CN110463598B - 一种利用配子体克隆系进行极北海带苗种培育的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种利用极北海带配子体进行苗种培育的方法，属于海水藻类养殖领域，其步骤为：取极北海带雌、雄配子体混合后打碎，用500目数的筛绢过滤后得到所需长度的配子体细胞段，用培养皿培养，培养条件为温度13℃，光照强度10μmol photons/(m2·s)，光周期8L:16D，培养液为添加F/2培养基的灭菌海水，培养过程中每3d更换一次培养液；从采苗到1cm需要40‑50d；1cm以后即可出库。本发明能够利用极北海带配子体得到极北海带小苗，抑制育苗过程中的单性生殖率。

Description

一种利用配子体克隆系进行极北海带苗种培育的方法
技术领域
本发明属于海水藻类养殖领域，具体地涉及一种利用极北海带配子体克隆系进行苗种培育的方法。
背景技术
海洋牧场是我国海洋渔业新一轮产业升级的重要发展方向，而海藻场作为海洋牧场建设的关键组成部分，发挥着重要的生态作用。海藻场建设的方式主要包括大型海藻浮筏式养殖、海藻潜筏式增养殖、浅滩区海藻增殖等。这些方式对海藻场建设发挥了积极效应，取得了一定成效，但也存在诸如选用的藻种多为一年生而需要每年人工移植、由于鱼礁水层太深光线太弱导致海藻无法自然增殖等问题。因此，筛选适宜的藻种，是当前构建海藻场的关键问题，而引进经济价值高，尤其是耐低光、多年生的海藻，能够在人工渔礁上形成自然繁殖的海藻群体，真正发挥海藻场的生态功能，对海洋牧场构建意义巨大。
极北海带(Laminaria hyperborea)属于褐藻纲(Phaeophyceae)、海带目(Laminariales)、海带科(Laminariaceae)、海带属(Laminaria)，其自然分布于东北大西洋沿岸。它是一种多年生的藻类，其平均寿命为8-15年，个体大，作为优势种可形成“海藻森林”，是海洋生物的索饵场、产卵场或栖息地；还具有吸收利用水体营养盐和增加溶解氧、吸附重金属离子的作用，在提高海洋生物多样性、海水生物修复、碳汇等方面发挥重要作用。极北海带褐藻胶含量高且凝胶强度大，是用来提取褐藻胶的优良原材料，含有丰富的维生素和矿物元素，常被用作肥料和动物饲料添加剂，经济价值大。尤其是，极北海带及其耐低光，能在30m的海底存活。因此，极北海带具备的多年生、耐低光、个体大和价值高等特点，使得其成为我国藻场建设的优良藻种。
规模化育苗是利用极北海带构建藻场的首要前提，目前国内外尚无关于极北海带规模化苗种培育的报道。在利用配子体克隆系进行极北海带幼苗培育过程中发现，参照其它近缘物种(如海带)相似的培养方法，极北海带雌、雄配子体发育不同步，受精率低，幼苗畸形率高，尤其是容易形成单性生殖而导致育苗培养失败。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供一种利用极北海带配子体克隆系进行苗种培育的方法，所述方法可以抑制单性生殖率。
本发明是通过如下技术方案来实现的：
一种利用极北海带配子体进行苗种培育的方法，所述方法具体步骤如下：
取极北海带雌雄配子体，按照雌、雄比例1：2～1:3混合后打碎，用500目数的筛绢过滤后得到4-6个细胞为主的配子体细胞段，用培养皿培养，培养条件为温度13℃，光照强度10μmol photons/(m2·s)，光周期8L:16D，培养液为添加F/2培养基的灭菌海水，培养过程中每3d更换一次培养液，从采苗到1cm需要40-50d；1cm以后即可出库。
本发明与现有技术相比的有益效果：
