CN104789632A

CN104789632A - 一种植物茎尖细胞活力的测定方法

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Publication number: CN104789632A
Application number: CN201510128765.8A
Authority: CN
Inventors: 张金梅; 陈晓玲; 张海晶; 卢新雄; 辛霞; 尹广鹍; 何娟娟
Original assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2015-03-23
Filing date: 2015-03-23
Publication date: 2015-07-22

Abstract

本发明涉及一种植物茎尖细胞活力的测定方法，所述方法包括：将植物茎尖与浓度为0.45-0.55重量％的TTC溶液接触。利用本发明所提供的方法，可以快速判断植物茎尖细胞的活力。该方法程序简单，易于操作，效率高，是种质活力特别是超低温保存后活力快速测定的一种有效途径。

Description

一种植物茎尖细胞活力的测定方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体的，涉及一种植物茎尖细胞活力的测定方法。

背景技术

超低温保存，即将植物细胞、组织或器官等材料保存在-150℃以下的蒸汽或液态氮，被认为是一种安全、经济、有效的适用于无性繁殖作物长期保存的方法。超低温保存后存活再生检测，主要采用恢复培养和活力染色。恢复培养所需时间一般较长，在适宜培养基、光照和温度条件下，约需半个月、1个月或更长时间。活力染色，如氯化三苯基四氮唑(TTC)活力染色方法，一般仅需1-5小时,或10-30小时。TTC法测定细胞活力的原理为：氯化三苯基四氮唑(TTC)是标准氧化电位为80mV的氧化还原色素，溶于水中成为无色溶液，但还原后即生成红色而不溶于水的三苯基甲臜(TF,Tetrazole RedFormazan)。生成的TF比较稳定，不会被空气中的氧自动氧化，所以TTC被广泛用作酶实验的氢受体，表示脱氢酶活性。脱氢酶的活性可反映细胞呼吸强度的大小，进而在一定程度上表征细胞活力。TF颜色越深，说明细胞活力越高。

TTC目前已被用于花粉、愈伤组织和悬浮细胞等离体组织活性检测。但应用于植物茎尖时存在一些问题，一方面影响TTC活力染色的因素很多，如TTC浓度、pH值、温度、时间、实验材料、处理方式等，难以获得标准的TTC染色条件；另一方面茎尖、尤其超低温保存处理后茎尖受到不同程度的损伤，部分部位细胞存活，进行TTC活力染色时，由于不同研究人员对TTC染红范围以及染红程度认识不同，可能导致茎尖TTC活力染色结果和茎尖恢复培养后实际成活率存在较大误差，在以往实际染色检测活力中，TTC活力染色结果仅能粗略代表茎尖活力值，导致该方法在超低温保存后茎尖检测的TTC精准度较差。因此有必要提供一种周期短、效果准确、操作简便的适用于植物茎尖细胞活力测定的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种周期短、效果准确、操作简便的适合植物茎尖细胞活力测定的方法。

为达到以上目的，本发明提供了一种植物茎尖细胞活力的测定方法，所述方法包括：将植物茎尖与浓度为0.45-0.55重量％的TTC溶液接触。

可选的，所述TTC溶液是将TTC溶于0.08-0.12M的磷酸缓冲液中获得的pH为6.8-7.2的TTC溶液。优选的，为了获得更准确的活力测定效果，所述TTC溶液是将TTC溶于0.1M的磷酸缓冲液中获得的pH为7.0的TTC溶液。

可选的，所述接触的条件为在38-42℃染色1.5-2.5小时。优选为在40℃染色2小时。

可选的，相对于20个尺寸为1-2mm的茎尖，TTC溶液的用量为1.5-2.5mL，优选为2.0mL。

可选的，所述方法还包括在接触后对茎尖进行观察绘制TTC活力染红面积，绘制TTC活力染红面积可利用软件完成，如Cell SensStandard(日本，Olympus)软件，手动选定染红面积和茎尖总面积，通过染红面积/茎尖总面积，进行染色面积比计算。

