CN101569255B - 检测兰科植物种子生活力的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的是提供一种检测兰科植物种子生活力的方法。本发明提供的检测兰科植物种子生活力的方法，是将次氯酸钙溶液处理过的兰科植物种子清洗并用2，3，5-氯化三苯基四氮唑磷酸盐缓冲溶液染色后统计兰科植物种子胚的染色百分率，得到兰科植物种子的生活力。本发明所提供的兰科植物种子生活力检测方法克服了因兰科植物种子小，染色测定时不易操作，不易观察以及难于统计的技术难题，且具有操作方便、快速、省时省力的特点。本方法具有重要的经济和应用推广价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测兰科植物种子生活力的方法。
背景技术
兰科植物约含有800属，25000种，广布于热带、亚热带和温带，主产南美和亚洲热带。我国有166属1000多种，主要分布在江南各省，以广东、海南、云南和台湾居多。兰科植物是一个特殊的植物类群，是被子植物中最为进化的科之一。其中白芨、天麻等可药用；少数可作香料植物，如香子兰等；而大多数种类色彩艳丽、花期长，可作为名贵的观赏植物，具有很高的商业价值。
在我国列入重点保护的1300种濒危植物中，兰科植物占了1200余种，达90％以上。兰科植物濒危的原因之一是因为自然条件下种子萌发困难，萌发率非常低，一般不超过5％。为了满足日益增长的兰花市场需求，人们开始收集种子资源，采用种子非共生萌发技术栽培兰花。
在兰花种子贮藏、种质资源长期保存和非共生萌发过程中，兰科植物种子生活力的测定是一项关键技术。兰科植物的种子非常小，一个蒴果中有几万到上百万粒种子，呈粉尘状，生活力测定操作困难。目前兰科植物种子生活力的测定大多采用萌发的方法；由于兰科植物种子由胚和种皮组成，无胚乳，因而此方法在共生和非共生萌发条件下都需要外源营养物质，萌发困难并且萌发周期长(大多数兰科植物种子的非共生萌发时间需要90天以上)，不能快速和有效地测定种子生活力。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测兰科植物种子生活力的方法。
检测兰科植物种子生活力的方法，包含有如下步骤：
1)用次氯酸钙[Ca(ClO)2]溶液处理兰科植物种子；
2)将处理过的兰科植物种子用2，3，5-氯化三苯基四氮唑磷酸盐缓冲溶液染色后统计兰科植物种子胚的染色百分率，得到兰科植物种子的生活力。
次氯酸钙在此方法中的作用是：使种皮的颜色变浅，便于染色后的观察；协助2，3，5-氯化三苯基四氮唑溶液透过种皮；同时，还具有灭菌的功能。
所述2，3，5-氯化三苯基四氮唑磷酸盐缓冲溶液的溶剂为磷酸盐缓冲液。
所述Ca(ClO)2溶液的浓度可为2.5％-10％(质量百分含量)，优选可为5％(质量百分含量)；所述处理时间可为15min-60min，优选可为30min。
所述2，3，5-氯化三苯基四氮唑磷酸盐缓冲溶液的浓度可为0.5％-2％(质量百分含量)，优选可为1％(质量百分含量)；所述染色时间为9h-24h，优选可为12h；所述染色温度为25℃-40℃，优选可为30℃。
所述兰科植物种子可为五唇兰属(Doritis)植物种子，可优选为五唇兰(Doritis pulcherrima Lindl.)植物种子。
所述兰科植物种子可为石斛属(Dendrobium)植物种子，可优选为束花石斛(Dendrobium chrysanthum Wall.et Lindl.)植物种子。
本发明所提供的兰科植物种子生活力检测方法克服了因兰科植物种子小，染色测定时不易操作，不易观察以及难于统计的技术难题，且具有操作方便、快速、省时省力的特点。本方法具有重要的经济和应用推广价值。
