CN110771495B - 一种降低海带种质孤雌生殖孢子体畸形率的方法 - Google Patents

一种降低海带种质孤雌生殖孢子体畸形率的方法 Download PDF

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Abstract

本发明首先提供一种促进海带雌配子体排出卵子的方法，首先将海带种质丝状体在海水中进行复苏，然后将海带种质进行粉碎，粉碎液进行过滤，获得长度为3‑6个细胞的丝状体片段；再将获得的丝状体片段在光照强度6000±300lx，光照周期是L﹕D＝12h﹕12h，温度为15±1℃条件下进行通气悬浮培养来收集卵子；然后将收集的卵子进行培养获得海带幼孢子体，对海带幼孢子体进行培养，在两列细胞的幼孢子体时期采用流水培养。本发明的方法使海带雌性种质在11‑13天就能排卵，缩短了排卵时间；而且排卵率高并且同步好，2天内排卵率能达到65‑70％；卵子发育率能达到70‑80％。所建立的幼孢子体培养方法能使幼孢子体畸形率降低到50％‑60％。

Description

一种降低海带种质孤雌生殖孢子体畸形率的方法
技术领域
本发明属于海带繁育技术领域，具体涉及一种降低海带雌性种质孤雌生殖畸形率方法。
背景技术
海带是具异型世代交替的大型经济褐藻，自然生长的海带生活史包括短期的配子体和长期的孢子体阶段，成熟海带孢子体放散产生游孢子，游孢子附着后发育为雌、雄配子体，而配子体分别产生精卵，卵子受精形成合子，合子发育为幼孢子体。但是海带也存在雌性种质排出卵子，卵子分裂成幼孢子体的孤雌发育的途径。
孤雌生殖对于育种具有重要的意义，它如果能够发育成成体，则能够加速后代的纯合速度，使优良性状更加稳定。科研人员利用种海带放散的游孢子产生的配子体或者室内保存的海带雌配子体克隆进行了种质孤雌发育的诱导，产生了幼孢子体。由于海带的杂合性很高，能够产生一定数量正常的孢子体，说明孤雌生殖的孢子体是能够正常生长的。但是孤雌生殖的畸形率很高，一般达到80％左右，这种现象可能有两个原因，一是雌性孢子体发育过程中的染色体的缺失或者单倍体的有害基因的表达，二是由于培育的环境条件不符合孤雌生长的特殊要求。
发明内容
本发明的目的是提供一种降低海带雌性种质孤雌生殖畸形率的方法，从而能够使长期的保存海带雌性种质排出卵子，同步的进行发育，改善育苗条件，降低幼孢子体的畸形率；从而弥补现有技术的不足。
本发明首先提供一种促进海带雌配子体排出卵子的方法，包括如下的步骤：
首先将海带种质丝状体在海水中进行复苏，
所述的复苏条件如下：温度为15±1℃，光照强度为500-1000lx，每小时升高500lx，直至6000lx；
然后将海带种质进行粉碎，粉碎液进行过滤，获得长度为3-6个细胞的丝状体片段；
所述的粉碎，实施例的一种具体记载是采用组织搅碎机粉碎，1500转/min，粉碎30s
所述的过滤，优选是采用单层500目筛绢过滤；
再将获得的丝状体片段在光照强度6000±300lx，光照周期是L﹕D＝12h﹕12h，温度为15±1℃条件下进行通气悬浮培养；
所述的培养液组成如下：4ppm的NO3-N、0.8ppm的PO4-P、1ppm的FeC6H5O7-Fe、4ppm的GeO2、0.5μg/L的VB12；
经过11天，约10％的海带配子体细胞有卵子排出，经过13天，65-70％的配子体细胞有卵子排出，排卵同步较好，从而减少由于发育不同步和培养环境改变带来的畸形现象。
本发明还提供一种诱导海带幼孢子体产生的培养方法，其步骤后如下：
首先将收集的卵子进行培养获得海带幼孢子体，培养条件是：光照强度3000±100lx，光照周期是L﹕D＝14h﹕10h，培养温度为10±1℃；
培养液组成为：4ppm的NO3-N、0.8ppm的PO4-P、4ppm的GeO2、1.0ug/L的VB12。
