CN105165628A - 一种基于配子体克隆系的海带属褐藻引种方法 - Google Patents

Abstract

一种基于配子体克隆系的海带属大型经济褐藻引种方法，本发明属于海洋生物技术领域，它包括种藻选择与预处理、孢子采集、配子体培养、雌雄配子体分离、配子体克隆系长途运输、配子体克隆系扩繁和配子体克隆系长期保存。本发明利用海带属海藻配子体世代体积小、易保存的特点，进行长途运输，占用体积小，无需更换培养液，简单易行，成功率可高达100％。

Description

一种基于配子体克隆系的海带属褐藻引种方法

技术领域

本发明属于海洋生物技术领域，具体涉及一种基于配子体克隆系的海带属褐藻引种方法。

背景技术

海藻是重要的海洋资源，有着广泛的用途，可以作为食品，例如海带、紫菜是广受人们喜爱的海洋食品；海藻也是海产养殖动物，如鲍鱼、海参的饵料，还是提取碘、藻胶和甘露醇的重要化工原料。另外，海藻对近海生态环境的修复和保护也具有重要意义。海藻增养殖是海藻资源高效、可持续利用的重要途径，经过几十年的发展，海藻养殖业已发展成为我国海洋产业的重要组成部分，以褐藻类的海带为例，每年的养殖面积约37625公顷，养殖产量约827965吨，产量、规模位居世界第一。大型经济褐藻是我国海藻养殖的重要类型之一，但是我国原产的种类并不丰富，例如养殖海藻中养殖规模最大的海带就不是我国的原产种。积极从世界各地收集具有重要经济价值的海带属大型褐藻，对丰富我国养殖褐藻的种类、储存海带等种类的优良种质，从而推动我国海藻养殖产业可持续发展具有重要战略意义。

当前具有养殖潜力和价值的经济褐藻类，多为大型海藻，其体型较大，例如海带属的种类，其藻体长度可达数米，这就造成了它们难以长途运输，从而使得这些种类很难实现跨国引种或移植。因此，当前大型经济褐藻的引种技术亟需创新和突破。然而，目前仅有关于海带引种的少量报道，即利用海带配子体世代容易保存和运输的特点，进行海带的引种和移植。该方法可以克服长途运输过程中的因藻体过大而不易运输、孢子体容易腐烂的问题，但也存在着雌雄配子体未分离、附苗器体积大等问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一种基于配子体克隆系的海带属大型经济褐藻引种方法。该方法，不仅可以解决大型经济褐藻引种过程中的孢子体体积过大、容易腐烂、孢子易放散丢失或质量不高等问题，还可以解决以往海带引种中的雌雄配子体未分离、附苗器体积大等问题。

为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：

一种基于配子体克隆系的海带属褐藻引种方法，包括种藻选择与预处理、孢子采集、配子体培养、雌雄配子体分离、配子体克隆系长途运输、配子体克隆系扩繁和配体体克隆系长期保存；

1)种藻选择与预处理选择发育成熟的种藻，低温取回并用无菌海水将种藻清洗干净，进行阴干处理；

2)孢子采集将载有孢子囊的孢子体组织块置于入灭菌海水中，使孢子放散，放散完毕后将将孢子体组织块捞出，过滤掉粘液和杂物，得到孢子水，将孢子水加入置有灭菌载玻片的容器中，孢子水刚刚没过载玻片，黑暗过夜培养，温度8-12℃；

3)配子体培养经黑暗过夜的载玻片，置于以下条件继续进行培养：培养液为添加氮磷营养盐的灭菌海水，温度为8-12℃，光照度为20-30μmolm^-2s^-1，光周期为光照时间：黑暗时间＝12:12h，每隔2天更换培养液；

4)雌雄配子体分离在步骤3的条件下，配子体培养7天后，每天镜检配子体发育情况，待到能从形态上区分雌雄配子体时，分离雌、雄配子体，雌、雄配子体分别进行培养；培养条件同步骤3)中所述；

5)配子体克隆系长途运输取少量步骤4)中培养的雌、雄配子体克隆，分别转移到不同的培养管中，更换新鲜的培养液，将培养管置于保温盒，保持温度不高于18℃，进行长途运输；

6)配子体克隆系扩繁将经过长途运输的雌、雄配子体，分别转移至不同培养容器中，置于以下条件继续进行培养：培养液为添加氮磷营养盐的灭菌海水，温度为10-12℃，光照度为30-50μmolm^-2s^-1，光周期为光照时间：黑暗时间＝12:12h，每隔2天更换培养液；

7)配子体克隆系长期保存：经步骤6)的方法进行两周培养后，将配子体克隆系分为两份，二者互为备份，置于以下条件进行长久保存：培养液为添加氮磷营养盐的灭菌海水，温度为0-4℃，光照度为不高于5μmolm^-2s^-1，光周期为光照时间：黑暗时间＝12:12h，培养液更换频率为6个月1次，雌雄配子体分别培养。

