CN103266079B - 一种海带种质分离的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种海带种质分离方法，本发明在海带游孢子放散时用药用纱布和筛绢里外包裹可以有效防止海带粘液和杂质影响水质；用移液器分离配子体可有效的提高分离效率并避免污染；将培养基加以改善，不但满足了海带孢子快速生长的需求，还可有效的避免了污染，因此，本发明是一种安全高效的种质分离方法。
Description
技术领域
本发明属于海藻种质分离技术领域，具体涉及一种海带种质分离方法。
背景技术
海带是一种大型褐藻，具有较高的经济价值，现已成为我国水产养殖的支柱产业。但是因为我国不是海带原产国，养殖原种只有一个，其生物多样性低，长期养殖后，海带品种严重退化、产量降低，因此人们很重视海带种质采集保存工作。因为海带配子体世代较短，自然状态下，一般不超过14天，所以安全快速的分离海带种质是采集收集种质的关键环节。海带种质分离的传统方法是选择成熟良好的海带种菜，用消毒海水冲洗后，用纱布对表面进行反复擦拭，阴干后，放置到消毒的海水中放散游孢子；用消毒海水稀释游孢子溶液到每视野1-2个/100X，转入培养皿中，在12小时光照，光照强度1000lux，低温海水的条件下培养8-12天；在10倍显微镜下，用消毒的玻璃毛细管，将初长成的雌雄单倍体克隆逐个分出，分别培养。其不足之处有三处，一是由于海带的粘液较多，直接放入海水中，粘液和杂质会使水质变差，影响游孢子的附着和发育；二是用玻璃毛细管分离种质因为需要人工控制，因此需要熟练很长时间，影响分离速度，而且不易控制污染；三是培养液组成不能充分满足配子体无污染快速生长。
发明内容
本发明的目的是提供一种海带种质分离方法，从而解决海带种质分离易被污染，分离效率低的问题，以弥补现有技术的不足。
本发明的海带种质分离方法，包括如下的步骤：
1）将带有成熟孢子囊的海带叶片切割20×20厘米的小块，然后先用药用纱布，再用200目筛绢包裹放入盛有消毒海水的容器中，控制水温在8-12℃，放散游孢子；
2）当海水中游孢子密度为5-10个/100X时，用纱布过滤孢子水，并在过滤后的孢子水中放入载玻片；
3）在光照时间12h，光照强度800-1200lx，水温8-12℃的条件下培育7-10天后，使孢子附着在载玻片上培养形成配子体；
4）将载玻片上的配子体刮到胚胎培养皿中，加入消毒海水稀释10倍，镜检3-5个/100X，用量程为2μL的移液器，调至1μL容量，抽取溶液滴至小玻片上，镜检选出只存在单个配子体的玻片；
5）将有单个配子体的玻片放在盛有培养液的培养皿中继续培养，光照强度控制在500-600lx，每天光照12h，水温控制在8-12℃，完成种质分离工作。
其中步骤1）中带有成熟孢子囊的海带叶片用消毒纱布清洗擦拭，阴干刺激60-90分钟后再用手术刀片切割20×20厘米的小块；
步骤5）中所用的培养液是以自然海水为基础，加入如下组分构成：8×10-6g/ml NaNO3-N、0.4×10-6g/ml KH2PO4-P、5-10×10-6g/ml GeO2，10-7g/ml Vitamin H。
本发明在海带游孢子放散时用药用纱布和筛绢里外包裹可以有效防止海带粘液和杂质影响水质；用移液器分离配子体可有效的提高分离效率并避免污染；将培养基加以改善，不但满足了海带孢子快速生长的需求，还可有效的避免了污染，因此，本发明是一种安全高效的种质分离方法。
具体实施方式
本发明通过单独分离配子体，可以快速的分离海带种质；而且，对于培养时应用的种子液的组分及组分之间的配比，申请人进行了长期的优化，从而促成了本发明。
本发明所配制的培养液，其组分及配制方法如下：8×10-3g NaNO3-N、4×10-4g KH2PO4-P、5-10×10-3g GeO2，10-4g Vitamin H，消毒海水1 L。上述的组分及配比，既可以保障海带配子体快速生长，又能够避免培养过程中发生杂藻污染。
下面对本发明的方法进行详细的描述。
实施例1
（1）在引种海区当海水温度到达16℃时，采集带有成熟孢子囊的海带叶片；
（2）运到室内，用刀片切割20×20厘米的小块，然后用消毒纱布擦拭带有成熟孢子囊的海带叶片后，阴干刺激1小时，用纱布和200目筛绢包裹放入盛有消毒海水的容器中，控制水温在10-12℃，令其孢子放散；