具体实施方式
实施例以五唇兰(Doritis pulcherrima Lindl.)和束花石斛(Dendrobiumchrysanthum Wall.et Lindl.)的种子为实验材料说明本发明的方法。五唇兰种子和束花石斛种子均采自海南省霸王岭国家自然保护区，也可以向中国西南野生生物种质资源库索取。
实施例中所述的2，3，5-氯化三苯基四氮唑磷酸盐缓冲液是以磷酸盐缓冲液为溶剂配制的，其中，磷酸盐缓冲液的配制方法如下：
(1)配制母液I：称取实施例所需的磷酸二氢钾(KH2PO4)，用蒸馏水定容至1000ml；
(2)配制母液II：称取实施例所需的磷酸氢二钠(Na2HPO4)或二水磷酸氢二钠Na2HPO4·2H2O，用蒸馏水定容至1000ml；
(3)将2份母液I和3份母液II混合，用1mol/L NaOH调节pH值至7.0，得到1/15mol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液。
所用磷酸盐缓冲液的种类和浓度包括但不限于以上所述的磷酸盐缓冲液，并以本发明提供的方法为最佳。
种子的生活力＝胚被染上红色的种子/所检测的种子×100％。
实施例1、五唇兰种子预处理及染色条件的优化实验
实验一、次氯酸钙处理五唇兰种子不同时间的染色效果比较
本实验用5％质量百分含量的Ca(ClO)2溶液分别预处理五唇兰种子15、30、60、90、120min；采用1％质量百分含量的2，3，5-氯化三苯基四氮唑磷酸盐缓冲液在30℃黑暗条件下染色24h。具体方法如下：
1)预处理：取完全成熟的五唇兰种荚，剖开果皮用镊子取出种子，将种子分别置于五支2.0mL的离心管中，每支约0.02g，再向离心管中加入5％质量百分含量的Ca(ClO)2溶液(含0.8％吐温-20)1.5mL，盖上离心管的盖子，分别处理15、30、60、90、120min，期间摇动混匀3-5次；用镊子将小块无菌棉花团推入离心管中，将棉花团慢慢推入离心管中下部，将离心管的底部向上倾斜，使Ca(ClO)2溶液流出棉花团；然后向离心管中加入无菌水，用镊子将棉花团向上拉，无菌水随即流入离心管底部并浸没种子，用手转动离心管数次；再将离心管的底部向上倾斜，并向下推入棉花团，使无菌水流出棉花团。如此重复洗涤3次，得到处理好的种子。
2)染色：向步骤1)的离心管中加入1％质量百分含量的2，3，5-氯化三苯基四氮唑磷酸盐缓冲液，在30℃黑暗条件下染色24h；去除2，3，5-氯化三苯基四氮唑磷酸盐缓冲液，无菌水洗3次；最后留约1mL的无菌水于离心管中，摇匀，用移液器吸取混匀了的种子置于载玻片上，在体视显微镜下观察拍照，所拍摄到的照片用于种子生活力的统计，胚被染上红色的种子为有生活力的种子。
实验设3次重复，每个处理1000粒种子，结果取平均数。
实验结果表明，Ca(ClO)2溶液处理的适宜时间为15-60min，种子生活力统计结果为92.2±1.6％，差异不显著；最佳时间为30min，种子的生活力为93.8±0.4％；当处理时间超过90min时，种子的生活力下降。
实验二、浓度不同的次氯酸钙预处理五唇兰种子的染色效果比较
本实验采用0％、1％、2.5％、5％、10％质量百分含量的Ca(ClO)2溶液处理种子30min，1％质量百分含量的2，3，5-氯化三苯基四氮唑磷酸盐缓冲液在30℃黑暗条件下染色24h。具体方法如下：
