JP5390385B2 - コンブ目植物の胞子体の生産方法およびそれに用いる基材 - Google Patents
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Description
[2]コンブ目植物の胞子体を準備するステップと、前記胞子体を高分子ゲルに付着させるステップと、前記胞子体を生長させるステップとを含む、コンブ目植物の胞子体の生産方法。
[3]前記雌性配偶体および前記雄性配偶体を準備するステップにおいて、前記雌性配偶体および前記雄性配偶体は細分化されている、[1]に記載のコンブ目植物の胞子体の生産方法。
[4]前記胞子体を準備するステップにおいて、前記胞子体は細分化されている、[2]に記載のコンブ目植物の胞子体の生産方法。
[5]前記高分子ゲルは種苗糸を被覆している、[1]〜[4]のいずれかに記載のコンブ目植物の胞子体の生産方法。
[6]前記高分子ゲルは、粒径が100μm〜5cmの範囲内の粒状体である、[1]〜[4]のいずれかに記載のコンブ目植物の胞子体の生産方法。
[8]前記高分子ゲルは、アニオン性または中性である、[7]に記載の基材。
[9]前記高分子ゲルは、アニオン性の高分子ゲルであって、アニオン性基が塩である、[7]に記載の基材。
本発明は、コンブ目植物の胞子体を生産する際に、種苗を付着させる基質に高分子ゲルを用いることを特徴とする。これにより、本発明の生産方法は、従来から用いられていた遊走子だけでなく、コンブ目植物の配偶体(雌性配偶体および雄性配偶体)や胞子体も種苗とすることができる。
本発明の生産方法において種苗を付着させる基材は、その表面に前述の高分子ゲルを有するものであれば特に限定されない。このような基材の例には、高分子ゲルで被覆されている種苗糸や高分子をその表面に有する粒状体などが含まれる。
本発明の生産方法では、コンブ目植物の遊走子、配偶体(雌性配偶体および雄性配偶体)または胞子体を種苗とすることができる。この中では、コンブ目植物の配偶体または胞子体を種苗とすることが好ましい。配偶体の優良株またはそれから得られた幼胞子体を種苗とすることで、高品質のコンブ目植物の胞子体を安定して生産することができるためである。
本発明の生産方法は、コンブ目植物の種苗(遊走子、配偶体または胞子体)を前述の基材表面の高分子ゲルに付着させるステップを含むことを特徴とする。以下、コンブ目植物の配偶体を種苗とした場合および胞子体を種苗とした場合の手順の一例について説明する。
配偶体を種苗とする場合は、例えば(1)コンブ目植物の雌性配偶体および雄性配偶体を準備し、(2)準備した配偶体を基材表面の高分子ゲルに付着させ、(3)高分子ゲルに付着した配偶体を成熟させて卵および精子を形成させ、(4)形成された卵と精子とを受精させて胞子体を発生させ、(5)発生した胞子体を生長させればよい。
胞子体を種苗とする場合は、例えば(1)コンブ目植物の(幼)胞子体を準備し、(2)準備した(幼)胞子体を基材表面の高分子ゲルに付着させ、(3)付着した胞子体を生長させればよい。
実施例1では、ホソメコンブ(Laminaria (Saccharina) religiosa)の配偶体(種苗)を3種類の本発明の基材(ポリアクリル酸ナトリウムゲルの粒状体、ポリアクリルアミドゲルの粒状体、アルギン酸ナトリウムゲルの粒状体)に付着させた後、各基材について配偶体の付着状況および生存状況を観察した結果を示す。
天然採取したホソメコンブの成熟胞子体(コンブ母藻)から遊走子を単離した。単離した遊走子を無菌培養し、配偶体の段階で保存した(ASP12 NTA(−Fe)培養液、14℃、明14時間−暗10時間サイクル)。実験を開始する前に、無菌保存されていた雌性配偶体および雄性配偶体を市販のカミソリを用いて細断し、ナイロンメッシュ(オープニング:100μm)に通して、細分化された雌性配偶体および雄性配偶体を調製した。
(ポリアクリル酸ナトリウムゲルの粒状体)
アクリル酸(モノマー)6.8g、メチレンビスアクリルアミド(架橋剤)0.62gおよび過硫酸カリウム(開始剤)0.27gを純水100mlに溶解させ、アクリル酸モノマー水溶液を調製した。また、外寸縦150mm、横150mm、幅10mmのコの字型の枠を厚さ5mmのシリコンゴムシートで作製し、このシリコン枠を縦150mm、横150mmのガラス板2枚で挟んで重合容器を作製した(ガラス板間の間隔は5mm)。調製したアクリル酸モノマー水溶液を開口部から重合容器内に20ml入れ、60℃で3時間加熱して熱重合によりゲル化させ、ポリアクリル酸ゲルを調製した。次いで、重合容器から取り出したポリアクリル酸ゲルを2mol/lの水酸化ナトリウム水溶液に浸漬し、70℃で3時間加熱してポリアクリル酸ナトリウムゲルを調製した。調製したポリアクリル酸ナトリウムゲルを縦20mm、横20mmの正方形に切り出し(厚さは5mm+α)、これを200ml以上の量の純水に浸し、数時間ごとに同量の純水に交換した。3日以上かけて未反応物を除去し、平衡膨潤させてポリアクリル酸ナトリウムゲルの粒状体を調製した。