其中，利用本发明所提供的方法测定超低温保存后茎尖的细胞活力时，超低温保存后茎尖判断活力为50～62.4％，该标准与超低温保存后茎尖恢复培养成活率44～65％接近。

可选的，所述茎尖为马铃薯茎尖。

在本发明所提供的方法中，所述植物茎尖可以为新鲜的植物茎尖和超低温保存后的植物茎尖。

利用本发明所提供的方法，可以快速判断植物茎尖细胞的活力。该方法程序简单，易于操作，效率高，是种质活力特别是超低温保存后活力快速测定的一种有效途径。

附图说明

图1是马铃薯茎尖超低温保存后TTC活力染色照片。

其中：1为新鲜茎尖；2为经0.3M蔗糖MS溶液预培养茎尖；3为经预培养和PVS2处理30min后茎尖；4为经预培养和PVS2处理60min后茎尖；5为经预培养和PVS2处理30min后投液氮化冻后茎尖；6为经预培养和PVS2处理60min后投液氮化冻后茎尖。

图2是马铃薯茎尖超低温保存关键步骤TTC活力染色率。

具体实施方式

下面将通过具体实施方式对本发明进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

实施例1 不同染色温度和时间与新鲜茎尖活力染色率的关系

一、实验材料

实验所用品种为保存于中国农业科学院国家种质库试管苗库的马铃薯“呼自83-213”品种无菌试管苗。

二、实验方法和具体步骤

—获取马铃薯茎尖：选取继代30d的马铃薯试管苗，在无菌条件下，利用双目解剖镜剥取尺寸约为1-2mm的茎尖。试管苗在添加30g/L蔗糖和8g/L琼脂的MS培养基(pH＝5.8)上培养继代。培养温度18±1℃，光照16h/d。

—TTC活力染色：将新鲜健康茎尖置于0.5％TTC-0.1M磷酸缓冲液中(pH＝7.0)30℃、40℃、50℃分别染色1、2、3、5小时。0.1M的磷酸缓冲液，(取0.2M Na₂HPO₄61mL，0.2M NaH₂PO₄39mL，加水定容至200mL，pH调至7.0获得)。每个处理3次重复，每次重复10-20个茎尖。

—TTC活力染色观察：茎尖染色后用蒸馏水洗涤3-5次。在体式显微镜(日本，Olympus)下，利用Cell Sens Standard软件(日本，Olympus)对每个染色后茎尖进行拍照。所试材料为新鲜茎尖，茎尖活力较高，因此TTC活力染色明显，较易于判断。根据拍照结果，统计TTC活力染色率＝染红茎尖/总茎尖×100％。

三、试验结果

TTC活力染色观察结果见表1。由表1可以看出，50℃染色条件下，新鲜茎尖整体被染红色的全染率较低。30℃染色条件下，随着染色时间延长，茎尖整体被染为红色的全染率从染色1小时的0％，增加至染色5小时的90％。40℃染色条件下，2-5小时全染率显著增加，均在90％以上。因此，优化获得马铃薯茎尖TTC染色适宜条件为40℃染色2小时。

表1 染色温度和时间对马铃薯新鲜茎尖TTC活力染色率的影响

实施例2 马铃薯茎尖超低温保存TTC活力快速判定

一、实验材料

二、实验方法和具体步骤

—获取马铃薯茎尖：选取继代30d左右的马铃薯试管苗，在无菌条件下，利用双目解剖镜剥取大小约为1-2mm的茎尖。试管苗在添加30g/L蔗糖和8g/L琼脂的MS培养基(pH＝5.8)上培养继代。培养温度18±1℃，光照16h/d。

