CN104694422A - 分离获得的菠萝泛菌hyl01菌株及其在促进西瓜根系生长中的应用 - Google Patents

分离获得的菠萝泛菌hyl01菌株及其在促进西瓜根系生长中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株经分离获得的菠萝泛菌HYL01菌株及其在促进西瓜根系生长中的应用。本发明的一株经分离获得的菠萝泛菌(Pantoea ananatis)菌株，命名为菠萝泛菌HYL01，保藏在中国典型培养物保藏中心，地址在武汉大学，其微生物保藏号是CCTCC NO.M 2014530，保藏日期为2014年10月29日。研究结果表明，菌株HYL01具有较强的溶磷能力，溶解Ca3(PO4)3的有效量为140.26mg/L，同时还具有分泌IAA的能力，IAA最大分泌量11.39mg/L。HYL01菌剂施用后，能够显著促进西瓜幼苗的总根长、根表面积、根体积以及比根长的增长，并且显著增加了根系直径为大于0至小于等于0.5mm范围内的西瓜幼苗毛根根长所占的比例，因此，本发明获得的一株经分离获得的菠萝泛菌菌株HYL01具有制备促进西瓜根系生长的复合微生物菌肥的潜力。

Description

分离获得的菠萝泛菌HYL01菌株及其在促进西瓜根系生长中的应用
技术领域
本发明涉及一株溶磷菌，特别涉及一株具有生长素(IAA)合成能力的菠萝泛菌(Pantoea ananatis)，还涉及该菌株在促进西瓜根系生长中的应用。本发明属于微生物技术领域。
背景技术
磷是植物生长所必需的大量营养元素之一，但土壤中磷多与Ca2+、Fe3+、Fe2+、Al3+结合形成难溶性磷酸盐，只有小部分可被植物吸收利用，这导致了耕地土壤普遍存在缺磷现象(Taurian T，Anzuay M S，Angelini J G，et al.Phosphate-solubilizing peanut associated bacteria：screening for plant growth-promoting activities[J].Plant and soil,2010，329(1-2)：421-431.)。土壤溶磷微生物可将植物不能吸收利用的固定态磷转化为可吸收的有效磷，供植物吸收利用，促进植物根系生长，改善根系组成，从而增加作物产量，减少化学肥料投入。因此，开展土壤溶磷菌的理论与应用研究能够有效提高土壤中难溶态磷的有效性和利用率，降低化学肥料施用量，对于我国农业的可持续发展具有重大意义。
西瓜作为人们所熟知的水果，近些年来种植面积不断扩大。如何在有限的土地上获得更高产量，并且减少由于使用化肥所导致的成本高、土壤养分比例失调等一系列经济以及环境污染问题，是当前农业发展面临的重要课题，而微生物菌肥技术就是最有效的方法之一，溶磷菌则是复合微生物菌肥的重要组成部分。
针对目前存在的问题，本发明开展了溶磷菌筛选与鉴定工作，通过盆栽实验研究溶磷菌对西瓜幼苗根系生长的促生效应，为研制和推广微生物肥料、提高作物产量提供理论基础与技术支持。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种具有提高土壤中磷元素的植物利用率，促进植物生长且具有生长素(IAA)合成能力的的溶磷菌，以及该菌株在在促进西瓜根系生长中的应用。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明利用选择性培养基，在黑土区植物根际分离纯化具有溶磷能力的菌株，鉴定并进一步研究了它们对西瓜幼苗根系的影响。结果表明，在获得的7株具有溶磷能力的菌株中，菌株HYL01具有较强的溶磷能力，经鉴定属于菠萝泛菌(Pantoea ananatis)，该菌株溶解Ca3(PO4)3的有效量为140.26mg/L，溶磷量与pH值相关性为-0.743，IAA最大分泌量11.39mg/L，菌剂施用后，应用组比对照组西瓜幼苗的总根长、根表面积、根体积和比根长的增加量分别为44.38％、7.58％、63.65％和16.32％，并且显著增加了根系直径为大于0至小于等于0.5mm范围内的西瓜幼苗毛根根长所占的比例。因此，新分离鉴定的菠萝泛菌HYL01(Pantoea ananatis HYL01)具有较高的溶解无机磷能力，对西瓜幼苗根系生长具有促进作用，能够有效提升细根所占比例，具有制备促进西瓜根系生长的复合微生物菌肥的潜力。
