CN101422125A - 主枝片段分蘖法快速繁殖鼠尾藻幼苗的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及鼠尾藻的繁育，具体地说是主枝片段分蘖法快速繁殖鼠尾藻幼苗的方法。具有如下步骤，1)取鼠尾藻藻株主枝用体积浓度75％的酒精浸泡25～23秒，然后用大量消毒海水快速冲洗3～4次；2)将藻株主枝剪段，片段长2－3cm，片段放入容器中培养，以通用的ES海水培养液为培养基，进行通气培养，当培养进行到片段的分蘖枝可以达到1.5～3.5cm时，将片段从容器中取出，用消毒的手术刀将分蘖枝切割下来；3)将切割下来分蘖枝采用步骤2)的条件继续增殖培养，或者将切割下来分蘖枝直接用于大规模夹苗海上养殖。本发明操作简单，费用低廉，再生的幼苗可以循环生产，对自然环境起到明显的保护作用。

Description

主枝片段分蘖法快速繁殖鼠尾藻幼苗的方法
技术领域
本发明涉及鼠尾藻的繁育，具体地说是主枝片段分蘖法快速繁殖鼠尾藻幼苗的方法。
背景技术
鼠尾藻藻体黑褐色，形似鼠尾，高3～50厘米，最高可达120厘米。生长在中潮带岩石上或石沼中。全年可见，生长盛期3～7月。广分布于我国沿海。鼠尾藻营养丰富，藻胶含量低，是海参等重要海产品的优质饵料。鼠尾藻以前很少被人利用，但是随着海参等海产品养殖规模的急剧扩大，自然生长的鼠尾藻被大量采集，目前不少养殖区域鼠尾藻资源已近枯竭。
鼠尾藻资源匮乏，饲料质量低劣，在很大程度上限制了我国海水养殖产业的健康发展。由于市场需求，近来我国沿海的很多地区开展了鼠尾藻的人工养殖活动，也有有关养殖成功的报道。然而，人为养殖活动的开展并没有抑制野生鼠尾藻日益遭受破坏的趋势。原因是现有的鼠尾藻人工养殖技术本身的缺陷，海上夹苗养殖需要带有固着器的整株海藻，因此，养殖规模的扩大，反而对自然环境下的鼠尾藻造成更加严重的破坏作用。
自然条件下鼠尾藻的有性繁殖季节性特别强，而且在自然条件下，鼠尾藻只有在石质地质的沿岸区域才能自然生存和繁殖，泥底、沙底、泥沙地质的条件都不能满足它的生存条件。因此，具有营养反之特点的人工夹苗养殖法是发展鼠尾藻养殖产业的一个关键途径，而建立一个快速而节约资源的育苗方法又是解决人工养殖对自然环境造成破坏作用的关键。实验室条件下，我们曾经成功地建立了采用组织培养鼠尾藻叶片法大量繁殖其幼苗的方法，这种方法在很大程度减少了鼠尾藻的育苗对自然环境的破坏作用。然而这种方法也有自身的缺点，主要是它的培养周期比较长，从幼叶培养到能够夹苗的长度，至少需要6-8个月的时间。另外，叶片组培法也需要较高的费用。
发明内容
本发明成功地克服了以上的缺点。筛选出适合营养反之培养类型的藻株，采用培养鼠尾藻主枝片段的方法，在短期内可以大量产生适合夹苗养殖的幼苗，而且操作简单，费用低廉，再生的幼苗可以循环生产，对自然环境起到明显的保护作用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
主枝片段分蘖法快速繁殖鼠尾藻幼苗的方法，具有如下步骤，
1)取鼠尾藻藻株主枝用体积浓度75％的酒精浸泡25～23秒，然后用大量消毒海水快速冲洗3～4次；
2)将藻株主枝剪段，片段长2-3cm，片段放入容器中培养，以通用的ES海水培养液为培养基，进行通气培养，培养液每2-5天更换一次；培养温度为15～17℃，光照强度为20～30μmol/m2pers，光照周期为：光照：黑暗＝12-14：12-10h；当培养进行到片段的分蘖枝可以达到1.5～3.5cm时，将片段从容器中取出，用消毒的手术刀将分蘖枝切割下来；
3)将切割下来分蘖枝采用步骤2)的条件继续增殖培养，或者将切割下来分蘖枝直接用于大规模夹苗海上养殖。