1)预处理：取完全成熟的五唇兰种荚，剖开果皮用镊子取出种子，将种子分别置于五支2.0mL的离心管中，每支约0.02g，再向离心管中分别加入0％、1％、2.5％、5％、10％质量百分含量的Ca(ClO)2溶液(含0.8％吐温-20)1.5mL，盖上离心管的盖子，处理30min，期间摇动混匀3-5次；用镊子将小块无菌棉花团推入离心管中，将棉花团慢慢推入离心管中下部，将离心管的底部向上倾斜，使Ca(ClO)2溶液流出棉花团；然后向离心管中加入无菌水，用镊子将棉花团向上拉，无菌水随即流入离心管底部并浸没种子，用手转动离心管数次；再将离心管的底部向上倾斜，并向下推入棉花团，使无菌水流出棉花团。如此重复洗涤3次，得到处理好的种子。
2)同实验一的实验步骤2)。
实验设3次重复，每个处理约1000粒种子，结果取平均数。
实验结果表明，未经Ca(ClO)2溶液处理(即质量百分含量为0％)的种子生活力与其他处理差异显著，生活力为90.5±0.5％；1％、2.5％、5％、10％质量百分含量的Ca(ClO)2溶液处理的结果无显著差异，生活力分别为95±1.2％、95.2±0.4％、94.1±0.2％和94.9±0.3％，但0和1％Ca(ClO)2处理的种子的染色稍浅，不易判断种子的生活力。
实验三、浓度不同的2，3，5-氯化三苯基四氮唑磷酸盐缓冲溶液对五唇兰种子染色的效果比较
本实验采用质量百分含量5％Ca(ClO)2溶液预处理种子30min，在30℃和黑暗条件下用0.1％、0.5％、1％和2％质量百分含量的2，3，5-氯化三苯基四氮唑溶液磷酸盐缓冲溶液染色种子24h。具体方法如下：
1)预处理：取完全成熟的五唇兰种荚，剖开果皮用镊子取出种子，将种子分别置于四支2.0mL的离心管中，每支约0.02g，再向离心管中加入5％质量百分含量的Ca(ClO)2溶液(含0.8％吐温-20)1.5mL，盖上离心管的盖子，分别处理30min，期间摇动混匀3-5次；用镊子将小块无菌棉花团推入离心管中，将棉花团慢慢推入离心管中下部，将离心管的底部向上倾斜，使Ca(ClO)2溶液流出棉花团；然后向离心管中加入无菌水，用镊子将棉花团向上拉，无菌水随即流入离心管底部并浸没种子，用手转动离心管数次；再将离心管的底部向上倾斜，并向下推入棉花团，使无菌水流出棉花团。如此重复洗涤3次，得到处理好的种子。
2)染色：分别向步骤1)的离心管中加入0.1％、0.5％、1％和2％质量百分含量的2，3，5-氯化三苯基四氮唑磷酸盐缓冲液，在30℃黑暗条件下染色24h；再按步骤1)的方法去掉2，3，5-氯化三苯基四氮唑磷酸盐缓冲液，无菌水洗3次；最后留约1mL的无菌水于离心管中，摇匀，用移液器吸取混匀了的种子置于载玻片上，在体视显微镜下观察拍照，所拍摄到的照片用于种子生活力的统计，胚被染上红色的种子为有生活力的种子。
实验设3次重复，每个处理约1000粒种子，结果取平均数。
实验结果表明，0.1％ 2，3，5-氯化三苯基四氮唑磷酸盐缓冲溶液的染色结果偏低，仅为90.5±1.6％，与其他处理差异显著；0.5％-2％处理的染色结果差异不显著，生活力为94.8±0.1％。
实验四、2，3，5-氯化三苯基四氮唑磷酸盐缓冲溶液染色时间不同对五唇兰种子的染色效果比较
本实验采用质量百分含量5％Ca(ClO)2溶液预处理种子30min，在30℃和黑暗条件下用质量百分含量1％2，3，5-氯化三苯基四氮唑磷酸盐缓冲溶液分别染色种子3、6、9、12、18和24h。具体方法如下：
1)预处理：取完全成熟的五唇兰种荚，剖开果皮用镊子取出种子，将种子分别置于六支2.0mL的离心管中，每支约0.02g，再向离心管中加入5％质量百分含量的Ca(ClO)2溶液(含0.8％吐温-20)1.5mL，盖上离心管的盖子，分别处理30min，期间摇动混匀3-5次；用镊子将小块无菌棉花团推入离心管中，将棉花团慢慢推入离心管中下部，将离心管的底部向上倾斜，使Ca(ClO)2溶液流出棉花团；然后向离心管中加入无菌水，用镊子将棉花团向上拉，无菌水随即流入离心管底部并浸没种子，用手转动离心管数次；再将离心管的底部向上倾斜，并向下推入棉花团，使无菌水流出棉花团。如此重复洗涤3次，得到处理好的种子。