对海带幼孢子体进行培养，其中
1)单列细胞的时期的培养条件如下：
光照强度1000-1500lx，光照周期是L﹕D＝14h﹕10h；培养温度为10±1℃；培养液组成为：4ppm NO3-N、0.4ppm PO4-P、4ppm GeO2；
2)两列细胞的幼孢子体时期：
采用流水培养方式添加营养液，培养液组成如下：8ppm NO3-N、0.4ppm PO4-P、4ppmGeO2；光照强度1000-1500lx，光照周期是L﹕D＝14h﹕10h；培养温度为12±1℃。
其中流水培养方式添加营养液，优选为前三天流速为0.10-0.15米/分钟，此后流速为0.20-0.25米/分钟。
本发明的方法使海带雌性种质在11-13天就能排卵，缩短了排卵时间；而且排卵率高并且同步好，2天内排卵率能达到65-70％；卵子发育率能达到70-80％。所建立的幼孢子体培养方法能使幼孢子体畸形率降低到50％-60％。
附图说明
图1：产生凸起将要排卵的雌配子体丝状体照片图；
图2：单条丝状体凸起的细胞照片图；
图3：放散的卵子照片图；
图4：卵子发育成幼孢子体照片图(圈内为畸形孢子体)；
图5：30天苗绳上附着的幼孢子体照片图；
图6：50天苗绳上附着的幼孢子体照片图。
具体实施方式
本发明利用长期保存在低温弱光条件下的海带雌配子体进行发育诱导，通过培养液和光温条件的组合，能够在16天左右诱导出海带幼孢子体，并且发现两列细胞的幼孢子体时期是畸形产生的关键时期，需要改善培育条件，加快藻体新陈代谢，促使海带健康生长，从而有效的降低了畸形率。
以下对本发明技术方案的具体实施方式详细描述，但本发明并不限于以下描述内容：
实施例1：促进海带种质排出卵子
1)准备孤雌发育种质材料
从种质库中选择色泽深褐，无杂藻污染的海带(Saccharina japonica)雌性种质丝状体，倒出一部分种质用于诱导材料。用于诱导种质的放在500ml无菌海水中。
2)诱导前处理
将用于诱导的种质在诱导前24h置于诱导培养箱中，培养温度为15±1℃，光源为荧光灯管，光照为1000lx，每小时升高500lx，直至6000±200lx。
3)诱导排卵处理
将种质用组织搅碎机粉碎，1500转/min，粉碎30s，重复做一次。然后用单层500目筛绢过滤3次，获得长度为3-6个细胞的丝状体片段。
将打碎的细胞段放在培养箱中培养，培养条件是：光源是荧光灯，光照强度6000±200l x，光照周期是L﹕D＝12h﹕12h。培养温度为15±1℃。每三天更换1/5的培养液。通气悬浮培养。
培养液组成为：NaNO3-N：4ppm，KH2PO4-P：0.8ppm，FeC6H5O7-Fe：1ppm，GeO2：ppm，VB120.5ug/L。
经过11天，随机观察配子体丝状体片段，发现有10％的配子体细胞排出卵子，到第13天，有67％的配子体细胞排出卵子。
统计方法是：(卵子数+幼孢子体数)/(丝状体片段的细胞数)
4)诱导卵子发育：
停止通气，使排出的卵子沉降到培养容器底部，底部预铺苗帘和玻片，继续培养。培养条件是：光源是荧光灯，光照强度3000lx，光照周期是L﹕D＝14h﹕10h。培养温度为10±1℃。每三天更换1/5的培养液。
培养液组成为：NaNO3-N：4ppm，KH2PO4-P：0.8ppm，GeO2：4ppm，VB121.0ug/L。
经过2天后，在显微镜下随机统计卵子发育分裂，统计方法如下：随机观察3个视野的20个正常卵子、不正常的卵子和幼孢子体，共60个；
发育率＝幼孢子体数/(正常卵子+不正常的卵子+幼孢子体)。
结果表明有72％的卵子产生分裂，其余的细胞内容物分解死亡或者仍是卵子状态。
5)幼孢子体生长：
将发育生成的幼孢子体放在培养箱中培养，培养条件是：光源是荧光灯，光照强度1000-1500lx，光照周期是L﹕D＝14h﹕10h。培养温度为10±1℃。每三天更换1/3的培养液。通气培养。