本发明的一株经分离获得的菠萝泛菌(Pantoea ananatis)菌株，命名为菠萝泛菌HYL01(Pantoeaananatis sp.HYL01)，分类命名为菠萝泛菌(Pantoea ananatis)，保藏在中国典型培养物保藏中心，地址在武汉大学，其微生物保藏号是CCTCC NO.M 2014530，保藏日期为2014年10月29日。
进一步的，本发明还提出了所述的菠萝泛菌菌株在促进西瓜根系生长中的应用。
其中，所述的促进西瓜根系生长包括促进西瓜的根长、根表面积、根体积、比根长以及根系直径为大于0至小于等于0.5mm范围内的西瓜幼苗毛根根长所占的比例。
相较于现有技术，本发明的优势在于：
1、溶磷能力强 
研究表明，菠萝泛菌HYL01(Pantoeaananatis sp.HYL01)菌株溶磷最大值为140.26mg/L，刘红雪等(刘雪红，张丽燕，范延辉，等.沾化冬枣根际解无机磷细菌的分离、鉴定及其在土壤中溶磷效果的研究[J].华北农学报，2013，(3)：204-209.)从沾化冬枣根际土壤分离出的一株土壤杆菌属溶磷菌溶解Ca3(PO4)3量为89.41mg/L，HYL01号菌株溶磷量是它的1.57倍。李显刚等(李显刚，姚拓，王小利，等.一株分离自葛藤根际高效溶磷细菌特性研究及菌株鉴定[J].中国土壤与肥料，2012，(2)：87-91.)从葛藤根际分离出的肠杆菌溶解Ca3(PO4)3量为138.72mg/L，刘文干等(刘文干，何园球，张坤，等.一株红壤溶磷菌的分离、鉴定及溶磷特性 [J].微生物学报，2012，52(3)：326-333.)从红壤分离出的洋葱伯克霍尔德氏菌溶解Ca3(PO4)3量为125.79mg/L，二者溶磷量都略低于本发明筛选出的溶磷菌。
2、分泌IAA的能力
菠萝泛菌HYL01(Pantoeaananatis sp.HYL01)菌株还具有分泌IAA的能力，最大分泌量为11.39mg/L，其分泌的IAA具有促进植物生长发育的作用，在农业具有广泛应用。
3、较强的促进西瓜根系生长的能力
植物生长过程中所需的营养大部分由根系从土壤中吸收，发达的根系可以使西瓜在生长过程中获取和利用土壤资源的能力得到提高，极大的促进西瓜果实的质量产量。实验表明使用菠萝泛菌HYL01进行盆栽实验时，与对照组相比，施用溶磷菌HYL01能够明显促进西瓜幼苗根系的总长度和体积的增长，增加量分别为44.38％和63.65％，对根系表面积、比根长也有一定程度的促进，增加量分别为7.58％、16.32％。西瓜幼苗的根长在根系直径为大于0至小于等于0.5mm范围内的比例显著增加，在直径为1.0-1.5mm、1.5-2mm、2.0-2.5mm、2.5-3.0mm范围内的比例下降，其中根系直径在1.5-2mm范围内的比例显著下降。
综上所述，接种本发明分离得到的菠萝泛菌HYL01可以对西瓜幼苗根系的生长起到促进作用，改善根系组成，提高根系吸收养分和水分的能力，从而进一步表现为对西瓜的促生作用。
附图说明
图1为菠萝泛菌HYL01菌株形态特征(a)及系统进化树(b)；
图2为菠萝泛菌HYL01的生长曲线；
图3为培养液接菌后水溶性磷含量和pH值的变化；
图4为IAA的测定结果；
图5为西瓜根系扫描形态；
a:对照；b:HYL01菌株处理； 
