CN103704121A

CN103704121A - 多肋藻配子体克隆杂交育苗技术

Info

Publication number: CN103704121A
Application number: CN201310630579.5A
Authority: CN
Inventors: 王高歌; 路博钧; 帅丽玫; 李丹丹; 张蕊; 魏晓娇
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2013-12-02
Filing date: 2013-12-02
Publication date: 2014-04-09

Abstract

本发明涉及多肋藻（Costaria costata）配子体克隆杂交育苗技术，即克隆培养分离多肋藻雌、雄配子体并利用其进行杂交育苗。步骤如下：1）清洗剪切多肋藻孢子体；2）阴干使其释放游孢子；3）培养附着的游孢子；4）发育成配子体后刮下、打碎、培养；5）分离雌、雄配子体；6）打碎、克隆培养获得大量雌、雄配子体；7）将雌、雄配子体杂交育出幼孢子体；8）转移至海上暂养；9）一个月后，分苗，海上养殖，获得成熟孢子体。本发明的优点为：通过分离高纯度多肋藻雌、雄配子体，并进行克隆培养，获得大量用于育苗的雌、雄配子体种质材料，育苗时间不受季节限制，可满足未来对多肋藻的生产及科研需要。

Description

多肋藻配子体克隆杂交育苗技术

技术领域

本发明涉及多肋藻配子体克隆杂交育苗技术，具体地说就是建立一种有效的分离多肋藻雌、雄配子体、克隆培养雌、雄配子体以及通过雌、雄配子体杂交繁育出多肋藻种苗的方法。

背景技术

多肋藻是一种具有较高经济价值的一年生大型褐藻，其富含碘以及多种人体必需的微量元素，营养价值高，口感好，味道鲜美，为海藻中的上等营养佳品。多肋藻还是海藻工业的重要原材料，多肋藻具有提取褐藻胶、甘露醇、钾等化工原料以及制备褐藻淀粉的应用潜力。另外，多肋藻产生的次级代谢物--褐藻多酚类化合物具有抗肿瘤、抑菌以及抗氧化活性。因此，多肋藻是一种具有广阔应用前景的经济褐藻。迄今为止，尚未有关于多肋藻配子体克隆杂交技术的报道及专利申请，为实现我国海藻养殖新品种多肋藻的人工养殖，促进海藻养殖业多元化、生态化、规模化发展，我们开发出一种简单高效的多肋藻配子体克隆杂交育苗技术。

发明内容

本发明的目的在于建立了多肋藻雌、雄配子体分离技术、克隆培养技术以及杂交技术进行多肋藻种苗繁育的技术。

多肋藻配子体克隆杂交育苗技术，可按如下步骤操作，

1）取带孢子囊的多肋藻成熟孢子体，在无菌海水中清洗5次，并用消毒刀片剪切10×10 cm组织块；

2）将组织块用脱脂棉擦干置于10 ℃、黑暗条件下阴干2 h后，放入盛有无菌海水培养液及载玻片的的烧杯中，转移至光照培养箱中8 ℃、5 μmol·m^-2·s^-1，光周期为12：12 h （L:D）附着24 h；

3）除去组织块，显微镜下观察到游孢子附着在载玻片后，取出载玻片放入新的盛有无菌海水的烧杯中，在10 ℃、20 μmol·m^-2·s^-1，光周期为12：12 h （L:D）条件下培养15 d，每周换一次无菌海水培养液；

4）待游孢子发育成配子体时，用灭菌的解剖刀轻轻刮下配子体，用搅拌器（JYD-P11S81，九阳）打碎10 s，倒入锥形瓶中进行悬浮培养10 d，培养条件为10 ℃、20 μmol·m^-2·s^-1，光周期为12：12 h （L:D）；

5）显微镜下可以区分雌、雄配子体后，用将配子体摇匀，取少量在培养皿中用无菌海水培养液稀释至密度为2个配子体/视野（10×10），显微镜下用毛细管分离雌、雄配子体并分别放置到装有无菌海水培养液的锥形瓶中；

6）在10 ℃、20 μmol·m^-2·s^-1，光周期为12：12 h （L:D）培养条件下，每周换一次无菌海水培养液克隆培养雌、雄配子21 d，形成肉眼可见的绒毛状配子体，用搅拌器打碎10 s，倒入锥形瓶中，在相同条件下悬浮培养31 d，获得大量雌、雄配子体种质材料；

7）取雌、雄配子体按1:1混合，倒入放有直径3 mm棕绳的烧杯中在15 ℃、40 μmol·m^-2·s^-1，光周期为12：12 h （L:D）条件下培养28 d，每周换一次无菌海水培养液；

