CN110326612A - 一种猪精液常温保存抗氧化稀释液及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种猪精液常温保存抗氧化稀释液及其制备方法。所述稀释液由葡萄糖、乙二胺四乙酸、氯化钾、柠檬酸二钠、碳酸氢钠、庆大霉素和板蓝根多糖配制而成。通过使用植物来源的天然抗氧化剂板蓝根多糖代替人工合成的抗氧化剂，能够加强猪精子的抗氧化能力，缓解氧化损伤，从而有效维持猪精子活率、质膜完整性及顶体完整性，最终维持精子的受精能力。本发明可提高猪精液常温液态保存时间，满足偏远地区生猪生产的需求。同时，该稀释液成本低、操作简洁、保存效果稳定，适于广泛推广，对于促进生猪产业健康持续的发展具有重要意义。

Description

一种猪精液常温保存抗氧化稀释液及其制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于猪精液常温保存的稀释液及其制备方法。
背景技术
目前，在规模养殖场中通常采用猪人工授精技术进行仔猪的繁育，一方面可以提高公猪利用率，另一方面可以加速生猪品种改良。人工授精的关键一步是精液保存，然而猪精子的质膜中存在大量不饱和脂肪酸，抗氧化能力较低，使其在冻融过程中较其他物种的精子更容易受氧化损伤。同时，冷冻保存操作复杂、成本较高，因此猪精液的常温保存逐渐成为猪生产中的首选方法。
新鲜采集的猪精液中活性氧的水平较低，但随着常温液态保存时间的延长逐渐增加。当活性氧的产生与降解之间的稳态被打破，过量的活性氧会造成氧化应激，损伤精子质膜和线粒体，从而影响精子活率，最终削弱公猪精子的受精能力。因此在猪精液稀释剂中需要添加抗氧化剂。然而，目前市面上的猪精液常温保存稀释液一般是添加人工合成的抗氧化剂，例如二丁基羟基甲苯、乙氧基喹啉等，存在一定的副作用，或者添加酶类抗氧化剂，例如超氧岐化酶等，但其价格昂贵，而且这些抗氧化剂添加使猪精子的有效保存时间一般仅达到1～5天，实际使用中仍无法满足偏远地区养殖企业的生产需要。
板蓝根是广泛使用的一种传统中药，价格经济且副作用小，其主要有效成分之一是多糖。板蓝根多糖(IRPS)分离于板蓝根的水提取液，具有较强的抗氧化活性。研究表明，板蓝根多糖作为一种天然植物来源的抗氧化剂，在提高反映细胞内抗氧化水平的谷胱甘肽含量和超氧岐化酶活性的同时，有效抑制活性氧的产生，缓解细胞的脂质过氧化。
为了使养猪业可持续发展，以副作用较小的天然抗氧化剂取代合成抗氧化剂是猪精液保存稀释液的发展趋势，但是，天然抗氧化剂在实际应用于猪精液常温保存时，存在着精子活率、顶体完整性、质膜完整性三个质量指标无法同时优化的问题，个别质量指标在保存时间延长后无法达标，导致猪精液保存时间无法进一步提高。目前尚未见到一种可以实现经济、长效(>5天)猪精液常温保存的稀释液。
发明内容
针对现有猪精液常温保存稀释液存在的价格较高、精液保存有效时间较短的缺陷，本发明提供了一种经济、长效且副作用小的猪精液常温保存抗氧化稀释液及其制备方法。
为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
一种猪精液常温保存稀释液，该稀释液包括36～38g/L的葡萄糖、1.0～1.5g/L的乙二胺四乙酸、0.6～0.9g/L的氯化钾、5.5～6.5g/L的柠檬酸二钠、1.0～1.3g/L的碳酸氢钠、0.24～0.26g/L的庆大霉素及0.20～1.20g/L的板蓝根多糖。
优选的，所述稀释液中，葡萄糖为37.15g/L，乙二胺四乙酸为1.25g/L，氯化钾为0.75g/L，柠檬酸二钠为6.00g/L，碳酸氢钠为1.25g/L，庆大霉素为0.25g/L，板蓝根多糖为0.40～0.60g/L。
优选的，所述稀释液中板蓝根多糖为0.60g/L。
上述猪精液常温保存稀释液的制备方法，包括以下步骤：