图6为菠萝泛菌HYL01对西瓜幼苗根系总长度(a)，根表面积(b)，根体积(c)的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随具体实施例的描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明精神和范围下可以对本发明的技术方案和细节形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明保护的范围内。
实施例1菠萝泛菌HYL01(Pantoea ananatis HYL01)菌株的分离、鉴定以及在促进西瓜根系生长中的应用
1材料与方法 
1.1培养基
PKO无机培养基(1L)：葡萄糖10.0g，(NH4)2SO40.5g，MgSO4·7H2O 0.3g，NaCl 0.3g，KCl 0.3g，FeSO4·7H2O 0.036g，MnSO4·H2O 0.03g，Ca3(PO4)32.0g，琼脂20g，蒸馏水定容至1000ml，液体培养基不加琼脂。
1.2溶磷菌株的纯化与筛选
于2014年3月采集于黑龙江省齐齐哈尔市禾本科作物的植物根际土壤，采用抖土法收集根表面土壤，放入无菌袋中，于4℃冰箱内保存备用。分别称取根系混合土壤1g，按无菌操作投入装有9ml无菌水和8粒无菌玻璃珠的250ml三角瓶中，置恒温振荡器中，在25℃、170r/min条件下振荡20min得到10％(10-1)浓度的土壤悬液，进行浓度梯度稀释，分别得到10-4、10-5、10-6浓度的土壤悬液。分别吸取不同梯度的土壤悬液0.1ml涂布到固体PKO培养基中。每个梯度设定3组平行，存放于28℃恒温箱内培养5d，挑取具有溶磷圈的单菌落进行纯化。
将纯化后的菌株使用灭菌牙签分别点植于平板上，在28℃培养箱中培养10d，测量溶磷圈直径(D)和菌落直径(d)，根据D/d值比较各菌株溶磷能力(Hettiarachchi R P，Dharmakeerthi R S，Seneviratne G，et al.Phosphate solubilizing bacteria and fungi isolated from rubber(Hevea brasiliensis)root rhizosphere,their biofilm formation and phosphate solubilizing abilities[C].Proceedings of international forestry and environment symposium.2014，18；李蓉，周德明，吴毅，等.杉木根际溶磷菌筛选及其部分特性的初步研究[J].中南林业科技大学学报，2012，32(4)：95-99)，筛选出溶磷能力较高的菌株。
1.3菌株鉴定与生长曲线测定
对筛选菌株进行形态和16S rDNA分类鉴定，采用Mega 5.0制作进化树。挑取筛选菌株单菌落接种于100ml液体PKO培养基中，28℃，120r/min摇瓶培养，每4h测定吸光值(OD600nm)，制作菌株生长曲线。
1.4溶磷菌株的溶磷能力测定
1.4.1磷含量标准曲线的绘制
分别将2μg/ml的磷标准液以0.0ml、0.5ml、1.0ml、3.0ml、5.0ml、10.0ml加入25ml的比色管中，超纯水定容至25ml，得到含磷量为0.00μg/ml、0.04μg/ml、0.08μg/ml、0.24μg/ml、0.40μg/ml、0.80μg/ml、1.20μg/ml标准液。在室温下加入钼锑抗显色剂，显色时间20min，测得吸光值并制作标准曲线。测定标准曲线为y＝0.5256x+0.0359，相关系数R2＝0.99。
1.4.2溶磷能力测定 
将筛选菌株单菌落接入液体PKO培养基制作种子液，培养4d后按1％的接种量接入液体PKO培养基，在28℃、120r/min的摇床中进行培养。每隔24h取5ml菌悬液在4000r/min下离心20min，取上清液0.25ml稀释100倍定容至25ml，通过钼锑抗比色法(Wang J B，Chen Z H，Chen L J，et al.Surface soil phosphorus and phosphatase activities affected by tillage and crop residue input amounts[J].Plant,Soil and Environment，2011，57(6)：251-257.)进行溶磷能力的测定，同时测定pH值。每个处理均以无菌液体培养基作为对照，并用接菌培养基含磷浓度减去对照磷浓度，计算细菌的溶磷能力。
