CN110591999B - 一种极北海带配子体克隆系营养扩繁方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种极北海带配子体克隆系营养扩繁方法，属于海水藻类养殖领域，所述方法为取生长状态良好的极北海带雌、雄配子体，用匀浆仪破碎，将破碎后的配子体用500目筛绢过滤，将过滤后的配子体和培养液均匀的倒在每组放有玻璃片的培养皿中，培养条件为温度13℃，红光光强10μmol photons/(m2·s)，培养液为经过滤、高压灭菌冷却后的天然海水，培养液中的营养盐浓度为PO4 3‑‑P：0.6mg/L，NO3 ‑‑N：6mg/L，光周期24L:0D，培养20d，将配子体簇重新破碎并分瓶培养，从而获得大量的极北海带雌雄配子体克隆系。本发明可为海区极北海带配子体克隆育苗提供前提条件。

Description

一种极北海带配子体克隆系营养扩繁方法
技术领域
本发明属于海水藻类养殖领域，具体地涉及一种极北海带配子体克隆系营养扩繁方法。
背景技术
极北海带(Laminaria hyperborea)属于褐藻纲(Phaeophyceae)、海带目(Laminariales)、海带科(Laminariaceae)、海带属(Laminaria)，其自然分布于东北大西洋沿岸。极北海带是多年生的藻类，其平均寿命为8-15年，在收割后的区域，经过五六年时间可重新建立类似收割前的群体。其含有丰富的维生素和矿物元素常被用作肥料和动物饲料添加剂。极北海带褐藻胶含量较高且凝胶强度大，主要用途是用来提取褐藻胶，也可用来提取碘和甘露醇。极北海带还具有重要的生态价值，作为优势种极北海带可形成“海藻森林”，是海洋生物的索饵场、产卵场或栖息地，对维护海洋生物多样性发挥重要作用。极北海带藻场具有重要的碳汇功能，是地球上具有较高生产力的生态系统之一。极北海带作为大型藻类，是海区重要的初级生产者，具有吸收利用水体营养盐和增加溶解氧、吸附重金属离子的作用，同时具有生长快、易管理等特性，可应用于海洋生态系统富营养化和重金属污染的生物修复。总之，极北海带多年生、个体大及经济和生态价值高等优点，使其很有潜力作为海洋藻场建设及人工养殖的优良藻种。
极北海带是近年来从欧洲以配子体克隆系的方式引入到中国的，在国内尚无成熟的极北海带孢子体，目前只能利用配子体克隆系进行育苗。基于配子体克隆系的育苗方法，较使用孢子体的育苗方法，其产生的品种纯度更高且育苗时间不受季节限制。该方法的实现需解决配子体克隆系丰富培养的问题，即需了解配子体营养生长的适宜环境条件，以获得足够量的配子体克隆系，目前国内外尚无关于极北海带配子体营养扩繁方法的报道。在极北海带配子体实际培养过程中发现，参照其它近缘物种(如海带)相似的培养方法，极北海带配子体克隆系会出现两个问题：一是生长速度特别慢，二是特别容易形成单性生殖而导致配子体克隆系培养失败。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供一种极北海带配子体克隆系营养扩繁方法，所述方法能够抑制极北海带的单性生殖。
本发明是通过如下技术方案来实现的：
一种极北海带配子体克隆系营养扩繁方法，所述方法具体步骤如下：
取生长状态良好的极北海带雌、雄配子体，用匀浆仪破碎，将破碎后的配子体用500目筛绢过滤，将过滤后的配子体和培养液均匀的倒在每组放有玻璃片的培养皿中，培养条件为温度13℃，红光光强10μmol photons/(m2·s)，培养液为经过滤、高压灭菌冷却后的天然海水，培养液中的营养盐浓度为PO4 3--P：0.6mg/L，NO3 --N：6mg/L，光周期24L:0D，培养20d，将配子体簇重新破碎并分瓶培养，从而获得大量的极北海带雌雄配子体克隆系。
本发明与现有技术相比的有益效果：
本发明对极北海带配子体克隆生长的适宜温度、光照强度、营养盐浓度进行了研究，并在相对适宜条件下进行扩繁，从而获得了大量的雌、雄配子体克隆，将扩繁后的雌、雄配子体混合并采取适宜的培养后可得到正常的极北海带大苗，本发明可为配子体克隆的生产性培养提供理论依据和技术支持，为海区极北海带配子体克隆育苗提供前提条件。
附图说明
图1不同温度下营养生长的极北海带雄配子体形态：a：初始雄配子体细胞形态；b：10℃培养10d细胞形态；c：13℃培养10d细胞形态；d：16℃下培养10d细胞形态；e：400x下10℃培养10d时细胞形态；f：10℃培养20d细胞形态；g：13℃培养20d细胞形态；h：16℃下培养20d细胞形态。
图2不同光质下极北海带雄配子体形态：a白光，b红光。
图3不同光质下配子体细胞的Fv/Fm。
具体实施方式
下面通过实施例来对本发明的技术方案作进一步解释，但本发明的保护范围不受实施例任何形式上的限制。
实施例1
极北海带配子体来源于法国布列塔尼半岛海区，前期培养条件为：温度11-13℃，光强10μmol photons/(m2·s)，光周期14L︰10D，培养液为经过滤、高压灭菌冷却后的天然海水，营养盐浓度为PO4 3--P：0.4mg/L，NO3 --N：4mg/L。