1)配制含有上述葡萄糖、乙二胺四乙酸、氯化钾、柠檬酸二钠、碳酸氢钠、庆大霉素及板蓝根多糖的水溶液；
2)用0.22μm微孔滤膜对所述水溶液进行过滤除菌，得稀释液，将稀释液置于36～37℃恒温水浴锅中备用。
上述猪精液常温保存稀释液的使用方法，包括以下步骤：
在猪精液稀释前2～2.5小时，按照上述方法制备稀释液；对采集的猪精液进行精子浓度、精子活率和畸形率检测，将检测合格的猪精液通过与预先制备的稀释液混合，使精子的终浓度经稀释达到2×107～2.5×107个/mL；将稀释后的猪精液放置于15～20℃(最佳保存温度为17℃)恒温冰箱中进行1～7天的保存。
本发明的有益效果体现在：
本发明的常温保存稀释液使用植物来源的天然抗氧化剂板蓝根多糖代替人工合成的抗氧化剂，不仅副作用小，而且能够加强猪精子的抗氧化能力，缓解氧化损伤，从而有效维持猪精子活率、质膜完整性、顶体完整性，最终维持精子的受精能力，可用于猪精液常温(15℃～20℃)液态保存，保存时间提高至7天以上，满足了偏远地区生猪生产的需求。同时，该稀释液成本较低，使用操作简洁，精液保存效果稳定，对于促进生猪产业健康持续的发展具有重要意义。
进一步的，本发明通过采用优化的稀释液基础成分(及用量比例)，结合所发现的板蓝根多糖与猪精子活率、质膜完整性、顶体完整性，及受精能力的特有量效关系，可随着猪精液保存时间的延长，利用所述抗氧化稀释液发挥全面、有效维持常温保存的猪精液的质量指标(精子活率、质膜完整性及顶体完整性)的作用，显著提高了猪精液常温保存时间，适于广泛推广应用。
附图说明
图1为不同浓度的IRPS对精子总抗氧化能力的影响示意图，注：同一天数据肩标小写字母不同表示差异显著(P<0.05)，下同。
图2为不同浓度的IRPS对精液中丙二醛含量的影响示意图。
图3为添加0.6mg/mL的IRPS对精子(Sperm)体外受精的影响示意图；其中：(a)精卵结合数；(b)囊胚率(Blastocyst rate)。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。
一、用于猪精液常温保存的抗氧化稀释液的制备
1、配方及制备流程
1)所述抗氧化稀释液的配方：每1L稀释液中含有37.15g葡萄糖、1.25g乙二胺四乙酸、0.75g氯化钾、6.00g柠檬酸二钠、1.25g碳酸氢钠、0.25g庆大霉素及一定质量的板蓝根多糖。
2)试剂的称取与溶解：稀释液应现配现用，在精液稀释前2小时，用分析天平准确称取配方成分，用双蒸水溶解并定容至1L。
3)稀释液的过滤：待稀释液中各成分充分溶解后，用0.22μm微孔滤膜进行过滤除菌，过滤后置于37℃恒温水浴锅中备用。
2、分组实验
为了确定板蓝根多糖在所述抗氧化稀释液中的最佳浓度，本实验设置了如下试验组：
1)基础稀释液：用分析天平称取37.15g葡萄糖、1.25g乙二胺四乙酸、0.75g氯化钾、6.00g柠檬酸二钠、1.25g碳酸氢钠，及0.25g庆大霉素，然后在双蒸水中充分溶解并定容至1L(即含0mg/mL板蓝根多糖)。配制完成后用0.22μm微孔滤膜进行过滤除菌，然后置于37℃恒温水浴锅中备用。
2)抗氧化稀释液：将添加基础稀释液成分及不同剂量的板蓝根多糖的水溶液，分别配制成含板蓝根多糖0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL和1.2mg/mL的5组抗氧化稀释液。配制完成后用0.22μm微孔滤膜分别进行过滤除菌，然后置于37℃恒温水浴锅中备用。
二、猪精液的采集
选取6头1.5～2岁性成熟的关中黑猪进行样品采集，通过手握法收集富含精子部分的精液，双层滤纸过滤后放置于37℃采精杯中。然后，将精液样品在30分钟之内运送到实验室。
三、猪精液的加工