鼠尾藻样品采集后，用毛刷和镊子清除表面的杂物和附着生物；用质量浓度1‰的KMnO4处理1.5～2分钟，然后用大量消毒海水冲洗3～4次。
鼠尾藻样品暂养条件为，培养液为消毒海水，内含0.1mol/L NaNO3以及0.1mol/L NaH2PO4；光照周期为光照：黑暗＝9：15h，光照强度为18-22μmol/m2per s，由白色荧光灯提供。
所述步骤2)中的培养基组成为ES培养基+BG-11海水化营养液。
本发明具有如下优点：
(1)育苗所用时间短。实验结果显示，要达到夹苗所用长度，只要将藻株片段培养4个周即可，而且夹苗培养后，新生植株的适应能力和生长速度与野生萌芽植株没有明显差异。
(2)育苗费用低廉。在组织培养前期，需要无菌操作，而一周后可以改用煮沸的海水甚至是天然的过滤海水。另外，培养基费用低廉。
(3)产苗量大。藻株片段的成活率为100％。一个3厘米长的片段，培养一个月后可以产生10～15株幼苗。
(4)对保护野生鼠尾藻意义重大。本发明前期无需大量的野生藻株，培养后期可以循环培养不用采集野生的藻株。
(5)发现了适合人工养殖的鼠尾藻类型。实验结果显示，在相同的组织培养时间内，类型B(图1，B)的分蘖长度与生物量分别是类型A(图1，A)的1.2倍与1.4倍；海上夹苗培养后，采收期相同绳长的类型B的生物量分别是类型A生物量的1.4～2.2倍。
(6)是鼠尾藻种质保存的另一种形式。
附图说明
图1为不同类型的两种鼠尾藻图片；该藻于2005年8月2号采自青岛市第二海水浴场潮间带。A：藻株主枝细而且叶片稀疏，生物量相对小；B：藻株主枝粗壮而且叶片密度大，生物量相对大。例标尺，1cm。
图2为实验过程中采用的不同类型的藻株主枝及片段其在前2个周内的发育过程。
图3为切割下的分蘖幼苗及其夹苗后的发育状况；A和B：分别为类型A和类型B主枝片段培养23天后的分蘖幼苗；C：类型B分蘖幼苗夹苗养殖1周后的状况。例标尺，1cm。
图4为海上夹苗养殖2个月分蘖幼苗的发育状况；A：类型A分蘖幼苗的发育状况；类型B分蘖幼苗的发育状况。例标尺，1cm。
具体实施方式
实施例1
自然条件下的鼠尾藻雌雄异株，单从形态特征上很难区分。然而，从外部形态上却可以将鼠尾藻分为两种不同的类型。一种类型的藻株叶片稀疏，主茎纤细(图1A)；另一种类型的藻株叶片厚密而主茎粗壮(图1B)，统计数据显示，同样长度的两种不同类型的主枝后者是前者生物量的1.3～2.1倍。
本发明挑选两种不同类型的藻株主枝分别进行培养实验。海藻样品采集后，用毛刷和镊子清除表面的杂物和附着生物。挑选出较长的主枝，用质量浓度1‰的KMnO4处理1.5～2分钟，然后用大量消毒海水冲洗3～4次。若需要暂养，暂养条件为：圆形水族缸内(r＝20cm，h＝35cm)培养，培养液为消毒海水，内含0.1mol/L NaNO3以及0.1mol/L NaH2PO4。光照周期为9：15h(光照：黑暗)，光照强度为～20μmol/m2 per s，由白色荧光灯提供。
消毒海水为在0.1MPa-0.15MPa压力条件下灭菌25-40分钟的高压灭菌天然海水；
组培实验在超净工作台上进行，所有用具器皿均高压消毒。剪段培养前，将藻株主枝用体积浓度75％的酒精浸泡25～23秒，然后用大量消毒海水快速冲洗3～4次。剪段，片段长2.5-3cm。消毒的片段放入容积为20升的广口瓶中培养。培养基为：通用的ES海水培养液，进行通气培养，培养液每4天更换一次。其它培养条件为：温度15～17℃。光照强度为20～30μmol/m2per s。光照周期为：14：10h(光照：黑暗)。当培养进行到一个月左右时，大部分片段的分蘖枝可以达到1.5～3.5cm。这时，将片段从瓶中取出，用消毒的手术刀将分蘖切割下来，切割下来分蘖幼苗或者继续增殖培养，或者直接用于大规模夹苗海上养殖。
附ES培养基(通用的ES海水培养液)组成：
 