2)染色：向步骤1)的离心管中加入1％质量百分含量的2，3，5-氯化三苯基四氮唑磷酸盐缓冲液，在30℃黑暗条件下分别染色3、6、9、12、18和24h；再按步骤1)的方法去掉2，3，5-氯化三苯基四氮唑磷酸盐缓冲液，无菌水洗3次；最后留约1mL的无菌水于离心管中，摇匀，用移液器吸取混匀了的种子置于载玻片上，在体视显微镜下观察拍照，所拍摄到的照片用于种子生活力的统计，胚被染上红色的种子为有生活力的种子。
实验设3次重复，每个处理约1000粒种子，结果取平均数。
实验结果表明，染色3h的种子生活力为88.1±1.1％，与其他处理差异显著；染色6-24h的结果差异不显著，但只有染色9h以上的种子的颜色才比较清晰，为染色最佳时间，种子生活力为92.9±1.1％。
实验五、2，3，5-氯化三苯基四氮唑磷酸盐缓冲溶液染色温度不同对五唇兰种子的染色效果比较
本实验采用5％质量百分含量Ca(ClO)2溶液预处理种子30min，在20℃、25℃、30℃、35℃和40℃以及黑暗条件下用1％质量百分含量的2，3，5-氯化三苯基四氮唑磷酸盐缓冲溶液染色12h。具体方法如下：
1)预处理：取完全成熟的五唇兰种荚，剖开果皮用镊子取出种子，将种子分别置于五支2.0mL的离心管中，每支约0.02g，再向离心管中加入5％质量百分含量的Ca(ClO)2溶液(含0.8％吐温-20)1.5mL，盖上离心管的盖子，分别处理30min，期间摇动混匀3-5次；用镊子将小块无菌棉花团推入离心管中，将棉花团慢慢推入离心管中下部，将离心管的底部向上倾斜，使Ca(ClO)2溶液流出棉花团；然后向离心管中加入无菌水，用镊子将棉花团向上拉，无菌水随即流入离心管底部并浸没种子，用手转动离心管数次；再将离心管的底部向上倾斜，并向下推入棉花团，使无菌水流出棉花团。如此重复洗涤3次，得到处理好的种子。
2)染色：向步骤1)的离心管中加入1％质量百分含量的2，3，5-氯化三苯基四氮唑磷酸盐缓冲液，分别在20℃、25℃、30℃、35℃和40℃黑暗条件下染色12h；再按步骤1)的方法去掉2，3，5-氯化三苯基四氮唑磷酸盐缓冲液，无菌水洗3次；最后留约1mL的无菌水于离心管中，摇匀，用移液器吸取混匀了的种子置于载玻片上，在体视显微镜下观察拍照，所拍摄到的照片用于种子生活力的统计，胚被染上红色的种子为有生活力的种子。
实验设3次重复，每个处理约1000粒种子，结果取平均数。
实验结果表明，各处理间差异不显著，但在20℃下的染色较浅，在25℃、30℃、35℃、40℃条件下，种子的生活力都达到93.8±0.7％，其中30℃最高，为94.9±0.6％。
实施例2、束花石斛种子生活力检测实验
本实验采用5％质量百分含量的Ca(ClO)2溶液预处理种子30min，在30℃和黑暗条件下，用1％2，3，5-氯化三苯基四氮唑磷酸盐缓冲溶液染色24h。具体方法如下：
1)预处理：取完全成熟的束花石斛种荚，剖开果皮用镊子取出种子，将种子置于2.0mL的离心管中，每支约0.02g，再向离心管中加入5％质量百分含量的Ca(ClO)2溶液(含0.8％吐温-20)1.5mL，盖上离心管的盖子，处理30min，期间摇动混匀3-5次；用镊子将小块无菌棉花团推入离心管中，将棉花团慢慢推入离心管中下部，将离心管的底部向上倾斜，使Ca(ClO)2溶液流出棉花团；然后向离心管中加入无菌水，用镊子将棉花团向上拉，无菌水随即流入离心管底部并浸没种子，用手转动离心管数次；再将离心管的底部向上倾斜，并向下推入棉花团，使无菌水流出棉花团。如此重复洗涤3次，得到处理好的种子。