新鲜采集的猪精液(陕西省杨凌示范区，2019年4月采集)送回实验室后，使用精液密度仪测定精子浓度，并用连接相差显微镜的计算机辅助精子自动分析(CASA)系统检测精子的活率和畸形率。将精子浓度≥2.0×108精子/mL、活率≥80％，及正常精子形态≥85％的样品用于精液常温保存。为了减小个体差异的影响，将采集于6头公猪的合格精液等体积混合。随后，使用预先配制好的基础稀释液及5组抗氧化稀释液分别对精液进行稀释，使其终浓度为2×107精子/mL，制成6份含不同浓度板蓝根多糖的等分精液试样。稀释完毕后将精液试样放置在17℃恒温冰箱中进行保存。
四、猪精液的评估
在精液试样保存的第1、3、5，及7天(day)对精液试样的品质进行评估，包括质量参数和抗氧化参数。
1、精子质量参数评估
精子活率：取200μL精液试样在37℃恒温水浴锅中孵育10min，然后吸取10μL滴加到载玻片上，盖上盖玻片。将玻片在37℃恒温台上预热30s，使用连接相差显微镜(放大400倍)的计算机辅助精子自动分析(CASA)系统检测精子的活率，随机选择5个视野且每个视野至少包括200个精子记录数据。
精子质膜完整性：使用赛默飞世尔精子活力检测试剂盒评估精子质膜完整性。每1mL精液试样与1μL的100nM 储备液在37℃孵育10min，然后用5μL的12μM碘化丙啶(PI)溶液孵育5min。孵育后，用移液枪将10μL染色的精液试样移到玻片上，然后在荧光显微镜下观察。具有完整质膜的活精子发出绿色荧光，而具有红色、橙色荧光的精子则被视为膜受损或死亡。在至少200个精子/视野上评估质膜完整性
精子顶体完整性：使用荧光素异硫氰酸酯-花生凝集素(FITC-PNA)和4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色分析精子的顶体完整性。将30μL精液试样涂在载玻片上，室温下在无水甲醇中固定15min。将30μL 10μg/mL DAPI工作液和100μg/mL FITC-PNA工作液间隔10min依次加入每片载玻片，然后将载玻片置于37℃的湿盒中30min。孵育后，用磷酸盐缓冲液冲洗三次并自然风干。然后，用荧光显微镜放大400倍，分析精子顶体完整的百分比。每次分析中至少评估200个精子。
2、精子抗氧化参数评估
精子总抗氧化能力：使用总抗氧化能力(T-AOC)检测试剂盒(南京建成)评估精子的总抗氧化能力。样品制备后设置酶标仪波长为520nm，检测吸光度，结果根据计算公式换算为U/mL。
丙二醛含量：使用丙二醛(MDA)检测试剂盒(南京建成)测定精液试样中的丙二醛含量。样品制备后设置酶标仪波长为532nm，检测吸光度，结果根据计算公式换算为nmol/mL。
五、猪精子的体外受精试验
将使用板蓝根多糖浓度为0mg/mL和0.6mg/mL的稀释液稀释并保存至第5天的精液试样取出进行获能处理。随后将体外成熟的卵母细胞(陕西省杨凌示范区，2019年4月采集)与获能的精子在体外受精培养基(IVF)中共孵育6小时，一部分用于评估精子与卵子结合数，一部分随后转移至猪合子培养基(PZM-3)中继续孵育至第7天评估囊胚率。
六、结果
如表1所示，当稀释液中IRPS浓度为0.60mg/mL时能够显著维持精子的活率，并且在保存7天后精子活率仍然明显高于50％。在保存5～7天时，0.60mg/mL IRPS组的精子活率显著(P<0.05)高于其他各组。
如表2和表3所示，当稀释液中IRPS浓度为0.60mg/mL时能够显著保护精子的质膜完整性和顶体完整性。在保存3～7天时，0.60mg/mL IRPS组的精子质膜完整性和顶体完整性显著(P<0.05)高于对照组(0mg/mL IRPS)。
表1.不同浓度的IRPS对精子活率(％)的影响
注：同行肩标小写字母不同表示差异显著(P<0.05)，下同。
表2.不同浓度的IRPS对精子质膜完整性(％)的影响
表3.不同浓度的IRPS对精子顶体完整性(％)的影响