—小滴玻璃化法超低温保存：将茎尖先后在含有0.3mol/L和0.5mol/L蔗糖的MS液体培养基中室温避光预培养各1d；在0℃下，用玻璃化溶液PVS2〔30％(w/v)甘油+15％(w/v)乙二醇+15％(w/v)二甲基亚砜+0.4mol/L蔗糖〕分别处理30min和60min；用移液器分别吸取4滴新鲜PVS2玻璃化液(每滴20μL)滴到0.8cm×3.5cm大小的铝箔条上，将渗透保护脱水后的茎尖转移至铝箔条上的小滴中；将粘有茎尖的铝箔条装入盛满液氮的冷冻管中，投入液氮罐；在室温下从冷冻管中取出铝箔条，并迅速浸入含1.2mol/L蔗糖的液体MS溶液中卸载洗涤20min。

—恢复培养：将洗涤后的茎尖转移到MS+50μg/L Zeatin+300μg/L IAA+50μg/L GA₃固体培养基中进行恢复培养。先室温黑暗培养7d，后微光培养7d，最后正常光照培养。

—TTC活力染色：取以下超低温保存关键步骤茎尖：1)新鲜茎尖；2)经0.3M蔗糖MS溶液预培养茎尖；3)经预培养和PVS2处理30min后茎尖；4)经预培养和PVS2处理60min后茎尖；5)经预培养和PVS2处理30min后投液氮化冻后茎尖；6)经预培养和PVS2处理60min后投液氮化冻后茎尖。取样后，将茎尖置于0.5％TTC-0.1M磷酸缓冲液中(pH＝7.0)40℃染色2小时。0.1M的磷酸缓冲液，为取0.2MNa₂HPO₄61ml，0.2M NaH₂PO₄39mL，加水定容至200mL，pH调至7.0。每个处理3次重复，每次重复10-20个茎尖(活力染色结果见图1)。

—TTC活力染色面积计算：茎尖染色后用蒸馏水洗涤3-5次，对每个茎尖在体视显微镜成像系统照相观察。对每个茎尖，利用cellSens Standard软件(日本，OLYMPUS，SZ×16)手绘测定TTC活力染红面积，进行染色面积比计算。

对马铃薯超低温保存关键步骤处理的茎尖进行恢复培养的结果表明，新鲜和蔗糖预培养处理茎尖恢复培养平均成活率均为100％。经蔗糖预培养和PVS2分别处理30min和60min后，恢复培养平均成活率分别降为91.67％和89.58％。投液氮化冻后，茎尖恢复培养平均成活率分别降至43.75％和64.58％。

从图1可以看出，新鲜和蔗糖预培养茎尖TTC活力染色全部为深红色。玻璃化溶液处理(30min/60min)茎尖以及液氮超低温保存后茎尖TTC活力染色面积减少。

由图2可知，通过对茎尖TTC活力染色面积测定，发现当茎尖TTC活力染色面积比为0.45-1时，仍可保持恢复培养后茎尖存活，与实际超低温保存后存活率接近。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种植物茎尖细胞活力的测定方法，其特征在于，所述方法包括：将植物茎尖与浓度为0.45-0.55重量％的TTC溶液接触。

2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述TTC溶液是将TTC溶于0.08-0.12M的磷酸缓冲液中获得的pH为6.8-7.2的TTC溶液。

3.根据权利要求1或2所述的测定方法，其特征在于，所述接触的条件为在38-42℃染色1.5-2.5小时。

4.根据权利要求3所述的测定方法，其特征在于，所述接触的条件为在40℃染色2小时。

5.根据权利要求1、2或4所述的测定方法，其特征在于，所述植物茎尖为尺寸为1-2mm的马铃薯茎尖。

6.根据权利要求5所述的测定方法，其特征在于，相对于20个尺寸为1-2mm的茎尖，TTC溶液的用量为1.5-2.5mL。

7.根据权利要求6所述的测定方法，其特征在于，所述方法还包括在接触后对茎尖进行观察绘制TTC活力染红面积，进行染色面积比计算。