CN103436468B

CN103436468B - 一种幽门螺杆菌快速生长添加剂及其制备方法

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Publication number: CN103436468B
Application number: CN201310346279.4A
Authority: CN
Inventors: 杨宁敏; 屠苗颖
Original assignee: HANGZHOU ZHIYUAN MEDICAL LABORATORY Co Ltd
Current assignee: HANGZHOU ZHIYUAN MEDICAL LABORATORY Co Ltd
Priority date: 2013-08-11
Filing date: 2013-08-11
Publication date: 2015-10-14
Anticipated expiration: 2033-08-11
Also published as: CN103436468A

Abstract

本发明公开一种幽门螺杆菌快速生长添加剂，该快速生长添加剂制备用各组份以质量份表示如下：猪胃500份；牛肉500份；氯化钠7份；不溶性淀粉1份；尿素1份；纯净水适量；碳酸氢钠适量，调节pH值7.4～7.6。通过依次对原材料预处理、切块、两次煮沸、过滤、合并滤液冷藏、再煮沸、冷却，过滤，定容、加氯化钠、不溶性淀粉和尿素溶解、调节pH、灭菌、贮存。本发明的快速生长添加剂能够促使指示菌缩短体外培养时的延滞期时间，有效缩短指示菌在培养基上生长繁殖的时代时间，提高检测阳性率，供制备出优质的幽门螺杆菌分离培养基。该快速生长添加剂可采用本发明所披露的制备方法制备得到。

Description

一种幽门螺杆菌快速生长添加剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种快速生长添加剂，具体涉及一种用于制备优质幽门螺杆菌分离培养基的幽门螺杆菌快速生长添加剂及其制备方法。

背景技术

一般细菌的生长繁殖具有以下特征：

一、细菌的个体生长繁殖

细菌通常以简单的无性二分裂法繁殖，极个别的细菌可有分枝状分裂的方式。在适宜条件下，多数细菌繁殖速度很快，分裂一次仅需20～30min；少数细菌繁殖较慢，如结核杆菌约18～20h分裂一次。

二、细菌的群体生长繁殖

细菌繁殖很快，一般细菌以20min分裂一次，即一代。按此速度计算，经10h后，一个细菌将繁殖成2³⁰个菌，细菌群体将出现庞大至难以想象的程度。但由于细菌营养物质的耗竭，毒性产物的积累，经过一段时间后，细菌繁殖速度逐渐减慢，死亡菌数则不断增多，活菌增长率随之将趋于停滞至衰退。

经适宜的培养基上培养，细菌群体的生长繁殖一般可分为四期：

（1）、延滞期：

延滞期(0～a)──细菌数目保持不变或略有下降，倍增速率为零。

迟缓期：此时细菌尚未开始繁殖，只是为繁殖作准备。以菌种、菌龄与接种量和营养物的不同而异，迟缓期可从数小时至数天不等。

注：适应新的环境，合成新的酶，有时可见到接种群体大部分死亡，如果接种用的是饥饿的细菌或新的培养基的营养不丰富，则该时期延长。

加速生长期(a～b)──细菌开始增殖，倍增速率(世代时间的倒数，即单位时间内的分裂次数)随时间的延长，而使菌数增大。

（2）、对数期：

对数生长期(b～c)──倍增速率达到最大值，且保持垣定，它说明平均世代时间不变，细菌数目以几何级数增长。

细菌生长迅速，以恒定的速度进行分裂繁殖，通常菌数以几何级数增长。此时的细菌的形态、染色性、生理活性等较典型、对外界环境因素的作用也较为敏感。多数细菌约在培养18～24h左右。

注：其速率取决于培养基组分和环境因子。

减速生长期(c～d)──倍增速率随时间的延长而减少，平均世代时间也延长。

注：由于一种或多种底物的浓度成为限制因子，使倍增速率随之降低。

（3）、稳定期：稳定期(d～e)──生长速率与死亡速率相等，倍增速率为零，活菌数目保持垣定。

稳定期：对数期之后，细菌繁殖速度趋于下降，细菌死亡数则逐步上升，此期细菌繁殖数与死亡数几乎相等。是由于培养基上营养物质消耗，供不应求、毒性产物逐渐积聚，培养基pH下降等。细菌的代谢产物如抗生素、外毒素等，多在此期产生。芽孢也多在此期形成。