如图1和图2所示，当稀释液中IRPS浓度为0.60mg/mL时，在整个保存期间能够显著提高精子的总抗氧化能力(P<0.05)。这与氧化应激产物丙二醛在IRPS浓度为0.60mg/mL的试验组中显著降低相一致(P<0.05)。说明IRPS(0.60mg/mL)能够显著提高精子的抗氧化能力，缓解氧化应激损伤。
如图3所示，当稀释液中IRPS浓度为0.60mg/mL时，能够显著提高精卵结合(图3a，**P<0.01)，并且有利于胚胎的早期发育，囊胚率显著高于含0mg/mL IRPS的对照组(图3b，*P<0.05)。
分析以上结果发现，添加板蓝根多糖后能够显著提高精子的总抗氧化能力，缓解氧化应激的损伤，降低丙二醛的含量。从而，保护精子质膜完整性和顶体完整性，并最终提高精子活率，提高精子的受精能力。其中板蓝根多糖最佳添加浓度为0.60mg/mL。
总之，本发明通过在所述基础稀释液成分中添加板蓝根多糖，提出了一种用于猪精液常温保存的抗氧化稀释液，其通过提高猪精子的抗氧化能力，缓解常温液态保存时氧化应激对猪精子的损伤，能有效维持猪精子活率、质膜完整性及顶体完整性，提高精液保存时间；并且其使用过程操作简洁，较使用含人工合成抗氧化剂的稀释液更安全。因而能够为生猪企业提供具有高质量、经济适用的猪精液，对于促进猪种改良及生猪产业健康持续的发展具有重要意义。

Claims (10)

1.一种猪精液常温保存稀释液，其特征在于：该稀释液包括36～38g/L的葡萄糖、1.0～1.5g/L的乙二胺四乙酸、0.6～0.9g/L的氯化钾、5.5～6.5g/L的柠檬酸二钠、1.0～1.3g/L的碳酸氢钠、0.24～0.26g/L的庆大霉素及0.20～1.20g/L的板蓝根多糖。
2.如权利要求1所述的猪精液常温保存稀释液，其特征在于：所述稀释液中，葡萄糖为37.15g/L，乙二胺四乙酸为1.25g/L，氯化钾为0.75g/L，柠檬酸二钠为6.00g/L，碳酸氢钠为1.25g/L，庆大霉素为0.25g/L，板蓝根多糖为0.40～0.60g/L。
3.如权利要求1或2所述的猪精液常温保存稀释液，其特征在于：所述稀释液中板蓝根多糖为0.60g/L。
4.如权利要求1所述的猪精液常温保存稀释液，其特征在于：所述稀释液与猪精液的混合比例按照将精子稀释至2×107～2.5×107个/mL确定。
5.如权利要求4所述的猪精液常温保存稀释液，其特征在于：所述猪精液经所述稀释液稀释后于15～20℃保存的时间为>5天。
6.一种猪精液常温保存稀释液的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)配制含有下列物质的水溶液：
36～38g/L的葡萄糖、1.0～1.5g/L的乙二胺四乙酸、0.6～0.9g/L的氯化钾、5.5～6.5g/L的柠檬酸二钠、1.0～1.3g/L的碳酸氢钠、0.24～0.26g/L的庆大霉素及0.20～1.20g/L的板蓝根多糖；
2)用微孔滤膜对所述水溶液进行过滤除菌，得稀释液。
7.如权利要求6所述的猪精液常温保存稀释液的制备方法，其特征在于：所述稀释液中，葡萄糖为37.15g/L，乙二胺四乙酸为1.25g/L，氯化钾为0.75g/L，柠檬酸二钠为6.00g/L，碳酸氢钠为1.25g/L，庆大霉素为0.25g/L，板蓝根多糖为0.40～0.60g/L。
8.如权利要求6或7所述的猪精液常温保存稀释液的制备方法，其特征在于：所述稀释液中板蓝根多糖为0.60g/L。
9.如权利要求6所述的猪精液常温保存稀释液的制备方法，其特征在于：所述微孔滤膜的孔径为0.22μm。
10.如权利要求6所述的猪精液常温保存稀释液的制备方法，其特征在于：还包括以下步骤：经过步骤2)后，将稀释液置于36～37℃恒温水浴锅中备用。
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