1.5IAA分泌量测定 
1.5.1IAA标准曲线测定 
标准曲线采用分析纯IAA进行制备，将50μg/ml的IAA标准液梯度稀释为0μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml，测定标曲，得到标准曲线为y＝0.0115x+0.003，相关系数R2＝0.9934。
1.5.2植物生长素分泌定量测定
将筛选菌株制作种子液，按1％的接种量接入含有200mg/L色氨酸的液体蒙金娜培养基中，在28℃、120r/min的摇床中进行培养，采用Salkowski显色法测量IAA量。
1.6溶磷菌株对西瓜幼苗的影响
1.6.1菌悬液的制备 
筛选菌株接入PKO液体培养基中，培养到一定浓度(OD600＝0.5)后备用。
1.6.2培养与测定 
土壤取自齐齐哈尔大学生物园，供试土壤的理化性质为有机质含量24.59g/kg、土壤速效磷含量146.46mg/kg、土壤pH值6.69、EC 0.74ms/cm。待种西瓜种子使用0.1％的升汞消毒10min，再用无菌水清洗5次。将种子播种于灭菌土中，每盆播种3枚种子，用无菌水与菌悬液分别浇灌，以浇灌无菌水的种子作为对照组(CK)，浇灌菌悬液的种子为实验组(实验组使用菌悬液只浇灌一次，每盆30ml，之后用无菌水浇灌)，做三组平行，置于智能人工气候箱内培养(28℃/光照12h，18℃/黑暗12h，湿度为60％)。培养30d，采用根系分析仪(LA-S2400)扫描根长度、根体积、根表面积，测量根系直径分别在0-0.5mm、0.5-1.0mm、1.0-1.5mm、1.5-2mm、2-2.5mm、2.5-3mm范围内的根长，烘干后称量根系干重，由总根长和总干重的比值得到西瓜幼苗的比根长。
2结果与分析 
2.1溶磷菌株的筛选
通过表1可知，分离纯化得到7株溶磷菌，其中HYL01的D/d＝1.52±0.08，优势明显高于其它菌株，因此选择其进行之后的各项检测。
表1 HYL01溶磷圈比值
2.2菌株的鉴定 
通过观察可知HYL01菌落为圆形菌落，黄色，不透明，表面光滑湿润，菌落扁平，边缘较圆滑，G-。经由电镜观察菌种细胞，细胞形态为杆状(图1a)，大小为0.6-0.8μm×3.8-4.2μm。HYL01号菌株16S rDNA序列在NCBI上的序列号为KM 27311，并在NCBI中进行blast比对，并制作系统发育进化树(图1b)，结果显示同源性最高的八种菌均为菠萝泛菌(Pantoea ananatis)，同源性高达100％，结合菌株的群体和个体形态特征，确定HYL01号菌株为菠萝泛菌(Pantoea ananatis)。
所述的菠萝泛菌HYL01，保藏在中国典型培养物保藏中心，地址在武汉大学，其微生物保藏号是CCTCC NO.M 2014530，保藏日期为2014年10月29日。
2.3菠萝泛菌HYL01菌株生长曲线和溶磷能力
由图2可知，HYL01号菌株0h﹣16h为延滞期，此时细菌生长缓慢。16h﹣28h为对数期，菌株迅速生长并在28h时达到最大浓度。28h﹣44h为稳定期，此时细菌浓度趋于稳定，在最大浓度上下波动。
