CN103299904B

CN103299904B - 一种北五味子人工种子制备和育苗方法

Info

Publication number: CN103299904B
Application number: CN201310207635.4A
Authority: CN
Inventors: 于继鸿
Original assignee: LIAONING WANMU SCHISANDRA TECHNOLOGY INDUSTRIAL PARK Co Ltd
Current assignee: LIAONING WANMU SCHISANDRA TECHNOLOGY INDUSTRIAL PARK Co Ltd
Priority date: 2013-05-30
Filing date: 2013-05-30
Publication date: 2014-12-24
Anticipated expiration: 2033-05-30
Also published as: CN103299904A

Abstract

本发明属于医药技术领域，涉及一种北五味子(Schisandra chinensis)人工种子制备和育苗方法，该方法能够在有菌栽培基质中正常萌发五味子人工种子。该人工种子可由下述过程制备获得：将良种五味子外植体接种到愈伤组织诱导培养基中得到愈伤组织，将愈伤组织进行胚型愈伤组织的诱导，将胚型愈伤组织进行体细胞胚诱导，将诱导得到的体细胞胚同步化培养和继代培养，将子叶期体细胞胚经离子交换过程形成海藻酸钠-CaCl₂水凝胶小球，将得到的凝胶小球用脱乙酰壳聚糖和多菌灵微粉包裹，即可得到包裹人工种皮的人工种子；将人工种子萌发，即得。本方法既可在短时间内得到大量种苗，又可以节约人力物力。

Description

一种北五味子人工种子制备和育苗方法

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及一种北五味子人工种子的制备和育苗方法。

背景技术

北五味子为东北地区道地药材，其中又以辽宁省产量最大，质量最佳，但目前几乎所有的五味子种植基地中均存在严重的品种混杂现象，主要体现在果实颜色、果穗形状、产量、有效成分含量、叶片质地和大小等方面的差异，该现象造成了五味子药材品质严重参差不齐的现象。目前，五味子栽培基地中所使用的繁殖方法均为种子繁殖，但该方法不可避免地会造成生殖分离与农艺性状退化等问题，即使通过取样得到了品质和产量均较优的五味子品系，但通过种子繁殖得到的子代中又会出现母代品质差异较大的现象，此外，种子育苗还存在过程繁琐，有严格的时间限制等缺点。因此，有必要对五味子进行无性繁殖研究。

已有专利CN101904302A和CN1817106公开了一种五味子体细胞胚的诱导方法，将得到的体细胞胚在无菌条件下进行萌发得到五味子种苗，该方法繁殖系数较高，所需原材料较少，但是该方法中，得到组培苗的全过程均是在无菌条件下进行的，操作周期长，劳动强度大，这就大大提高了种苗繁育过程所投入的人力物力，提高了其繁育和栽培面积扩大化的成本。

已有专利CN101485293和CN101878737A公开了一种五味子种苗繁育的方法，即通过组织培养技术诱导得到丛生芽，再将丛生芽进行生根处理，最后将生根后的五味子种苗移栽到田间。该方法具有技术难度低，成功率高的优点，但是繁殖系数低，繁殖速度慢，无菌操作过程长，劳动强度高，也需要耗费大量人力物力。因此有待于开发一种具有繁殖系数高，人力物力需求少，繁殖速度快，萌发率高，成活率高的制备方法，以克服现有技术的缺陷。

发明内容

本发明所解决的技术问题是：提供一种能够在有菌栽培基质中正常萌发的五味子人工种子，该人工种子可由下述过程制备获得：将五味子外植体进行表面消毒，接种到愈伤组织诱导培养基中得到愈伤组织，将愈伤组织在液体培养条件下建立悬浮培养体系，进行胚型愈伤组织的诱导，将胚型愈伤组织进行体细胞胚诱导，将诱导得到的体细胞胚接种到1/2MS培养基中进行同步化培养，将子叶期体细胞胚重悬于含有壳寡糖200-1000mg/L、0.1～0.5％活性炭、0.5-2％木薯淀粉、海藻酸钠2-5％的1/2MS培养基中(其中各组分的百分比浓度均为重量体积百分浓度)。然后经离子交换过程形成海藻酸钠-CaCl₂水凝胶小球，将得到的凝胶小球与脱乙酰壳聚糖和多菌灵微粉进行反应，即可得到包裹有脱乙酰壳聚糖和多菌灵微粉人工种皮的人工种子；将此人工种子在人工栽培基质(泥炭土与土壤混合物)中按照一定的栽培条件进行萌发，即可得到快繁种苗。

本发明提供了一种五味子人工种子的制备和种苗繁育方法，该方法包括下述顺序的步骤：

(1)以良种五味子外植体为起始材料，经75％酒精和饱和次氯酸钠溶液依次表面消毒后，切成小块，在超净工作台内接种到含有2，4-二氯苯氧乙酸0.5～2mg/L，6-苄氨基嘌呤1.0～3.0mg/L，蔗糖15～30g/L，琼脂0.5～1％，最终pH调至5.5～6.5之间的无菌MS固体培养基(愈伤组织诱导培养基)中，于25±1℃、暗培养条件下进行愈伤组织的诱导。

(2)选取淡黄绿色，质地疏松，生长旺盛的愈伤组织，接种到除去琼脂的愈伤组织诱导培养基中，建立其悬浮培养条件，得到旺盛生长，大小均匀的细胞悬液。

(3)在得到足够量的细胞悬液后，将其在无菌条件下过滤得到细胞，用除去激素的MS培养基洗涤后，接种于含有0.2～2.0mg/L噻重氮苯基脲和0.5～3mg/L脱落酸的MS培养基中，进行体细胞胚的诱导。

