培养至桃胶完全溶解；发酵培养基为含有质量百分比6％桃胶的LB培养基，初始pH值为6；
(3)分离纯化：
①将发酵液离心，去除菌体，取上清；
②在上清中加入硫酸铵至饱和，于4℃静置过夜；离心收集沉淀，随后用磷酸缓冲液将沉淀复溶；接着用磷酸缓冲液进行透析，期间更换磷酸缓冲液数次直至透析完全；透析结束后，透析液离心除去不溶杂蛋白，收集上清液待纯化；
③将步骤②得到的上清液上样到苯基琼脂糖凝胶6FF柱中，收集第二个穿柱峰；
④对第二个穿柱峰上样到Toyopearl DEAE-650S柱中，接着用磷酸缓冲液进行平衡，而后再用0.6M NaCl溶液进行洗脱，收集第一个洗脱峰；
⑤将第一个洗脱峰透析后冻干，得到桃胶多糖裂解酶。
2.根据权利要求1所述微杆菌来源的桃胶多糖裂解酶的分离纯化方法，其特征在于：所述的摇床的条件设置为28～30℃、180～200rpm。
3.根据权利要求1所述微杆菌来源的桃胶多糖裂解酶的分离纯化方法，其特征在于：步骤(1)中所述的接种的量为体积百分比7.5％；步骤(2)中所述的接种的量为体积百分比10％。
4.根据权利要求1所述微杆菌来源的桃胶多糖裂解酶的分离纯化方法，其特征在于：步骤(3)中所述的离心的条件为4℃、10000rpm离心20min。
5.根据权利要求1所述微杆菌来源的桃胶多糖裂解酶的分离纯化方法，其特征在于：步骤(3)②中所述的磷酸缓冲液为20mmol/L、pH6.0的磷酸缓冲液。
6.一种微杆菌来源的桃胶多糖裂解酶，其特征在于：通过权利要求1～5任一项所述的分离纯化方法得到。
7.权利要求6所述微杆菌来源的桃胶多糖裂解酶在裂解桃胶中的应用。
8.根据权利要求7所述微杆菌来源的桃胶多糖裂解酶在裂解桃胶中的应用，其特征在于：所述的桃胶多糖裂解酶的酶解温度为30～40℃，酶解体系为pH值为5～7的磷酸缓冲液。
9.根据权利要求7所述微杆菌来源的桃胶多糖裂解酶在裂解桃胶中的应用，其特征在于：所述的桃胶裂解酶的酶解温度为30℃，酶解体系为pH值为6的磷酸缓冲液。
10.根据权利要求9所述微杆菌来源的桃胶多糖裂解酶在裂解桃胶中的应用，其特征在于：所述的桃胶裂解酶的酶解温度为30℃；酶解体系为pH值为6的磷酸缓冲液配以1mM的K+、Ca2+和Mn2+中的一种或至少两种离子，或配以10mM的Na+和Mg2+中的一种或两种离子。
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