注：由于营养耗尽和有害代谢产物积累，细菌停止增殖，但菌体仍然存活，利用细胞内的能量储存物质维持生存。其些G^＋和许多真核微生物，在减速期后进入产孢期，其生存与产孢所需的能量也是由于对数期积累的能量物质所提供。

（4）、死亡期：

衰亡期：随着稳定期继续发展，细菌繁殖速度越来越慢、死亡越来多，活菌数急剧下降，死菌数明显超过活菌数，但细菌总数（包括活菌与死菌）并不减少。有些菌死亡后发生自溶，则细菌总数也可下降。

加速死亡期(e～f)──死亡速率超过生长速率，并越来越大，活菌数目迅速减少。

对数死亡期(f～g)──死亡速率超达到最大值，并保持恒定。

残留期(h～)──死亡速率降低，从理论上讲，只要培养基不干涸，少数细菌仍可活较长时间。

细菌的生长曲线在研究工作和生产实践中都有指导意义。但必须指出，上述生长曲线仅在体外人工培养的条件时能出现，并受培养基成分、pH值、培养温度等因素的影响。而细菌在人体或动物体内生长繁殖，并不存在这样典型的生长曲线。

细菌在培养基上有一个适应时间，即延滞期（(0～a)，一般需要2h，进入对数生长期后一般需要20min繁殖一代，同时个别弱小菌体存在生长不良的问题。为保证幽门螺杆菌检测，缩短幽门螺杆菌生长的世代时间，提高检测阳性率，制备优质幽门螺杆菌分离培养基，有必要在培养基中加入幽门螺杆菌快速生长添加剂。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种幽门螺杆菌快速生长添加剂，该添加剂能够缩短幽门螺杆菌生长的世代时间，提高检测阳性率，本发明还提供了该幽门螺杆菌快速生长添加剂的制备方法。

为解决以上技术问题，本发明研究了一种幽门螺杆菌快速生长添加剂，该快速生长添加剂以猪胃、牛肉为原材料，加纯净水煮沸，滤液中添加氯化钠、不溶性淀粉和尿素制备得到，制备用各组份以质量份表示如下：