8）当棕绳上长出肉眼可见的幼孢子体（长度0.5-1cm）时，可将其转移至海上暂养；

9）暂养一个月后，分苗，海上养殖5-6个月，获得成熟的多肋藻孢子体。

所述无菌海水培养液组成为200 μmol·L^-1KNO₃，20 μmol·L^-1KH₂PO₄的无菌海水。

本发明具有以下优点

1. 建立了多肋藻雌、雄配子体的分离方法，并通过克隆培养，获得大量的雌、雄配子体种质材料，可满足多肋藻种质保存、育苗以及各种科学研究及生产的需求。

2. 多肋藻配子体克隆杂交育苗技术，是一种高效成熟的多肋藻育苗技术，填补了目前多肋藻育苗方面的空白。

3. 多肋藻配子体克隆育苗技术的费用低，在育苗过程中不需要复杂的设备和贵重药品。

4. 育种方式方便灵活，绝大多数步骤可在实验室完成，避免占用大面积空间，不需要大量人力物力。

5. 育苗不受季节的限制。可以在任何时间和季节进行育苗。

具体实施方式

应用实例1

多肋藻雌、雄配子体的分离

2011年7月6日，取带孢子囊的多肋藻成熟孢子体，在无菌海水中清洗5次，并用消毒刀片剪切10×10 cm组织块；将组织块用脱脂棉擦干置于10 ℃、黑暗条件下阴干2 h，放置到盛有无菌海水培养液及9片载玻片的3 L烧杯中置于光照培养箱中附着培养24 h，附着培养条件为8 ℃、5 μmol·m^-2·s^-1，光周期为12：12 h （L:D）；除去组织块，显微镜下观察到游孢子附着在载玻片上，取出载玻片放入新的盛有无菌海水的3L烧杯中，在10 ℃、20 μmol·m^-2·s^-1，光周期为12：12 h（L:D）条件下培养15 d，每周换一次无菌海水培养液；待游孢子发育成配子体时，用灭菌的解剖刀轻轻刮下配子体，并用搅拌器（JYD-P11S81，九阳）打碎10 s，倒入锥形瓶中进行悬浮培养10 d，培养条件为10 ℃、20 μmol·m^-2·s^-1，光周期为12：12 h（L:D）；显微镜下可以区分雌、雄配子体后，将配子体摇匀，取少量在培养皿中用无菌海水培养液稀释至密度为2个配子体/视野（10×10），显微镜下用毛细管将雌、雄配子体分离并放置到装有无菌海水培养液的500 ml锥形瓶；分别在10 ℃、20 μmol·m^-2·s^-1，光周期为12：12 h（L:D）条件下克隆培养雌、雄配子21 d，每周换一次无菌海水培养液，形成肉眼可见的绒毛状配子体，用搅拌器打碎10 s，倒入1 L锥形瓶中，在相同条件下悬浮培养31 d，获得大量雌、雄配子体种质材料。

应用实例2

育苗及海上养殖

取雌、雄配子体湿重各15 mg混合，置于含有300 mL无菌海水以及直径3 mm棕绳的烧杯中，15 ℃、40 μmol·m^-2·s^-1，光周期为12：12 h （L:D）条件下培养28 d，每周换一次无菌海水培养；2011年10月20日棕绳上长出肉眼可见的小孢子体（长度0.5-1cm），将棕绳转移至自然条件下暂养；一个月后分苗，海上养殖5-6个月，获得成熟的多肋藻孢子体。

Claims

1.多肋藻配子体克隆杂交育苗技术，其特征在于：可按如下步骤操作，

1)用无菌海水清洗带有孢子囊的多肋藻孢子体5次，剪切10×10 cm的组织块；

2)将组织块阴干处理2 h后，放入盛有无菌海水及载玻片的烧杯中，待其释放游孢子；

3)显微镜下观察到游孢子附着在载玻片后，取出载玻片放入新的盛有无菌海水的烧杯中，在适宜条件下培养；

4)待游孢子发育成配子体时，将其从载玻片上轻轻刮下并打碎，倒入锥形瓶中悬浮培养；

5)显微镜下可以区分雌、雄配子体后，利用毛细管分离出雌、雄配子体；

6)分别培养雌、雄配子体，形成肉眼可见的绒毛状，打碎、再次进行悬浮培养以获得大量雌、雄配子体；

7)取雌、雄配子体按1:1比例混合，倒入放有棕绳的烧杯中培养；

8)当棕绳上长出肉眼可见的小孢子体（长度约0.5-1cm）时，转移到海上暂养；

9)暂养一个月后，分苗，海上养殖5-6个月，获得成熟的多肋藻孢子体。

2.按照权力1所述多肋藻配子体克隆杂交育苗技术，其特征在于：阴干处理条件为10 ℃黑暗条件下2 h。

3.按照权力1所述多肋藻配子体克隆杂交育苗技术，其特征在于：无菌海水培养液的组成为200 μmol·L^-1KNO₃，20 μmol·L^-1KH₂PO₄的无菌海水。

4.按照权力1所述多肋藻配子体克隆杂交育苗技术，其特征在于：游孢子在培养皿中的培养附着条件为8 ℃、5 μmol·m^-2·s^-1，光周期为12：12 h (L:D)。

5.按照权力1所述多肋藻配子体克隆杂交育苗技术，其特征在于：附着游孢子的培养条件为10 ℃、20 μmol·m^-2·s^-1，光周期为12：12 h (L:D)。

6.按照权力1所述多肋藻配子体克隆杂交育苗技术，其特征在于：配子体悬浮培养条件为10 ℃、20 μmol·m^-2·s^-1，光周期为12：12 h (L:D)。

7.按照权力1所述多肋藻配子体克隆杂交育苗技术，其特征在于：取雌、雄配子体湿重各15 mg混合放入加有300 mL无菌海水和棕绳的烧杯中，培养条件为15 ℃、40 μmol·m^-2·s^-1，光周期为12：12 h (L:D)。