CN1146290A

CN1146290A - 鲜活单细胞海洋红酵母生态饵料及其生产方法

Info

Publication number: CN1146290A
Application number: CN95112038A
Authority: CN
Inventors: 王世权
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1995-09-27
Filing date: 1995-09-27
Publication date: 1997-04-02

Abstract

一种鲜活单细胞海洋红酵母生态饵料，是从近海海水中用超滤膜抽滤分离、纯化，再经增殖培养、斜面培养而成菌种，再经活化接代培养可用于生产。生产是经A、B两步扩大培养、种子缶扩大培养、生产缶扩大培养和产品制备而得含海洋红酵母浓缩饵料，其浓度达10～100亿细胞/ml海水，海洋红酵母个体为3～5×4～6μm，产品经对虾、牡蛎、海参、扇贝、河蟹育苗中试用证明这种饲料对提高幼体各阶段的变态、成活率、加快幼体生长速度及净化水质均有较好效果。

Description

鲜活单细胞海洋红酵母生态饵料及其生产方法

本发明涉及的是经济水产品育苗饵料及生产方法，特别是鲜活单细胞海洋红酵母生态饵料及其生产方法。

鱼、虾、贝、蟹等经济水产品的人工饲养中，幼体喂养是一个十分重要的环节。在以住常使用的饵料中，蛋黄、豆浆的效率很低且又易造成污染水质；医用或食用的酵母在海水中不能生存造成为死体的悬浮不好；单胞藻有较好的效果，但仅是植物性饲料，特别是大量培养困难而常常供不应求。海洋酵母(Marine yeast)在日本已有大量培养的报导(湛江水产专科学校主编《海洋饵料生物培养》农业出版社1980年版P21～27)，实际上报导的生产配方仅适于海洋白酵母(Whiteyeast)的规模生产，而海洋白酵母因产生粘性物较多，高浓度培养易产生“凝集沉淀”现象，显微镜下可见十几个甚至几十个酵母细胞“联合为一体”而无法分开，影响幼体对鲜活菌体的食用效果。其他海洋酵母饵料生产未见有报导。

本发明的目的是提供一种方法从海洋中分离、纯化海洋红酵母菌种，并能大规模培养、生产鲜活单细胞海洋红酵母饵料。

本发明的海洋红酵母菌种是从海水中分离、纯化而得到的，具体方法是在无菌条件下将海水用超滤膜进行抽滤，滤毕将超滤膜过滤面朝上平放在有抗菌素的平面培养基上，于18～20℃培养3～7天，超滤膜上有海洋红酵母生长，将红酵母菌落移至平板培养基上划线，置18～20℃培养2～3天，如不纯则再次用绅线法分离。在显微镜下观察到的纯海洋红酵母接种至斜面培养基上，18～25℃下培养2～5天后，于4℃以下保存。其平面和种子斜面培养基配方为：

平板培养基斜面培养基海水 100ml 100ml葡萄糖 1～5g 0.6～2.0g酵母膏 0.3～2.0g 0.1～0.4g多价蛋白胨 0.6～4.0g麦芽汁 1～5g 0.1～0.6gMgSO₄7H₂O 0.5～4.0g 0.05～0.15g琼脂 2～4g氯霉素 1.8～10.0g青霉素 2.0～10.0g(NH₄)₂SO₄ 0.1～0.8gPH 4.2～5.0 4.5～5.4其中PH可用乳酸调节(以下同)。菌种在4℃以下保存。根据菌种活性，必须定期进行复状。

菌种在使用前需进行活化，即将菌种再接种到活化培养基上，在18～25℃下培养，并接代培养2～3代，使其扩大繁殖并成茁壮菌落。生产时再将菌种经A、B两级扩大培养，种子缶、生产缶扩大培养和产品制备的过程而完成。各阶段培养基的配方如下表，

菌种活化扩大A 扩大B 种子缶生产缶海水 100ml 100ml 100ml 100ml 100ml葡葡糖 1.2～3.8g 1.8～4.8g 1.6～3.8g 2.8～4.5g 1～5g酵母膏 0.3～1.8g 0.2～0.8g 0.3～0.9g 0.2～0.6g 0.1～0.6g蛋白胨 0.6～1.8g 0.1～1.2g多价蛋白胨0.6～2.0g麦芽汁 0.6～5.0g 1.0～6.0g 1.3～4.8g 1～6g 2.6～7.8gMgSO₄·7H₂O 0.1～0.8g 0.1～0.7g 0.1～0.6g(NH₄)₂SO₄ 0.4～0.78g 0.8～1.8g 1.5～3.5gKH₂PO₄ 0.5～0.35g 0.3～0.8g 0.1～0.5g 0.1～0.7g尿素 0.1～0.4g谷氨酸钠 0.3～0.8g 0.01～0.06gH₃PO₄ 0.1～0.4gPH 4.4～5.0 4.6～5.6 4.6～5.8 4.6～5.8 4.6～5.8其具体操作方法为：