2)染色：向步骤1)的离心管中加入1％质量百分含量的2，3，5-氯化三苯基四氮唑磷酸盐缓冲溶液，在30℃黑暗条件下染色24h；再按步骤1)的方法去掉2，3，5-氯化三苯基四氮唑磷酸盐缓冲溶液，无菌水洗3次；最后留约1mL的无菌水于离心管中，摇匀，用移液器吸取混匀了的种子置于载玻片上，在体视显微镜下观察拍照，所拍摄到的照片用于种子生活力的统计，胚被染上红色的种子为有生活力的种子。
实验设3个重复，每个重复约1000粒种子，结果取平均数。
实验结果表明，束花石斛种子的生活力为89.1±0.9％。
实施例3、束花石斛种子生活力检测实验
本实验采用2.5％质量百分含量的Ca(ClO)2溶液预处理种子60min，在25℃和黑暗条件下，用2％2，3，5-氯化三苯基四氮唑磷酸盐缓冲溶液染色12h。具体方法如下：
1)预处理：取完全成熟的束花石斛种荚，剖开果皮用镊子取出种子，将种子置于2.0mL的离心管中，每支约0.02g，再向离心管中加入2.5％质量百分含量的Ca(ClO)2溶液(含0.8％吐温-20)1.5mL，盖上离心管的盖子，处理60min，期间摇动混匀3-5次；用镊子将小块无菌棉花团推入离心管中，将棉花团慢慢推入离心管中下部，将离心管的底部向上倾斜，使Ca(ClO)2溶液流出棉花团；然后向离心管中加入无菌水，用镊子将棉花团向上拉，无菌水随即流入离心管底部并浸没种子，用手转动离心管数次；再将离心管的底部向上倾斜，并向下推入棉花团，使无菌水流出棉花团。如此重复洗涤3次，得到处理好的种子。
2)染色：向步骤1)的离心管中加入2％质量百分含量的2，3，5-氯化三苯基四氮唑磷酸盐缓冲溶液，在25℃黑暗条件下染色12h；再按步骤1)的方法去掉2，3，5-氯化三苯基四氮唑磷酸盐缓冲溶液，无菌水洗3次；最后留约1mL的无菌水于离心管中，摇匀，用移液器吸取混匀了的种子置于载玻片上，在体视显微镜下观察拍照，所拍摄到的照片用于种子生活力的统计，胚被染上红色的种子为有生活力的种子。
实验设3个重复，每个重复约1000粒种子，结果取平均数。
实验结果表明，束花石斛种子的生活力为88.2±0.9％。
实施例4、束花石斛种子生活力检测实验
本实验采用10％质量百分含量的Ca(ClO)2溶液预处理种子15min，在40℃和黑暗条件下，用0.5％2，3，5-氯化三苯基四氮唑磷酸盐缓冲溶液染色9h。具体方法如下：
1)预处理：取完全成熟的束花石斛种荚，剖开果皮用镊子取出种子，将种子置于2.0mL的离心管中，每支约0.02g，再向离心管中加入10％质量百分含量的Ca(ClO)2溶液(含0.8％吐温-20)1.5mL，盖上离心管的盖子，处理15min，期间摇动混匀3-5次；用镊子将小块无菌棉花团推入离心管中，将棉花团慢慢推入离心管中下部，将离心管的底部向上倾斜，使Ca(ClO)2溶液流出棉花团；然后向离心管中加入无菌水，用镊子将棉花团向上拉，无菌水随即流入离心管底部并浸没种子，用手转动离心管数次；再将离心管的底部向上倾斜，并向下推入棉花团，使无菌水流出棉花团。如此重复洗涤3次，得到处理好的种子。
2)染色：向步骤1)的离心管中加入0.5％质量百分含量的2，3，5-氯化三苯基四氮唑磷酸盐缓冲溶液，在40℃黑暗条件下染色9h；再按步骤1)的方法去掉2，3，5-氯化三苯基四氮唑磷酸盐缓冲溶液，无菌水洗3次；最后留约1mL的无菌水于离心管中，摇匀，用移液器吸取混匀了的种子置于载玻片上，在体视显微镜下观察拍照，所拍摄到的照片进行种子生活力的统计，胚被染上红色的种子为有生活力的种子。
实验设3个重复，每个重复约1000粒种子，结果取平均数。
实验结果表明，束花石斛种子的生活力为87.9±1.3％。
对比例、兰科植物种子生活力检测结果与萌发率的关系