本发明通过提高雄配子体的比例，提高受精率，减少卵因未受精而导致的单性生殖(孤雌生殖)现象，并且采用配子体发育的最适宜条件，可大大降低极北海带的单性生殖率，进而提高极北海带配子体克隆系育苗的成功率。
附图说明
图1不同目数筛绢过滤后配子体面积变化；
图2不同光周期培养下配子体面积变化；
图3极北海带的发育图：a：雄配子体营养生长；b-c：雌配子体营养生长；d-f：雌配子体发育；g：雄配子体发育；h-j：第一次不对称分裂；k-l：细胞横分裂；m-o：幼孢子体早期形态。
具体实施方式
下面通过实施例来对本发明的技术方案作进一步解释，但本发明的保护范围不受实施例任何形式上的限制。
实施例1
分别取适量极北海带雌、雄配子体克隆系混合破碎，保持雌、雄比例约1：2，每次破碎后显微镜下观察打碎后的细胞段长度，每个细胞段中细胞个数大部分是11-15个时用200目筛绢过滤，用相同破碎观察方法得到300目(7-10个细胞)、500目(4-6个细胞)、1000目(1-3个细胞)筛绢过滤后的配子体。将配子体和培养液均匀的倒在放有玻璃片的培养皿中，每组三个重复实验，温度13℃，白光照强度10μmol photons/(m2·s)，光周期8L:16D，培养液为添加F/2培养基的灭菌海水，每3d更换一次培养液并拍照观察，随机选取至少5个以上的配子体细胞段进行观察，用ImageJ软件对配子体面积进行测量，求平均值。
结果：第12d时200目筛绢过滤后的玻璃片上首先观察到小苗，15d后不同目数筛绢过滤后的玻璃片上均有小苗出现。各玻璃片上的小苗大部分均在配子体簇状边缘形成，200目过滤后的配子体中最先形成小苗可能是因为细胞段较长，更容易生长为簇状。
由图1可知，1000目和500目过滤的配子体面积在9d-12d增加明显；300目过滤的配子体面积在12d-15d之间增加明显；200目过滤的配子体面积在15d-18d之间增加明显，表明细胞长度越小，发育过程中配子体面积增加开始的越早，即细胞段越小，营养增长的速度越快；但营养生长快的细胞段中发育速度相对较慢，即较晚出现小苗。总的来说，破碎后用200目筛绢过滤的配子体发育较快，1000目筛绢过滤的配子体营养生长较快，但在实际操作过程中，200目筛绢过滤后的配子体细胞段数较多，营养生长较慢，且相同条件下小苗的数量小于其他细胞段数的配子体，1000目筛绢过滤的配子体细胞段数较小，发育较慢，且不易观察。因此，综合来说，极北海带配子体克隆育苗时混合破碎为4-6个细胞段时最适宜，也即破碎后的雌雄配子体用500目筛绢过滤后获得的细胞段营养生长和发育繁殖都较快，且出苗量大，如图1所示。
实施例2
取适量极北海带雌、雄配子体混合后打碎，保持雌、雄比例约1：2，用500目的筛绢过滤后得到所需长度的配子体细胞段，用培养皿培养，温度13℃，白光照强度10μmolphotons/(m2·s)，培养液为添加F/2培养基的灭菌海水。每3天观察拍照，随机选取至少5个以上的配子体细胞段进行观察，用ImageJ软件对配子体面积进行测量，求平均值。因为小苗面积增速快于配子体面积增速，通过多次实验的数据来看，平均面积突然倍数增加时则可能做为小苗已形成的标志。结果如图2所示。
14L:10D和10L:14D：第0-9d内配子体主要进行营养生长，9d后配子体开始发育，第12d第一次观察到小苗，约1/10的配子体发育成小苗。
16L:8D：第0-9d内配子体主要进行营养生长，9d后配子体开始发育，第15d第一次观察到小苗。
12L:12D：第12d第一次观察到小苗，但小苗出现概率较低，只有少量的配子体发育为小苗。
8L:16D：第9d第一次观察到小苗，第12d大部分配子体均发育为小苗。此光周期下，配子体发育最快，且小苗的产生率最高，为最适宜的配子体克隆育苗光周期。
实施例3极北海带的发育实验