(1)扩大培养A：在无菌条件下，于20～80ml的培养基中接种两环菌落，在20～28℃下振荡培养2～4天。

(2)扩大培养B：培养量为扩大培养A的8～25倍。在无菌条件下，将已完成扩大培养A的培养液移至装有培养基的B缶中，在22～25℃下进行深层通气培养2～4天，通气量为0.008～0.028m³/h。

(3)种子缶培养：培养量为扩大培养B的10～40倍。在无菌条件下将已完成扩大培养B的培养液移至装有培养基的种子缶中，在18～26℃下进行深层通气培养2～4天，通气量为0.005～0.016m³/h。

(4)生产缶培养：培养量为种子缶培养的15～50倍。在无菌条件下，将已完成种子缶培养的培养液移至装有培养基的生产缶中，在18～26℃下进行深层通气培养2～4天，通气量高于种子缶6～18个百分点。

(5)产品制备：将生产缶中已完成培养的培养液进行离心，最好用高速离心过滤(3000～6000r/min)，将过滤固体加消毒海水稀释成产品。产品含海洋红酵母为10～100亿细胞/ml海水，海洋红酵母个体为3～×4～6μm。

本发明产品在对虾、太平洋牡蛎、海参、扇具以及河蟹育苗中试用，证明对高幼体各阶段的变态、成活率、加快幼体生长速度、净化水质，具有较好的效果。

本发明就产品及生产方法而言，其突出特点是：(1)是一种新的、活的、动物性的经济水产品饲料，具有①是一种单细胞、粒度适中的嗜口性强的饲料；②在水中分散性极好，每毫升100亿细胞的菌体悬液自然沉降18h，仅15％沉降；海洋白酵母投入水中即成凝集块；③极富营养，不仅含有蛋白质、糖类、矿物质、维生素和生长激素，还含有一般饵料所缺少的不饱和脂肪酸和多种酶，有利于幼体消化吸收；④投入使用后而成为种群优势而能抑制有害杂菌繁殖、分解有害的有机物及氨态氮、硫化氢等，净化水质而起到对幼体育苗的生态学保护作用，这是其他饵料所不具备的特点：⑤易于保存及运输，常温存放10天，冷藏可保存30天，速冻后冷藏可保存6个月。(2)从近海海水中成功地分离、纯化海洋红酵母；提供了包括海洋红酵母分离、纯化、菌种保存、菌种活化和多级培养的条件、培养基的配方等工艺条件，成功地实现了连续化、高浓度、高效率的工业化生产。

实例

1、超滤膜分离、纯化海洋红酵母。先将超滤膜、滤器等用具无菌处理，用抽滤法过滤新取近海海水100ml，滤毕用无菌镊子取滤膜面超上平放在灭菌后新加抗菌液的培养基上，18～20℃培养6天，培养皿上长出60个砖红色红酵母菌落，将其接种在平面培养基上培养，两次划线分得纯种，再接种在斜面培养基上培养、保存。其培养基配方为：

分离保存海水 100ml 100ml葡萄糖 3g 1.5g酵母膏 0.8g 0.3g多价蛋白胨 2g麦芽汁 3g 0.4MgSO₄7H₂O 0.8g 0.1(NH₄)₂SO₄ 0.5琼脂 4gPH 4.8 5.0氯霉素 80万单位 8g青霉素 80万单位 8g溶液的PH用乳酸调节。

2、菌种活化。使用前将菌种转至平板培养基上培养2～3代，其配方为：海水 100葡萄糖 2.5g酵母膏 1.2g多价蛋白胨 1.5g麦芽汁 2.0gFeSO₄7·H₂O 0.05gNa₂HPO₄12H₂O 0.05gKH₂PO₄ 0.28gPH 4.8

3、扩大培养。分A与B两阶段：

A、在玻璃三角瓶中装有50ml(10个角瓶，共500ml)培养基，灭菌后接种两环菌种，于23℃、80转/分种摇床上恒温培养48h，菌种密度可达12，5亿细胞/ml。

B、在卡氏缶中加入9升培养基，灭菌处理后将A培养液接入缶中，于22～25℃下，通气量为0.02m³/h下培养48h，菌密度为15亿细胞/ml。A、B培养基培方为：

A B海水 100ml 100ml葡萄糖 3.5g 4g酵母膏 0.6g 0.6g麦芽汁 5g蛋白胨 1.2g尿素 0.3g谷氨酸钠 0.6g正磷酸 0.3gPH 4.8 5.0(NH₄)₂SO₄ 0.6gKH₂PO₄ 0.5gMgSO₄·7H₂O 0.6gFeSO₄ 0.02gNa₂HPO₄ 0.05g

3、种子缶扩大培养。在种子缶中装180升培养基，灭菌处理后将扩大B阶段的培养液移入扩大培养缶中，22～25℃下，通气量为0.007m³/h培养50h，菌密度为12亿细胞/ml。

4、生产缶扩大培养。在装有3600L(3.6吨)培养基的生产缶中进行灭菌处理，然后将种子缶的培养液移至生产缶中，在22～26℃，通气量为0.009m³/h，搅拌培养60h，菌密度为12亿细胞/ml。种子缶与生产缶培养基配方为：