成分 100毫升蒸馏水
NaNO3 350mg
Na2glycerophosphate5 H2O 50mg
Fe-solution 25mL
PII metal-solution 25mL
vitamin B12 10microg
thiamine 0.5mg
 
biotin 5 micro g
Tris buffer(Sigma Co.) 500mg
Fe-solution：
在500毫升溶解351毫克Fe(NH4)2(SO4)26H2O以及300毫克Na2EDTA.
PII metal solution：
 
成分 100毫升蒸馏水
Na2EDTA 100mg
H3BO3 114mg
FeCl36H2O 4.9mg
MnSO4H2O 16.4mg
ZnSO47H2O 2.2mg
CoSO4.7H2O 0.48mg
实验结果
两种不同藻株的成活率均为100％。组织培养一个月后可以产生大量适合佳苗养殖的分蘖再生植株。一个3厘米长的片段，培养一个月后可以产生10～15株幼苗。发现了适合人工养殖的鼠尾藻类型。实验结果显示，在相同的组织培养时间内，类型B(图1B)的分蘖长度与生物量分别是类型A(图1A)的1.2倍与1.4倍；海上夹苗培养后，采收期相同绳长的类型B的生物量分别是类型A生物量的1.4～2.2倍。
实施例2
本实验的进行时间为2005年8月7号到2005年11月28号。样品采自青岛第二海水浴场潮间带(35.35°N，119.30°E，水面以下10-35cm)。
该藻于2005年8月2号采自青岛市第二海水浴场潮间带。实验采用不同类型的主枝(图2A)，分别剪段后进行培养，在两周内不同类型主枝片段的发育过程见图2B和图2C。
培养条件为：温度17℃；光照强度25μmol/m2per s；光照周期12：12h(光照：黑暗)；
采用的培养基为：ES培养基+BG-11海水化营养液，即于通用的ES海水培养液中加入BG-11配方的成份；
BG-11配方：H3BO3 2.86μg/l，MnCl.4H2O 1.81μg/l，ZnSO4·7H2O0.222μg/l，NaMoO4·2H2O 0.39μg/l，CuSO4·5H2O 0.079μg/l，Co(NO3)2·6H2O 0.0494μg/l；
其它培养条件同上述实施例1的实验操作；
图2中，A：不同类型的藻株主枝，1和3为类型A的主枝，而2和4为类型B的主枝；B：类型A藻株主枝片段的在前两周的再生过程，1为刚剪段时的片段，2为第6天的再生状况，3为第10天的再生状况，4为第14天的再生状况；和C：类型B藻株主枝片段的在前两周的再生过程，1为刚剪段时的片段，2为第7天的再生状况，3为第14天的再生状况。例标尺，1cm。
培养3周后，分蘖幼苗生长情况见图3A和3B。夹苗培养一周后，类型B的分蘖幼苗长度可达4.3～5.5cm(图3B)，而同期的类型A分蘖幼苗仅为2.9～4.6cm。
海上夹苗养殖两个月后，类型A和类型B的分蘖幼苗分别发育成熟(图4)，但单株类型B的生物量为单株类型A的2.07倍。

Claims (4)

1.主枝片段分蘖法快速繁殖鼠尾藻幼苗的方法，具有如下步骤，
1)取鼠尾藻藻株主枝用体积浓度75％的酒精浸泡25～23秒，然后用大量消毒海水快速冲洗3～4次；
2)将藻株主枝剪段，片段长2-3cm，片段放入容器中培养，以通用的ES海水培养液为培养基，进行通气培养，培养液每2-5天更换一次；培养温度为15～17℃，光照强度为20～30μmol/m2per s，光照周期为：光照：黑暗＝12-14：12-10h；当培养进行到片段的分蘖枝可以达到1.5～3.5cm时，将片段从容器中取出，用消毒的手术刀将分蘖枝切割下来；
3)将切割下来分蘖枝采用步骤2)的条件继续增殖培养，或者将切割下来分蘖枝直接用于大规模夹苗海上养殖。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：
鼠尾藻样品采集后，用毛刷和镊子清除表面的杂物和附着生物；用质量浓度1‰的KMnO4处理1.5～2分钟，然后用大量消毒海水冲洗3～4次。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：鼠尾藻样品暂养条件为，培养液为消毒海水，内含0.1mol/LNaNO3以及0.1mol/L NaH2PO4；光照周期为光照：黑暗＝9：15h，光照强度为18-22μmol/m2per s，由白色荧光灯提供。
4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中的培养基组成为ES培养基+BG-11海水化营养液。
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