进一步，步骤1)所选择藻种的标准为个体大、完整，颜色正常、具光泽，表面无其它附着生物，孢子囊饱满的种藻。

进一步，步骤1)所述的低温为0-10℃

进一步，所述步骤4)的雌雄配子体分离是在显微镜下使用移液器或毛细管分离。

在本发明技术方案的步骤1)中，还具有以下技术特征：种藻选择时，应选取目标海藻生长茂盛的海区，在大潮退潮至最低线，在海藻群体中选择种藻。

在本发明技术方案的步骤1)中，还具有以下技术特征：种藻孢子体阴干时，应置于阴凉通风处，温度控制在20℃以下，直至孢子体表面水分蒸干、藻体稍干燥为止。

在本发明技术方案的步骤2)中，还具有以下技术特征：在孢子体放散时，检查游孢子密度，待游孢子的密度为在100倍显微镜下一个视野有10～20个时，捞出孢子体组织块。

本发明的技术方案的加氮磷营养盐的灭菌海水，它的成分及其终浓度：KNO₃200μmolL^-1和KH₂PO₄20μmolL^-1。

本发明与现有技术相比的有益效果：

1)利用海带属海藻配子体世代体积小、易保存的特点，进行长途运输，能避免孢子体体积过大、不易运输、容易腐烂、孢子易放散丢失或质量不高等问题，从而提高了引种的成功率；2)在对配子体进行长途运输前，将雌雄配子体分离，避免了运输过程中雌雄配子体成熟、排精排卵而受精产生幼孢子体。3)配子体运输时并非附着在苗帘或载玻片上，而是游离状态，运输时仅仅取极少量的配子体克隆系，占用体积小，无需更换培养液，简单易行，成功率可高达100％。

附图说明

图1是显微镜下雌、雄配子体的外观形态图：1、雄配子体，2、雌配子体；

图2是配子体克隆长途运输的培养管图：3、配子体克隆；

图3是可长期保存的配子体克隆系图：4、配子体克隆系。

具体实施方式

下面通过实施例来对本发明的技术方案作进一步详细的说明，但本发明的保护范围不受实施例任何形式上的限制。

实施例1

本实施例以极北海带的引种为例，具体步骤包括：

1.种藻选择与预处理。选择目标海藻生长茂盛的海区，在大潮退潮至最低线，在海藻群体中选择种藻，选择种藻的标准如下：藻体个体大、完整，颜色正常、具光泽，表面无其它附着生物，孢子囊饱满。用无菌解剖刀切下载有孢子囊的孢子体组织块，置于冰盒，控温在4℃左右，尽快带回实验室。

将带回实验室的孢子体组织块，用灭菌海水清洗，用灭菌脱脂棉花轻轻擦拭藻体表面，清除附着物；将清洗干净的孢子体置于阴凉通风处(温度控制在20℃以下)，进行阴干处理，时间约为1小时，直至孢子体表面水分蒸干、藻体稍干燥为止。

2.孢子采集。将预处理的孢子体组织块置于灭菌培养皿，加入灭菌海水(无菌海水添加200μmolL^-1KNO₃和20μmolL^-1KH₂PO₄，温度控制在8-10℃)，海水没过孢子体组织块，等待孢子放散。显微镜检查游孢子密度，直至在100倍显微镜下，当一个视野达到10～20个健康游孢子，将孢子体组织块捞出。用300目筛绢过滤掉粘液和杂物，得到孢子水。将孢子水加入置有灭菌载玻片的培养皿中，孢子水刚刚没过载玻片即可。将培养皿移至光照培养箱中黑暗过夜培养，温度8-12℃。

3.配子体培养。经黑暗过夜的培养皿，置于以下条件继续进行培养：培养液为添加200μmolL^-1KNO₃和20μmolL^-1KH₂PO₄灭菌海水，温度为8-12℃，光照度为20-30μmolm^-2s^-1，光周期为12:12h(L:D)。每隔2天更换培养液。

4.雌雄配子体分离。配子体在上述条件下培养7天后，每天镜检配子体发育情况，直至能从形态上区分雌雄配子体(图1)：雌配子体2通常为1个细胞，球形或梨形；雄配子体1通常为多细胞，由数个至十几个细胞不等，细胞个体明显小于雌配子体。此时，将配子体从载玻片上轻轻刮下进行悬浮培养，在显微镜下使用移液器或毛细管分离雌、雄配子体，雌、雄配子体分别进行培养。培养条件同步骤4中所述。

5.配子体克隆系长途运输。取少量分别培养的雌雄配子体克隆3，转移到培养管(图2)，更换新鲜的培养液，将培养管置于保温盒，配子体长途运输过程中，及时检查控温器具，保证配子体所处的微环境不超过18℃。