种子缶生产缶海水 100ml 100ml葡萄糖 3.5g 4.5g酵母膏 0.4g 0.4g麦芽汁 6.0g 6.0g(NH₄)₂SO₄ 1.0g 3.0gKH₂PO₄ 0.4g 0.4gMgSO₄·7H₂O 0.4g 0.4g蛋白胨 0.6g谷氨酸钠 0.05g生物素 8ppmNa₂HPO₄·12H₂O 0.04gPH 5.0 5.2

5、产品制备。将生产缶培养液进行离心过滤，离心固体物加消毒海水稀释至100亿细胞/ml。

Claims

1、一种海洋酵母生态饵料，其特征为是一种浓缩、鲜活、单细胞海洋红酵母液态饵料，海洋红酵母细胞个体为3～5×4～6μm，含海洋红酵母为10～100亿细胞/ml海水。

2、如权利要求1海洋酵母生态饵料的生产方法，其特征为在无菌条件下将海洋红酵母菌种进行A、B两级扩大培养，种子缶、生产缶扩大培养及产品制备而完成；各步培养基配方为：

扩大A 扩大B 种子缶生产缶海水 100 100 100 100葡萄糖 1.8～4.8g 1.6～3.8g 2.8～4.5g 1～5g酵母膏 0.2～0.8g 0.3～0.8g 0.2～0.6g 0.1～0.6g蛋白胨 0.6～1.8g 0.1～1.2g麦芽汁 1.0～6.0g 1.8～4.8g 1～6g 2.6～7.8gMgSO₄·7HO₂ 0.1～0.8g 0.1～0.7g 0.1～0.6g生物素 5～10ppmFeSO₄₇H₂O 0.01～0.08gNa₂HPO₄·12H₂O 0.03～0.08g 0.03～0.08g(NH₄)₂SO₄ 0.4～0.78g 0.8～1.8g 1.5～3.5gKH₂PO₄ 0.3～0.8g 0.1～0.5g 0.1～0.7g尿素 0.1～0.4g谷氨酸钠 0.3～0.8g 0.01～0.06gH₃PO₄ 0.1～0.4gPH 4.6～5.6 4.6～5.8 4.6～5.8 4.6～5.8其操作方法为：

(1)活化培养：18～25℃下培养2～3天；

(2)扩大培养A：无菌条件下，在20～80ml培养基中接种2环菌落，20～28℃下振荡培养2～4天；

(3)扩大培养B：培养量为A的8～25倍，无菌条件下将已完成培的A的培养液移至B的培养基中，22～25℃进行深层通气培养2～4天，通气量为0.008～0.028m³/h；

(4)种子缶培养：培养量为B的10～40倍，无菌条件下将已完成培养的B移至装有培养基的种子缶中，18～26℃进行深层通气培养2～4天，通气量为0.005～0.016m³/h；

(5)生产击培养：培养量为种子缶培养的15～50倍，无菌条件下将已完成培养种子缶培养液移至装有培养基的生产缶中，18～26℃进行深层通气培养2～4天，通气量高于种子缶6～18个百分点；

(6)产品制备：将完成培养的生产缶培养液进行离心，用消毒海水稀释海洋红酵母菌体至标准要求。

3、如权利要求2海洋酵母生态饵料的生产方法，其特征为所述的海洋红酵母菌种是从近海海水中分离、纯化，再经增殖培养，斜面培养成菌种，经活化而成，其操作方法为：

(1)海洋红酵母菌种的分离、纯化：将海水用经灭菌处理的超滤膜进行抽滤，滤毕将超滤膜面朝上移入平面培养基上，18～20℃培养3～7天，再将滤膜上生长的海洋红酵母菌种移入平板培养基上划线，18～20℃培养2～3天，然后将菌种移入斜面培养基上，18～25℃培养2～5天于4℃以下保存；

(2)活化，将菌种接种在活化培养基上，18～25℃下培养，2～3代后成为扩大培养所需菌种；

各段使用培养基配方为：

平面斜面活化海水 100ml 100ml 100ml葡萄糖 1～5g 0.6～2.0g 1.2～3.8g酵母膏 0.3～2.0g 0.1～0.4g 0.3～1.8g多价蛋白胨 0.6～4.0g 0.6～2.0g麦芽汁 1～5g 0.1～0.6g 0.6～5.0gMgSO₄·7H₂O 0.5～4.0g 0.05～0.15g琼脂 2～4g氯霉素 1.8～10.0g青霉素 2.0～10.0g(NH₄)₂SO₄ 0.1～0.8gFeSO₄·7H₂O 0.01～0.08gNa₂HPO₄.12₂H₂O 0.03～0.08gKH₂PO₄ 0.15～0.35gPH 4.2～5.0 4.5～5.4 4.4～5.0

4、如权利要求2或3海洋酵母生态饵料的生产方法，其特征为所有培养基的要求PH值均可用乳酸调节来达到。