猪胃 500份；

牛肉 500份；

氯化钠 7份；

不溶性淀粉 1份；

尿素 1份；

纯净水适量；

碳酸氢钠适量，调节pH值7.4～7.6。

进一步地，所述猪胃、牛肉采用新鲜所得或使用前贮存在4～8℃环境中≤8h。

进一步地，所述纯净水pH值5.0～7.0，电导率≤5.0μs/cm。

进一步地，所述不溶性淀粉为干燥玉米去皮，研磨成细颗粒，再用100目细筛过筛后所得。

前述幽门螺杆菌快速生长添加剂的制备方法，其特征在于该制备方法包括如下步骤：

（1）、将作为原材料的猪胃和牛肉进行预处理，并切成小块；

（2）、将步骤（1）切成小块的原材料与质量为原材料两倍量的纯净水混合，加热煮沸1h后过滤，收集滤液A；

（3）、将步骤（2）所得滤渣与质量为原材料一倍量的纯净水混合，加热煮沸1h后过滤，收集滤液B；

（4）、将步骤（2）与步骤（3）所得的滤液A和滤液B混合，并置于4℃环境中过夜，然后刮掉油脂，过滤，得新的滤液C；

（5）、将步骤（4）所得的滤液C加热煮沸使其质量浓缩至原材料量；

（6）、将步骤（5）煮沸的滤液C冷却至50-60℃，过滤，收集滤液D，并加纯净水补充至每毫升滤液中含有猪胃和牛肉各0.5克；

（7）、加入氯化钠、不溶性淀粉和尿素，搅拌溶解；

（8）、用碳酸氢钠调节pH值7.4～7.6；

（9）、灭菌处理，冷却，得幽门螺杆菌快速生长添加剂。

进一步地，步骤（1）所述预处理包括依次对猪胃、牛肉原材料用自来水漂洗干净、去筋、去膜、去油脂，再依次用自来水浸泡、漂洗干净，然后滤掉水份，晾干。

进一步地，步骤（2）和步骤（3）采用纱布过滤；步骤（4）和步骤（6）采用棉花过滤。

进一步地，步骤（9）所述灭菌处理为将步骤（8）所得的液体分装，然后置于压力蒸汽灭菌器内，121℃条件下灭菌20min。

进一步地，所得幽门螺杆菌快速生长添加剂置于0～4℃环境中贮存。

本发明的快速生长添加剂能够促使指示菌缩短体外培养时的延滞期时间，可以从2h缩短到1h，有效缩短指示菌在培养基上生长繁殖的时代时间，使世代时间小于20min，提高检测阳性率，促使弱小菌体生长良好，供制备出优质的幽门螺杆菌分离培养基。该快速生长添加剂可采用本发明所披露的制备方法制备得到。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

本发明的实施例1：

一、幽门螺杆菌快速生长添加剂的制备：

（1）、取500g猪胃、500g牛肉作为原材料，用自来水漂洗干净、去筋、去膜、去油脂，再依次用自来水浸泡、漂洗干净，然后滤掉水份，晾干，并切成1 cm³大小的小块，其中原材料要求色泽鲜艳、新鲜、无异味、无油脂，采用新鲜所得，如果未能及时使用，则可以贮存于4～8℃环境中不超过8小时以实现保鲜，一般为4～8小时；

（2）、将步骤（1）切成小块的原材料置于大桶内，加入质量为原材料两倍量的纯净水混合，加热煮沸1h后用纱布过滤，收集滤液A；

（3）、将步骤（2）所得滤渣置于大桶内，加入质量为原材料一倍量的纯净水混合，加热煮沸1h后用纱布过滤，收集滤液B；

（4）、将步骤（2）与步骤（3）所得的滤液A和滤液B混合，并置于4℃环境中过夜，然后刮掉油脂，立即用棉花过滤，得新的滤液C；

（5）、将步骤（4）所得的滤液C置于大桶内，加热煮沸使其质量浓缩至原材料量；

（6）、将步骤（5）煮沸的滤液C冷却至50-60℃，用棉花过滤，收集滤液D，并加纯净水补充至每毫升滤液中含有猪胃和牛肉各0.5克；

（7）、加入7g氯化钠、1g不溶性淀粉（由干燥玉米去皮，研磨成细颗粒，再用100目细筛过筛后所得。）和1g尿素，用玻璃棒搅拌溶解；

（8）、用1%（质量）的碳酸氢钠调节pH值7.4～7.6；

（9）、分装步骤（8）所得液体，100ml/瓶，然后置于压力蒸汽灭菌器内，121℃条件下灭菌处理20min，冷却后取出，得幽门螺杆菌快速生长添加剂，置于0～4℃环境中贮存，备用。

拿起装有所述幽门螺杆菌快速生长添加剂的瓶子，对着光线，轻轻摇动，用肉眼观察外观，要求外观呈淡黄色粘液状液体，无颗粒杂质。用酸度计测定pH值为7.4～7.6。

以上制备过程所用的纯净水的酸碱度pH值5.0～7.0，电导率≤5.0μs/cm。

二、促生长试验：

1、材料

（1）、指示菌：金黄色葡萄球菌 ATCC 25923。说明：ATCC为美国菌种保藏中心，即美国模式培养物集存库(American type culture collection)的简写，ATCC所给的菌株编号为25923，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）以及中国典型微生物保藏中心（CCTCC）等我国保藏单位均有售。

（2）、培养基：营养肉汤培养基（采用市售）；

营养琼脂（采用市售）。

（3）、试剂：0.85%（质量）盐水（经灭菌处理）；

（4）、器材：15mm×150mm试管若干（经灭菌处理）；

1ml和10ml的移液管若干（经灭菌处理）；

平皿（经灭菌处理）。

（5）、试验培养基制备：取90毫升营养肉汤培养基，置于100毫升三角烧瓶内，加入10毫升本发明制备的快速生长添加剂，充分混匀，分装于试管，每支9毫升，121℃灭菌20min。