极北海带配子体克隆系快速扩繁，具体步骤如下：
极北海带配子体来源于法国布列塔尼半岛海区，前期培养条件为：温度13℃，红光照强度10μmol photons/(m2·s)，光周期24L︰12D，培养液为经过滤、高压灭菌冷却后的天然海水，营养盐浓度为PO4 3--P：0.4mg/L，NO3 --N：4mg/L；
取生长状态良好的极北海带雌、雄配子体，分别用匀浆仪破碎，将破碎后的配子体用500目筛绢过滤得到4-6个细胞为主的配子体细胞段，将过滤后的配子体和培养液均匀的倒在每组放有玻璃片的培养皿中，培养条件为温度13℃，白光光强10μmol photons/(m2·s)，培养液为经过滤、高压灭菌冷却后的天然海水，培养液中的营养盐浓度为PO4 3--P：0.6mg/L，NO3 --N：6mg/L，光周期24L:0D，培养20d，将配子体簇重新破碎并分瓶培养，从而获得大量的极北海带雌雄配子体克隆系。
将获得雌、雄配子体按上述方法破碎，将破碎后的配子体用500目筛绢过滤并混合，保持雌、雄比例约1：2，然后倒入在玻璃培养皿培养。培养条件：温度13℃，白光光强10μmol photons/(m2·s)，PO4 3--P：0.6mg/L，NO3 --N：6mg/L，光周期8L:16D，培养时间18d。培养液为添加F/2培养基的灭菌海水。培养9d时首次观察到受精分裂，从开始形成孢子体到孢子体长1mm约15d，再到1cm约需要20d，合计从采苗到1cm需要40-50d；1cm以后即可出库，可以参照海带苗种进行海区暂养、分苗和养殖。
雌、雄配子体和幼孢子体的发育如图3所示。雌、雄配子体混合破碎9d内，配子体主要进行营养生长：雄配子体中部或顶部细胞突起，进行丝状体细胞的有丝分裂，细胞直径6-7μm(图a)；雌配子体细胞较圆，色素较深，细胞直径10-14μm，有的细胞中有空壳，色素块状分布(图b-c)。9d内雌、雄配子体处于生长发育的各个状态，如图d-g所示，雌雄配子体间、雌配子体间、雄配子体间发育均不同步，雌配子体细胞首先色素体集中，细胞颜色变深，表面卵囊突起并逐渐伸长、加粗，色素体向突起中流动，随后突起顶端膨大成球形，最终发育为成熟卵囊，每个细胞发育成一个卵囊，排出一个卵，附着在空的卵囊口上等待受精(图d-f)；雄配子体顶端细胞首先产生突起，并发育为精子囊，突出于分支顶端，随后靠近顶端精子囊的细胞进一步发育为精子囊，发育成熟的雄配子体具有多个精子囊簇(图g)。幼孢子体发育如图h-o所示：受精卵细胞首先进行第一次不对称分裂图(h-j)，然后继续横分裂为多个细胞(图k-l)。顶部细胞首先进行纵分裂，且分裂速度较快，然后基部细胞进行纵分裂(图m)。但有的幼孢子体发育中只进行横分裂，细胞细长，几乎不发生纵分裂(图n)，若在幼孢子体横分裂较早阶段发生纵分裂，幼苗形态表现为短且宽(图o)。通过提高雄配子体的比例，提高受精率，减少卵因未受精而导致的单性生殖(孤雌生殖)现象，并且采用配子体发育的最适宜条件，可大大降低极北海带的单性生殖率，进而保证了育苗的成功率。

Claims (1)

1.一种利用极北海带配子体进行苗种培育的方法，其特征在于所述方法为取极北海带雌、雄配子体，按照雌、雄配子体的质量比为1：2～1:3混合后打碎，用500目数的筛绢过滤后得到4-6个细胞为主的配子体细胞段，用培养皿培养，培养条件为温度13℃，光照强度10μmolphotons/(m2·s)，光周期8L:16D，培养液为添加F/2培养基的灭菌海水，培养过程中每3d更换一次培养液，从采苗到1cm需要40-50d；1cm以后即可出库。
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