アクリルアミド(モノマー)3.6g、メチレンビスアクリルアミド(架橋剤)0.3gおよび過硫酸カリウム(開始剤)0.014gを純水50mlに溶解させ、アクリルアミドモノマー水溶液を調製した。調製したアクリルアミドモノマー水溶液を前述の重合容器内に開口部から20ml入れ、60℃で3時間加熱して熱重合によりゲル化させ、ポリアクリルアミドゲルを調製した。次いで、重合容器から取り出したポリアクリル酸ゲルを縦20mm、横20mmの正方形に切り出し(厚さは5mm+α)、これを200ml以上の量の純水に浸し、数時間ごとに同量の純水に交換した。3日以上かけて未反応物を除去し、平衡膨潤させてポリアクリルアミドゲルの粒状体を調製した。
アルギン酸ナトリウム2gを70℃の純水48mlに保温および攪拌しながら少量ずつ加えて溶解させ、アルギン酸ナトリウム水溶液を調製した。同様に、塩化カルシウム1gを純水99mlに溶解させて塩化カルシウム水溶液を調製した。また、外寸縦150mm、横150mm、幅10mmのコの字型の枠を厚さ5mmのシリコンゴムシートで作製し、このシリコン枠を縦150mm、横150mmのガラス板に載せて重合容器を作製した(シリコン枠の高さは5mm)。調製したアルギン酸ナトリウム水溶液を前述の重合容器の枠内に注ぎ、均一の厚みになるまで静置した。次いで、シリコン枠内のアルギン酸ナトリウム水溶液に前述の塩化カルシウム水溶液を噴霧してアルギン酸ナトリウム水溶液をゲル化させ、アルギン酸ナトリウムゲルを調製した。次いで、重合容器から取り出したアルギン酸ナトリウムゲルを縦20mm、横20mmの正方形に切り出し(厚さは5mm+α)、アルギン酸ナトリウムゲルの粒状体を調製した。
上記「2.基材の調製」で準備した各基材(高分子ゲル)を人工海水(ダイゴ人工海水:日本製薬)で平衡膨潤させた。次いで、平行膨潤させた各基材(高分子ゲル)を6穴プレートのそれぞれ異なるウェルに入れた。次いで、上記「1.配偶体の調製」で準備した細分化された雌性配偶体および雄性配偶体を各ウェルに入れて静置した(15℃、明14時間−暗10時間サイクル)。
図1は、各基材に付着した配偶体の様子を示す写真である。図1Aは、ポリアクリル酸ナトリウムゲルに付着した配偶体を示す写真、図1Bはポリアクリルアミドゲルに付着した配偶体を示す写真、図1Cはアルギン酸ナトリウムゲルに付着した配偶体を示す写真である。これらの写真に示されるように、各基材に付着した配偶体は、異常な状態を示すことなく正常な状態で生存していることが確認された。
実施例2では、ホソメコンブの配偶体(種苗)を4種類の本発明の基材(ポリアクリル酸ナトリウムゲルの粒状体、ポリアクリルアミドゲルの粒状体、表面グラフト化ポリアクリルアミドゲルの粒状体、アルギン酸ナトリウムゲルの粒状体)に付着させた後、各基材について付着した配偶体の数および発芽した胞子体の数を計測した結果を示す。
実施例1と同様の手順で、細分化された雌性配偶体および雄性配偶体を準備した。
(ポリアクリル酸ナトリウムゲルの粒状体)
実施例1と同様の手順で、ポリアクリル酸ナトリウムゲルの粒状体(ブロック)を調製した。
実施例1と同様の手順で、ポリアクリルアミドゲルの粒状体(ブロック)を調製した。
実施例1と同様の手順でアクリルアミドモノマー水溶液を調製した。次いで、外寸縦150mm、横150mm、幅10mmのコの字型の枠を厚さ5mmのシリコンゴムシートで作製した。また、縦150mm、横150mmのガラス板に同サイズのシリコンゴムシート(厚さ1mm)を吸着固定して、シリコンゴムシート固定ガラス板を2枚作製した。2枚のシリコンゴムシート固定ガラス板(シリコンゴムシートが内側)の間にシリコン枠を挟んで重合容器を作製した(シリコンゴムシート間の間隔は5mm)。調製したアクリル酸モノマー水溶液を前述の重合容器内に開口部から20ml入れ、60℃で3時間加熱して熱重合によりゲル化させ、表面グラフト化ポリアクリルアミドゲルを調製した。次いで、重合容器から取り出した表面グラフト化ポリアクリルアミドゲルを縦20mm、横20mmの正方形に切り出し(厚さは5mm+α)、これを200ml以上の量の純水に浸し、数時間ごとに同量の純水に交換した。3日以上かけて未反応物を除去し、平衡膨潤させてポリアクリルアミドゲルの粒状体を調製した。
実施例1と同様の手順で、アルギン酸ナトリウムゲルの粒状体(ブロック)を調製した。