（6）、对照培养基制备：100毫升营养肉汤培养基，分装于试管，每支9毫升，121℃灭菌20min。

2、方法：

（1）、菌悬液制备计数：

A、用接种环，挑取金黄色葡萄球菌菌种，接种到营养琼脂平板上，作分离。

B、平板置于36℃培养箱中，培养18小时。

C、用接种环挑取二只直径为1.5毫米的金黄色葡萄球菌菌落，置于2毫升的灭菌0.85%（质量）盐水中，用接种环研磨成菌悬液。

D、取灭菌试管6支，每支试管中加入灭菌0.85%（质量）盐水9毫升。

E、用灭菌1毫升移液管，吸取菌悬液1毫升，加入第1支试管中，稀释度为10^-1。

F、另取1支灭菌1毫升移液管，吹打第1支试管中的液体，使其充分混匀，吸取1毫升混和的菌悬液，置于第2支试管中，稀释度为10^-2。

G、另取1支灭菌1毫升移液管，吹打第2支试管中的液体，使其充分混匀，吸取1毫升混和的菌悬液，置于第3支试管中，稀释度为10^-3。

H、依上述过程类推，用同样的方法，直至将菌悬液稀释为10^-6。

I、另取1支灭菌1毫升移液管，吸取1毫升稀释度为10^-6的混和菌悬液，置于灭菌平皿中，共4只灭菌平皿。

J、每只灭菌平皿中，倾注入已熔化、并冷却到42～45℃的营养琼脂18～20ml，充分混匀。凝固后，置于36℃培养箱中，培养18小时。

K、取出，计数。

结果：85、83、82、82。

得到平均为83cfu/皿，其中，cfu为菌落形成单位（Colony-Forming Units）。

菌悬液菌量为8.3×10⁷cfu/ml。

（2）、促生长试验

A、取试验培养基和对照培养基各6支试管，每支试管中放9ml试验培养基或对照培养基，再分别加入按前述菌悬液制备计数中所述稀释方法得到的稀释度为10^-5菌悬液各1毫升，得到稀释度为10^-6菌悬液。

B、将试管置于36℃培养箱中，培养2小时。

C、用灭菌1毫升移液管，从各试管中吸取培养2小时的菌悬液1毫升，各置于一个灭菌平皿中，每只平皿中分别倾注入已熔化、并冷却到42～45℃的营养琼脂18～20ml，充分混匀。凝固后，置于36℃培养箱中，培养18小时。

D、取出，计数。

结果：

试验培养基菌落数：106、102、110、109、105、108。平均为：106.67cfu/皿。

对照培养基菌落数：69、66、64、63、70、68。平均为：66.67 cfu/皿。

E、将试管继续在36℃培养箱中，培养6小时。

F、取出，按菌悬液制备计数中步骤D～K的方法进行计数。

G、稀释度为10^-6的计数结果：

试验培养基：29、30、28、27、31、28。平均为：28.83。

对照培养基：16、18、17、16、15、18。平均为：16.67。

（3）统计分析（根据卫生统计学中两个样本均数比较的方差分析，从分析的结果可以看到总变异、组内变异、组间变异等三种变异，分析两个样本的差异。）：

A、培养2小时结果分析。

表1：培养基菌落形成单位数

表1中：X表示菌落形成单位数，N表示试管数。

根据表1中的数据分析结果如下：

F_0.05=4.96 58.07＞4.96 有显著差异。

总变异=ΣN-1=12-1=11

R组间=K-1=2-1=1

R组内=ΣN-K=11-1=10

B、培养8小时结果分析。

表2：培养基菌落形成单位数

表2中：X表示菌落形成单位数，N表示试管数。

根据表2中的数据分析结果如下：

F_0.05=4.96 11.11＞4.96 有显著差异。

3、结论：

用8.3×10²cfu/ml的金黄色葡萄球菌菌悬液1ml，分别加入试验培养基(含有10%快速生长添加剂的肉汤培养基)和对照培养基(不含快速生长添加剂的肉汤培养基)，使成菌浓度为83cfu/ml。