通过图3可知，HYL01号菌株培养0h时培养基磷含量为最低值，pH值为最高值，此时磷含量和pH值为培养基原始量。菌株培养0h﹣48h时培养基磷含量不断增加并达到最高点，同时pH值降低到最低点，培养24h时培养基磷含量增加幅度最大，增加量约80.00mg/L，培养48h时磷含量达到最大值177.34mg/L，总增加量为140.26mg/L。HYL01号菌株培养48h﹣96h时培养基磷含量降低并趋于稳定，同时pH升高并趋于稳定。可以看出磷含量与pH值存在一定的负相关性，通过比对其相关性为-0.743。此结果与李玉娥等(李玉娥，姚拓，朱颖，等.兰州地区苜蓿和红豆草根际溶磷菌筛选及菌株部分特性研究[J].中国草地学报，2009，31(1)：45-51.)研究表明溶磷量与培养基pH值存在显著相关性的结果相一致。
2.4菠萝泛菌HYL01号菌株IAA分泌量测定 
通过Salkowski显色法于OD530时对HYL01号菌株进行IAA分泌量测定，在不同时间段对菌液进行测定。如图4可知在4d时HYL01号菌株分泌IAA的量达到最大值，分泌量为11.39mg/L。
2.5菠萝泛菌HYL01对西瓜幼苗根系生长的影响
2.5.1菠萝泛菌HYL01对西瓜幼苗根系形态的影响
对西瓜幼苗根系进行扫描，通过对根长、根表面积等各项数据的测量与分析，检测菠萝泛菌HYL01对西瓜幼苗根系的影响，由图5可以看出经过HYL01号菌株处理后的西瓜幼苗根系(图5b)相较于对照组(图5a)而言，主根长度显著提升，使其获取纵向土壤中水和养分的能力得到了增加；根系形态分布具有更好的延展性，使其获取横向土壤中水和养分的能力得到了增加；毛细根数量显著增大，改善了根系组成提升了营养物质吸收的质与量。
2.5.2菠萝泛菌HYL01对西瓜幼苗总根长、根表面积以及根体积的影响
由图6可知经过HYL01号菌株处理过的西瓜幼苗的根长、根体积、根表面较对照组而言出现了明显的变化。总根长、根体积与对照组相比分别增加了44.38％、63.65％，且差异极显著(P<0.01)，根表面积增加量为7.58％，无显著性差异。经 HYL01号菌株处理过的西瓜幼苗在根长、根表面积、根体积上均有不同程度的提升，对根系形态的优化作用明显。
2.5.3菠萝泛菌HYL01对西瓜幼苗的比根长和根系直径分级组成的影响
由表2可知，经过HYL01号菌株处理过的西瓜幼苗，在根系直径为大于0至小于等于0.5mm范围内的根长比例与对照组相比显著增加(P<0.05)，根系直径为1.5-2mm范围内的根长比例显著降低(P<0.05)，其他根系直径范围内的根长比例相比于对照组也有一定程度的降低，但结果不显著。由此可知经处理后的西瓜幼苗在根系组成上正向细根优势不断发展。同时经HYL01菌株处理后的西瓜幼苗比根长较对照组也有一定的提高，提高量为16.32％。由此可以看出HYL01号菌株对根系组成具有有良好的提升作用。
表2 菌株HYL01对西瓜幼苗根系在不同直径范围内根长百分比及比根长的影响
综上，本发明对分离得到的菠萝泛菌HYL01(Pantoeaananatis sp.HYL01)进行了鉴定，其在液体培养基内对Ca3(PO4)3的最大溶磷量为140.26ml/L，溶磷能力较高，能够分泌IAA，最大分泌量为11.39mg/L，显著提高了西瓜幼苗的总根长、根体积，优化了西瓜幼苗的根系形态，显著提升了根系直径为大于0至小于等于0.5mm范围内的根长比例，显著降低了根系直径为1.5-2mm范围内的根长比例，增加了毛细根的数量，改善了西瓜幼苗的根系组成，并且促进了西瓜根系的比根长度增加，具备制备微生物菌肥的潜力。

Claims (3)

1.一株经分离获得的菠萝泛菌(Pantoea ananatis)菌株，命名为菠萝泛菌HYL01，保藏在中国典型培养物保藏中心，地址在武汉大学，其微生物保藏号是CCTCC NO.M 2014530，保藏日期为2014年10月29日。
2.权利要求1所述的菠萝泛菌菌株在促进西瓜根系生长中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的促进西瓜根系生长包括促进西瓜的根长、根表面积、根体积、比根长以及根系直径为大于0至小于等于0.5mm范围内的西瓜幼苗毛根根长所占的比例。
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