上記「2.基材の調製」で準備した各基材(高分子ゲルのブロック)の中央にワイヤーを通し、各基材を丸底フラスコ(容量500ml)内に吊り下げた。また、比較例として、長さ15cmに裁断した直径2mmのクレモナ糸(株式会社クラレ)も丸底フラスコ内に吊り下げた。次いで、上記「1.配偶体の調製」で準備した細分化された雌性配偶体および雄性配偶体を丸底フラスコ内に均等に撒き、通気培養した(PES培養液450ml、14℃、明14時間−暗10時間サイクル)。
表2は、各基材について、基材に付着した配偶体の数、発芽した胞子体の数、および発芽した各胞子体のサイズを計測した結果を示す表である。「幼胞子体サイズ」のかっこ内の数値は、平均値を示している。
実施例3では、ホソメコンブの配偶体(種苗)を2種類の本発明の基材(ポリアクリル酸ナトリウムゲルで被覆した種苗糸、アルギン酸ナトリウムゲルで被覆した種苗糸)に付着させた後、各基材について発芽した胞子体の数を観察した結果を示す。
実施例1と同様の手順で、細分化された雌性配偶体および雄性配偶体を準備した。
(ポリアクリル酸ナトリウムゲルで被覆した種苗糸)
アクリル酸ナトリウム(モノマー)4.7g、メチレンビスアクリルアミド(架橋剤)0.3gおよび過硫酸カリウム(開始剤)0.13gを純水50mlに溶解させ、アクリル酸ナトリウム水溶液を調製した。
アルギン酸ナトリウム4gを70℃に温めた純水100mlに攪拌した状態で少量ずつ加えて溶解させて、アルギン酸ナトリウム水溶液を調製した。また、塩化カルシウム1gを純水100mlに溶解させて、塩化カルシウム水溶液を別個に調製した。
上記「2.基材の調製」で準備した各基材(処理済のクレモナ糸)をそれぞれ2本ずつ丸底フラスコ(容量500ml)内に吊り下げた。また、比較例として、未処理のクレモナ糸も丸底フラスコ内に吊り下げた。次いで、上記「1.配偶体の調製」で準備した細分化された雌性配偶体および雄性配偶体を丸底フラスコ内に均等に撒き、通気培養した(PES培養液450ml、14℃、明14時間−暗10時間サイクル)。配偶体を撒いてから20時間後に、各基材を新たに準備した丸底フラスコに移し、同様の条件で通気培養した。各基材を移してから14日後に、丸底フラスコ内の培地を新たな培地に交換した。以後、7〜10日ごとに丸底フラスコ内の培地を新たな培地に交換した。
表3は、各基材について、単位長さ(1cm)あたりの発芽胞子体の数を計測した結果を示す表である。「サンプル1」および「サンプル2」とは、2本の糸のそれぞれを意味する。
Claims (8)
- コンブ目植物の雌性配偶体および雄性配偶体を準備するステップと、
前記雌性配偶体および前記雄性配偶体を高分子ゲルの表面に直接付着させるステップと、
露出した状態で前記高分子ゲルの表面に付着している前記雌性配偶体を成熟させて卵を形成させるステップと、
露出した状態で前記高分子ゲルの表面に付着している前記雄性配偶体を成熟させて精子を形成させるステップと、
前記卵と前記精子とを受精させて、胞子体を発生させるステップと、
前記胞子体を生長させるステップと、
を含み、
前記高分子ゲルは、粒径が100μm〜5cmの範囲内の粒状体である、
コンブ目植物の胞子体の生産方法。 - コンブ目植物の胞子体を準備するステップと、
前記胞子体を高分子ゲルの表面に直接付着させるステップと、
露出した状態で前記高分子ゲルの表面に付着している前記胞子体を生長させるステップと、
を含み、
前記高分子ゲルは、粒径が100μm〜5cmの範囲内の粒状体である、
コンブ目植物の胞子体の生産方法。 - 前記雌性配偶体および前記雄性配偶体を準備するステップにおいて、前記雌性配偶体および前記雄性配偶体は細分化されている、請求項1に記載のコンブ目植物の胞子体の生産方法。
- 前記胞子体を準備するステップにおいて、前記胞子体は細分化されている、請求項2に記載のコンブ目植物の胞子体の生産方法。
- 前記高分子ゲルは、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミドもしくはアルギン酸またはこれらの塩を含む、請求項1に記載のコンブ目植物の胞子体の生産方法。
- 前記高分子ゲルは、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミドもしくはアルギン酸またはこれらの塩を含む、請求項2に記載のコンブ目植物の胞子体の生産方法。
- 高分子ゲルで被覆されている種苗糸、または粒径が100μm〜5cmの範囲内の高分子ゲルの粒状体であるコンブ目植物の胞子体を生産するための基材であって、
前記高分子ゲルは、アニオン性または中性であり、かつポリアクリル酸、ポリアクリルアミドもしくはアルギン酸またはこれらの塩を含む、基材。 - 前記高分子ゲルは、アニオン性の高分子ゲルであって、アニオン性基が塩である、請求項7に記載の基材。
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