实验结果表明：在36℃培养箱中培养2小时，吸取培养液进行计数，平均结果为对照培养基66.67cfu/ml和试验培养基106.67cfu/ml。经显著性检验，F值为58.07，有显著差异。

继续在36℃培养箱中培养6小时（即培育总时间为8小时），吸取培养液进行计数，进行10^-6稀释，平均结果为16.67cfu/ml和28.83cfu/ml。经显著性检验，F值为11.11，有显著差异。

快速生长添加剂具有促使指示菌在体外培养时，缩短延滞期时间和指示菌在培养基上生长繁殖的世代时间，达到快速生长的目的。

4、无菌试验：

取已灭菌的快速生长添加剂4瓶，分别置于25℃、37℃、43℃、54℃环境中孵育7天，每天观察一次，液体保持清晰为合格，可供实验检测使用，若发生混浊为不合格。

上述的具体实施方式只是示例性的，是为了更好的使本领域技术人员能够理解本发明，不能理解为是对本发明保护范围的限制；只要是根据本发明所揭示精神所作出的任何等同变更或修饰，均落入本发明保护的范围。

Claims

1. 一种幽门螺杆菌快速生长添加剂，其特征在于该快速生长添加剂以猪胃、牛肉为原材料，加纯净水煮沸，滤液中添加氯化钠、不溶性淀粉和尿素制备得到，制备用各组份以质量份表示如下：

猪胃 500份；

牛肉 500份；

氯化钠 7份；

不溶性淀粉 1份；

尿素 1份；

纯净水适量；

碳酸氢钠适量，调节pH值7.4～7.6；

所述添加剂按照如下步骤制备得到：

（2）、将步骤（1）切成小块的原材料与质量为原材料两倍量的纯净水混合，加热煮沸1～1.5h后过滤，收集滤液A；

（3）、将步骤（2）所得滤渣与质量为原材料一倍量的纯净水混合，加热煮沸1～1.5h后过滤，收集滤液B；

（5）、将步骤（4）所得的滤液C加热煮沸，使其质量浓缩至原材料量；

（6）、将步骤（5）经浓缩的滤液C冷却至50-60℃，过滤，收集滤液D，并加纯净水补充至每毫升滤液中含有猪胃和牛肉各0.5克；

（7）、加入氯化钠、不溶性淀粉和尿素，搅拌溶解；

（8）、用碳酸氢钠调节pH值7.4～7.6；

（9）、灭菌处理，冷却，得幽门螺杆菌快速生长添加剂；

步骤（2）和步骤（3）采用纱布过滤；步骤（4）和步骤（6）采用棉花过滤。

2.根据权利要求1所述的幽门螺杆菌快速生长添加剂，其特征在于：所述猪胃、牛肉采用新鲜所得或使用前贮存在4～8℃环境中≤8h。

3.根据权利要求1所述的幽门螺杆菌快速生长添加剂，其特征在于：所述纯净水pH值5.0～7.0，电导率≤5.0μs/cm。

4.根据权利要求1所述的幽门螺杆菌快速生长添加剂，其特征在于：所述不溶性淀粉为干燥玉米去皮，研磨成细颗粒，再用100目细筛过筛后所得。

5.根据权利要求1所述的幽门螺杆菌快速生长添加剂，其特征在于：步骤（1）所述预处理包括依次对猪胃、牛肉原材料用自来水漂洗干净、去筋、去膜、去油脂，再依次用自来水浸泡、漂洗干净，然后滤掉水份，晾干。

6.根据权利要求1所述的幽门螺杆菌快速生长添加剂，其特征在于：步骤（9）所述灭菌处理为将步骤（8）所得的液体分装，然后置于压力蒸汽灭菌器内，121℃条件下灭菌20min。

7.根据权利要求1所述的幽门螺杆菌快速生长添加剂，其特征在于：所得幽门螺杆菌快速生长添加剂置于0～4℃环境中贮存。