（3）当镜检海水中游孢子密度为5-10个/100X时，放入载玻片。
（4）孢子附着后的载玻片继续培育，光照强度控制在800-1000lx，每天光照12h，水温控制在10-12℃，经培育8天后，形成配子体。
（5）将载玻片上的配子体刮到胚胎培养皿中，加入消毒海水稀释10倍，镜检3-5个/100X，用量程为2μL的移液器，调至1μL容量，抽取溶液滴至拨片上，显微镜视野可完全覆盖液滴，且每个液滴基本上只有1-2个配子体。
（6）将有单个配子体的玻片放在培养皿中加入培养液继续培养，培养液其构成为：8×10-6g/ml NaNO3-N、0.4×10-6g/ml KH2PO4-P、6×10-6g/mlGeO2，10-7g/ml Vitamin H，光照强度控制在500-600lx，每天光照12h，水温控制在10-12℃，完成种质分离工作。
结果显示，相比于传统的种质分离方法，本方法的分离速度提高50%，每天可以分离种质50-60个；种质生长速度提高70%，即2g的种质由原来需要5个月缩短到3个月，而且由于生长速度快，加入特别配制的培养液，种质在培养过程中无污染现象。
实施例2
（1）在引种海区当海水温度到达15℃时，采集带有成熟孢子囊的海带叶片；
（2）运到室内，用刀片切割30×30厘米的小块，然后用消毒纱布沾取消毒海水清洗带有成熟孢子囊的海带叶片后，阴干刺激80分钟，用纱布包裹后，再用200目筛绢包裹放入盛有消毒海水的容器中，控制水温在8-10℃，令其孢子放散；
（3）当镜检海水中游孢子密度为10-20个/100X时，放入载玻片。
（4）孢子附着后的载玻片放入控温光照培养箱中培育，光照强度控制在900-1100lx，每天光照12h，水温控制在10-12℃，经培育7天后，形成配子体。
（5）将载玻片上的配子体刮到胚胎培养皿中，加入消毒海水稀释20倍，镜检3-5个/100X，用量程为2μL的移液器，调至1μL容量，抽取溶液滴至拨片上，显微镜视野可完全覆盖液滴。
（6）将有单个配子体的玻片放在培养皿中继续培养，其构成组分为：8×10-6g/ml NaNO3-N、0.4×10-6g/ml KH2PO4-P、8×10-6g/mlGeO2，10-7g/ml Vitamin H，光照强度控制在500-600lx，每天光照12h，水温控制在10-12℃，完成种质分离工作。
结果显示，相比于传统的种质分离方法，本方法的分离速度提高55%，每天可以分离种质50-70个；种质生长速度提高65%，即2g的种质由原来需要5个月缩短到3个月多点，种质没有污染。
Claims (1)
1.一种海带种质分离方法，其特征在于，包括如下的步骤：
1)将带有成熟孢子囊的海带叶片切割20×20厘米的小块，然后用消毒纱布沾取消毒海水清洗带有成熟孢子囊的海带叶片后，阴干刺激60-80分钟，用纱布包裹后，再用200目筛绢包裹放入盛有消毒海水的容器中，控制水温在8-12℃，放散游孢子；
2)当海水中游孢子密度为5-10个/100X或者10-20个/100X时，用纱布过滤孢子水，并在过滤后的孢子水中放入载玻片；
3)在光照时间12h，光照强度800-1200lx，水温8-12℃的条件下培育7-10天后，使孢子附着在载玻片上培养形成配子体；
4)将载玻片上的配子体刮到胚胎培养皿中，加入消毒海水稀释10倍，镜检3-5个/100X，用量程为2μL的移液器，调至1μL容量，抽取溶液滴至小玻片上；镜检选出只存在单个配子体的玻片；
5)将有单个配子体的玻片放在盛有培养液的培养皿中继续培养，光照强度控制在500-600lx，每天光照12h，水温控制在8-12℃，完成种质分离工作；
所述的步骤5)中所用的培养液是以自然海水为基础，加入如下组分构成：8×10-6g/ml NaNO3-N、0.4×10-6g/ml KH2PO4-P、5-10×10-6g/ml GeO2，10-7g/mlVitamin H。
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| 高温胁迫对海带配子体的生理影响及SAMS基因的克隆与分析;宣慧;《中国优秀硕士学位论文全文数据库农业科技辑》;20120415(第4期);第12页最后1段 * |
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