培养液组成为：NO3-N：4ppm，PO4-P：0.4ppm，GeO2：4ppm。
待50％以上的卵细胞分裂至两列细胞的幼孢子体时，在室内用流水槽培养，添加营养液，培养液浓度为：8ppm NO3-N、0.4ppm PO4-P、4ppm GeO2。光照强度1000-1500lx，光照周期是L﹕D＝14h﹕10h；培养温度为12±1℃。
其中流水培养方式添加营养液，优选为前三天流速为0.10-0.15米/分钟，此后流速为0.20-0.25米/分钟；从而能够有效的提高幼孢子体的存活率。
畸形率统计方法如下：待幼苗平均长度达到0.5cm时，随机取下一段0.5cm的苗绳上的幼苗。畸形率＝畸形幼苗数/总幼苗数；结果表明培养45天统计畸形率为58％。而已有方法的畸形率一般在70％-80％之间，表明本发明的方法能有效的降低幼孢子体的畸形率。
上述实例只是为说明本发明的技术构思以及技术特点，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明的实质所做的等效变换或修饰，都应该涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种海带幼孢子体的培养方法，其特征在于，所述的方法包括有如下的步骤：
首先将收集的卵子进行培养获得海带幼孢子体，然后对海带幼孢子体进行培养；
所述的卵子，其排出方法包括如下的步骤：
首先将海带种质丝状体在海水中进行复苏；
然后将海带种质进行粉碎，粉碎液进行过滤，获得长度为3-6个细胞的丝状体片段；
再将获得的丝状体片段在光照强度6000±300lx，光照周期是L﹕D＝12h﹕12h，温度为15±1℃条件下进行通气悬浮培养获得排出卵子细胞；
所述的对海带幼孢子体进行培养，其中
1)单列细胞的时期的培养条件如下：
光照强度1000-1500lx，光照周期是L﹕D＝14h﹕10h；培养温度为10±1℃；培养液组成为：4ppm NO3-N、0.4ppm PO4-P、4ppm GeO2；
2)两列细胞的幼孢子体时期：
采用流水培养方式添加营养液，培养液组成如下：8ppm NO3-N、0.4ppm PO4-P、4ppmGeO2；光照强度1000-1500lx，光照周期是L﹕D＝14h﹕10h；培养温度为12±1℃。
2.如权利要求1所述海带幼孢子体的培养方法，其特征在于，所述的流水培养方式添加营养液，在培养前三天流速为0.10-0.15米/分钟，此后流速为0.20-0.25米/分钟。
3.如权利要求1所述海带幼孢子体的培养方法，其特征在于，所述卵子进行培养，其培养条件如下：光照强度3000±100lx，光照周期L﹕D＝14h：10h，培养温度为10±1℃。
4.如权利要求1所述海带幼孢子体的培养方法，其特征在于，所述卵子进行培养中培养液组成为：4ppm的NO3-N、0.8ppm的PO4-P、4ppm的GeO2、1.0ug/L的VB12。
5.如权利要求1所述海带幼孢子体的培养方法，其特征在于，所述的将海带种质丝状体在海水中进行复苏条件如下：温度为15±1℃，光照强度为500-1000lx，每小时升高500lx，直至6000lx。
6.如权利要求1所述海带幼孢子体的培养方法，其特征在于，所述的粉碎，是采用组织搅碎机粉碎，1500转/min，粉碎30s。
7.如权利要求1所述海带幼孢子体的培养方法，其特征在于，所述的过滤是采用单层500目筛绢过滤。
8.如权利要求1所述海带幼孢子体的培养方法，其特征在于，所述的培养液组成如下：4ppm的NO3-N、0.8ppm的PO4-P、1ppm的FeC6H5O7-Fe、4ppm的GeO2、0.5μg/L的VB12。
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