为了验证本发明所提供的兰科植物种子生活力检测结果与种子萌发率的关系，本实验同时设计了五唇兰和束花石斛种子的非共生萌发实验。本实验中用到的实验器皿(如离心管、小块棉花、枪头等)均经过高压灭菌。
1、种子消毒播种
在装有已灭菌种子(经5％次氯酸钙+50μL吐温-20灭菌20-40min)的离心管中加入1-2mL经高压灭菌(121℃，30min)后质量百分含量为0.1％的琼脂溶液，与种子混匀后得到种子悬浮液；然后用移液器将种子悬浮液吸取至培养基表面，将培养皿(或培养瓶)封口，水平方向旋转培养皿(或培养瓶)，使种子均匀地分布在培养基表面(以便随后统计萌发率)，进行培养。
2、培养条件即培养基配方
培养条件如下：采用发明专利申请《一种兰花种子萌发培养基》(申请号为200810118432.7)所述的培养条件进行培养。温度为26℃、相对湿度为51％的条件下暗培养2星期，此时种子已萌发，可统计萌发率；但此时萌发的原球茎为白色且较小，统计萌发率时较困难；为了便于统计，通常将其继续培养15天(培养条件为：光强度为25μmol·m-2·s-1、12h光照/12h黑暗、26℃、51％相对湿度)，然后再统计种子萌发率。判断种子萌发的标准为：种子吸水膨大，胚突破种皮。
非共生萌发的培养基配方如下：
采用发明专利申请《一种兰花种子萌发培养基》(申请号为200810118432.7)所述的配方进行配制。配方见表1。
表1、非共生萌发高效培养基
实验设有3个重复，五唇兰和束花石斛种子经培养30d后，种子的萌发率分别为94.05±2.62％和88.83±1.01％。
以上实验结果表明，所述培养条件下的种子生活力测定结果与非共生萌发实验所得的结果一致，可作为检测兰科植物种子生活力的方法。
Claims (7)
1.检测兰科植物种子生活力的方法，包含有如下步骤：
1)用次氯酸钙溶液处理兰科植物种子；
2)将处理过的兰科植物种子用2，3，5-氯化三苯基四氮唑磷酸盐缓冲溶液染色后统计兰科植物种子胚的染色百分率，得到兰科植物种子的生活力；
所述2，3，5-氯化三苯基四氮唑磷酸盐缓冲溶液的溶剂为磷酸盐缓冲液；
所述次氯酸钙溶液的质量百分含量浓度为2.5％-10％；所述处理时间为15min-60min；
所述2，3，5-氯化三苯基四氮唑磷酸盐缓冲溶液的质量百分含量浓度为0.5％-2％；所述染色时间为9h-24h；所述染色温度为25℃-40℃。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述次氯酸钙溶液的质量百分含量浓度为5％；所述处理时间为30min。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述2，3，5-氯化三苯基四氮唑磷酸盐缓冲溶液的质量百分含量浓度为1％；所述染色时间为12h；所述染色温度为30℃。
4.如权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，所述兰科植物种子为五唇兰属(Doritis)植物种子。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述兰科植物种子为五唇兰植物种子。
6.如权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，所述兰科植物种子为石斛属(Dendrobium)植物种子。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述兰科植物种子为束花石斛植物种子。
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