取生长状态良好的极北海带雄配子体，用匀浆仪18000rpm破碎两次，每次15s，将破碎后的配子体用500目筛绢过滤，过滤后的配子体多为5-20个细胞段，平均面积为640μm2，将过滤后的配子体和培养液均匀的倒在每组放有玻璃片的培养皿中，实验因素设置见表1，实验方案见表2，其中氮磷浓度比为10:1。每隔3d进行拍照观察，并更换培养液；20d后取玻璃片拍照观察配子体大小，每次取30个视野，拍照30次，计算每个细胞簇的面积，求平均值。用相对生长速率(RGR，relative growth rate)为指标衡量环境因子对极北海带配子体生长的影响。计算公式为：
RGR＝[Ln(Wt/W0)/t]×100％
其中W0为初始配子体簇的面积(μm2)，Wt为实验结束时配子体簇的面积(μm2)，t为实验时间(d)，本实验中t＝20d。
表1正交实验因素水平设计水平
Figure BDA0002206899730000041
不同环境条件下配子体的相对生长速率如表2所示，极北海带配子体生长的最适条件为温度13℃、光强10μmol photons/(m2·s)、氮营养盐浓度6mg/L，其中，在实验设定的范围内，温度对极北海带配子体生长的影响最大，其次是氮营养盐，光强的影响最小。
表2极北海带雄配子体生长条件优化正交试验设计和极差分析
Figure BDA0002206899730000051
由不同环境条件下配子体的生长可知，温度的影响最大。观察不同温度下配子体的生长状态，破碎后的配子体如图1a所示，细胞个数5-20个，细胞直径5-9μm，平均直径7.2μm；不同温度下培养10d时配子体的生长状态如图1(b-e)所示，配子体顶部细胞或中部细胞向外突起，形似卵形，但并不发育，而是细胞进一步拉长，是形成多细胞丝状体的前奏，细胞内部色素块状分布，10℃细胞直径约6.7μm，13℃细胞直径约6.9μm，16℃细胞直径约7.1μm；不同温度下培养20d配子体的生长状态如图1(f-h)所示，丝状体细胞簇状生长，相对生长速率13℃>16℃>10℃。13℃下细胞簇状体面积最大，相对生长速率最大，但簇状体中伸出的外部细胞直径较小，为4-5μm，细胞色素较深，生长状态较好。10、16℃下细胞直径多为5-9μm，16℃下细胞颜色较浅。
实施例2
配子体不同光质实验：按实施例1所述方法破碎雄配子体，白光(色温5000-7000K)、红光(波长620-635nm)光强均为15μmolphotons/(m2·s)，其它培育条件为温度13℃，营养盐浓度为PO4 3--P：0.4mg/L，NO3 --N：4mg/L，20d后测量光系统II最大荧光产量Fv/Fm；将红光15μmol photons/(m2·s)下保存的雌配子体和弱光0.8μmolphotons/(m2·s)光强下保存的雄配子体同时分别测定Fv/Fm。
白光、红光下极北海带雄配子体营养生长的状态如图2所示，白光下配子体细胞直径5-8μm，平均直径7.1μm，细胞簇状生长，分枝多，40d左右时簇状体外部有小苗产生，且形状不规则，可能为配子体细胞的孤雄生殖；红光下配子体细胞直径为6-10μm，平均直径8.2μm，细胞较粗且分枝少，生长速度小于白光，但到60d左右时有少量小苗产生，红光可在一定程度上抑制极北海带配子体的发育，从而抑制配子体的单性生殖率。
不同光质下配子体细胞的Fv/Fm如图3所示。Fv/Fm值表示PSⅡ原初光能转化效率，在胁迫条件下该参数明显下降。白光弱光保存下雄配子体的Fv/Fm显著高于白光15μmolphotons/(m2·s)，且弱光下颜色较深，推测极北海带配子体在弱光下会增加色素含量，保持配子体的正常状态。相同光强时，白光下雄配子体的Fv/Fm显著高于红光，表明白光更有利于配子体生长。但白光下极北海带配子体易发生单性生殖，红光下配子体生长较慢，但单性生殖率明显降低，因此，红光更有利于极北海带配子体克隆系营养扩繁。
实施例3
一种极北海带配子体克隆系营养扩繁方法，所述方法具体步骤如下：
取生长状态良好的极北海带雌、雄配子体，用匀浆仪破碎，将破碎后的配子体用500目筛绢过滤，将过滤后的配子体和培养液均匀地倒在每组放有玻璃片的培养皿中，培养条件为温度13℃，红光光强10μmol photons/(m2·s)，培养液为经过滤、高压灭菌冷却后的天然海水，培养液中的营养盐浓度为PO4 3--P：0.6mg/L，NO3 --N：6mg/L，光周期24L:0D，培养20d，将配子体簇重新破碎并分瓶培养，从而获得大量的极北海带雌、雄配子体克隆系。此方法获得的雌、雄配子体克隆系中细胞单性生殖的概率大大降低，可用于配子体克隆系的育苗。

Claims (1)

1.一种极北海带配子体克隆系营养扩繁方法，其特征在于所述方法为取生长状态良好的极北海带雌、雄配子体，用匀浆仪破碎，将破碎后的配子体用500目筛绢过滤，将过滤后的配子体和培养液均匀的倒在每组放有玻璃片的培养皿中，培养条件为温度13℃，红光光强10μmolphotons/(m2·s)，培养液为经过滤、高压灭菌冷却后的天然海水，培养液中的营养盐浓度为PO4 3--P：0.6mg/L，NO3 --N：6mg/L，光周期24L:0D，培养20d，将配子体簇重新破碎并分瓶培养，从而获得大量的极北海带雌、雄配子体克隆系。
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