6.配子体克隆系扩繁与保存。将经过长途运输的配子体，转移至培养瓶中，置于以下条件继续进行培养：培养液为添加200μmolL^-1KNO₃和20μmolL^-1KH₂PO₄灭菌海水，温度为8-12℃，光照度为20-30μmolm^-2s^-1，光周期为12:12h(L:D)。每隔1周更换培养液。

7.配子体克隆系长期保存：经一个月培养后，将配子体克隆系分为两份，二者互为备份(图3)，置于以下条件进行长久保存：培养液为添加氮磷营养盐的灭菌海水(其成分及终浓度为200μmolL^-1KNO₃和20μmolL^-1KH₂PO₄)，温度为0-4℃，光照度为不高于5μmolm^-2s^-1，光周期为12:12h(L:D)，培养液更换频率为6个月1次。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；本实施例的技术方案不仅适用于极北海带，同样适用于海带属的其它品种。尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (8)

1.一种基于配子体克隆系的海带属大型经济褐藻引种方法，其特征在于它包括种藻选择与预处理、孢子采集、配子体培养、雌雄配子体分离、配子体克隆系长途运输、配子体克隆系扩繁和配子体克隆系长期保存，具体步骤如下：

1)种藻选择与预处理选择发育成熟的种藻，低温取回并用无菌海水将种藻清洗干净，进行阴干处理；

2)孢子采集将载有孢子囊的孢子体组织块置于入灭菌海水中，使孢子放散，放散完毕后将孢子体组织块捞出，过滤掉粘液和杂物，得到孢子水，将孢子水加入置有灭菌载玻片的容器中，孢子水刚没过载玻片，黑暗过夜培养，温度8-12℃；

3)配子体培养经黑暗过夜的载玻片，置于以下条件继续进行培养：培养液为添加氮磷营养盐的灭菌海水，温度为8-12℃，光照度为20-30μmolm^-2s^-1，光周期为光照时间：黑暗时间＝12:12h，每隔2天更换培养液；

4)雌雄配子体分离在步骤3)的条件下，配子体培养7天后，每天镜检配子体发育情况，待到能从形态上区分雌雄配子体时，分离雌、雄配子体，雌、雄配子体分别进行培养；培养条件同步骤3)中所述；

5)配子体克隆系长途运输取少量步骤4)中培养的雌、雄配子体克隆，分别转移到不同的培养管中，更换新鲜的培养液，将培养管置于保温盒，保持温度不高于18℃，进行长途运输；

6)配子体克隆系扩繁将经过长途运输的雌、雄配子体，分别转移至不同培养容器中，置于以下条件继续进行培养：培养液为添加氮磷营养盐的灭菌海水，温度为10-12℃，光照度为30-50μmolm^-2s^-1，光周期为光照时间：黑暗时间＝12:12h，每隔1周更换培养液；

7)配子体克隆系长期保存：经步骤6)的方法进行1月培养后，将配子体克隆系分为两份，二者互为备份，置于以下条件进行长久保存：培养液为添加氮磷营养盐的灭菌海水，温度为0-4℃，光照度为不高于5μmolm^-2s^-1，光周期为光照时间：黑暗时间＝12:12h，培养液更换频率为6个月1次，雌雄配子体分别培养。

2.根据权利要求1所述的一种基于配子体克隆系的海带属大型经济褐藻引种方法，其特征在于步骤1)所选择种藻的标准为个体大、完整，颜色正常、具光泽，表面无其它附着生物，孢子囊饱满的种藻。

3.根据权利要求1所述的一种基于配子体克隆系的海带属大型经济褐藻引种方法，其特征在于步骤1)所述的低温为0-10℃。

4.根据权利要求1所述的一种基于配子体克隆系的海带属大型经济褐藻引种方法，其特征在于步骤1)中的种藻选择时，选取目标海藻生长茂盛的海区，在大潮退潮至最低线，在海藻群体中选择种藻。

5.根据权利要求1所述的一种基于配子体克隆系的海带属大型经济褐藻引种方法，其特征在于步骤1)中的种藻孢子体阴干时，置于阴凉通风处，温度控制在20℃以下，直至孢子体表面水分蒸干、藻体稍干燥为止。

6.根据权利要求1所述的一种基于配子体克隆系的海带属大型经济褐藻引种方法，其特征在于步骤2)在孢子体放散时，检查游孢子密度，待游孢子的密度为在100倍显微镜下一个视野有10～20个时，捞出孢子体组织块。

7.根据权利要求1所述的一种基于配子体克隆系的海带属大型经济褐藻引种方法，其特征在于所述步骤4)的雌雄配子体分离是在显微镜下使用移液器或毛细管分离。

8.根据权利要求1所述的一种基于配子体克隆系的海带属大型经济褐藻引种方法，其特征在于所述的添加氮磷营养盐的灭菌海水，它的成分及其终浓度：KNO₃200μmolL^-1和KH₂PO₄20μmolL^-1。