(4)将得到的体细胞胚用不同目数的筛网过滤，得到大小相近的体细胞胚，再将体细胞胚接种到去除了磷元素的1/2MS液体培养基中处理2～7天，进行体细胞胚的同步化，然后再进行正常培养，当有70％以上体细胞胚处于子叶胚阶段时，即可进行包埋处理。

(5)将同步化后的体细胞胚悬浮于含有壳寡糖200-1000mg/L、0.5-2％木薯淀粉、0.1～0.5％活性炭、海藻酸钠2-5％的1/2MS培养基中，将上述悬液滴至10～20％的氯化钙溶液中，离子交换时间为10分钟，控制液滴大小，使每滴中含有1个最多2个体细胞胚，将得到的凝胶小球用蒸馏水略洗涤。

(6)将得到的凝胶小球在脱乙酰壳聚糖和多菌灵混合微粉中进行包被，混合比例1∶1～4∶1，即可得到具有抗菌特性和一定韧度的人工种皮，至此，五味子人工种子制备完成。

(7)在制备好人工种子后，本发明还设计了一种能够使其在人工育苗圃中萌发为种苗的方法。栽培基质为泥炭土∶土壤(1∶5～1∶20)的混合物，均匀混合后，要求无明显大颗粒，按重量比1000∶1加入多菌灵可湿性粉剂，搅拌均匀后，塑料布覆盖过夜，之后摊成薄层，阳光下暴晒至干，装袋备用。使用时，将基质粉末加水至含水量40～60％，再装入育苗容器，铺成Scm厚的薄层，打浅眼，每孔一粒人工种子，覆土，调整育苗温度为18～22℃，每隔3天，浇水1次，使土壤含水量维持30～60％，10～20天小苗可萌发出土，萌发率可达到20～55％。

步骤(5)的培养基优选为含有500～1000mg/L壳寡糖、1～2％木薯淀粉、0.2～0.4％活性炭、3～5％海藻酸钠的1/2MS培养基，更优选含有800～1000mg/L壳寡糖、1.5～2％木薯淀粉、0.3～0.4％活性炭、4～5％海藻酸钠的1/2MS培养基。

步骤(6)中，脱乙酰壳聚糖∶多菌灵混合微粉优选3∶1～4∶1

步骤(7)中泥炭土∶土壤优选1∶7～1∶10。

本发明的人工胚乳(步骤5)制备过程中，使用了近年来发现的对植物生长有促进作用且抗菌谱广的水溶性壳寡糖，在人工胚乳中使用可显著提高萌发后植株的抗菌能力，其价格便宜，制备方便，具有可生物降解性；还加入了木薯淀粉和活性炭，旨在提高人工胚乳的保水性，使胚乳中的营养成分不易流失，增强体细胞胚萌发机率。人工种皮制备(步骤6)中，我们使用了脱乙酰壳聚糖，该成分具有抗菌和昆虫拒食特性，材料带有正电荷，在包被人工种皮过程中可以与海藻酸钠-氯化钙水凝胶中的负电荷结合，使得其结合较紧密，不易脱落，因为该成分具有此特性，所以也可附带的将多菌灵粉末结合到人工种皮中，最终形成具有双重抗菌能力，昆虫拒食性和一定机械强度的人工种皮。

此外，本发明还涉及一种人工种子的繁育方法，该繁育方法通过对栽培基质进行一定的消毒处理和保湿操作，将人工种子播种到基质中，通过培养温度和土壤湿度的控制，即可在10～20天内得到萌发出土的五味子种苗，萌发率可达20～55％，萌发后种苗成活率为82～90％。

与传统的五味子快繁技术相比，本发明在体细胞胚基础上进行了人工种子的制备，并建立了育苗方法，由于体细胞胚可以在摇瓶或生物反应器中进行培养，制备的人工种子又可以在栽培基质上进行萌发，从而得到大量快繁苗，该流程在很大程度上摆脱了快繁过程中劳动强度大，人力物力需求高的问题。鉴于目前人工种子保藏的难题尚未攻克，因此，在不适宜户外作业的条件下，需要人工暖棚或栽培室来进行育苗工作。

具体实施方式

实例1：

1-4步操作参考发明内容部分(1)～(4)，即以良种五味子外植体为起始材料，经75％酒精和饱和次氯酸钠溶液依次表面消毒后，切成小块，在超净工作台内接种到含有2，4-二氯苯氧乙酸0.5～2mg/L，6-苄氨基嘌呤1.0～3.0mg/L，蔗糖15～30g/L，琼脂0.5～1％，最终pH调至5.5～6.5之间的无菌MS固体培养基(愈伤组织诱导培养基)中，于25±1℃、暗培养条件下进行愈伤组织的诱导。

选取淡黄绿色，质地疏松，生长旺盛的愈伤组织，接种到除去琼脂的愈伤组织诱导培养基中，建立其悬浮培养条件，得到旺盛生长，大小均匀的细胞悬液。

在得到足够量的细胞悬液后，将其在无菌条件下过滤得到细胞，用除去激素的MS培养基洗涤后，接种于含有0.2～2.0mg/L噻重氮苯基脲和0.5～3mg/L脱落酸的MS培养基中，进行体细胞胚的诱导。

将得到的体细胞胚用不同目数的筛网过滤，得到大小相近的体细胞胚，再将体细胞胚接种到去除了磷元素的1/2MS液体培养基中处理2～7天，进行体细胞胚的同步化，然后再进行正常培养，当有70％以上体细胞胚处于子叶胚阶段时，即可进行包埋处理。

将得到的子叶期体细胞胚悬浮于含有壳寡糖500mg/L、1％木薯淀粉、0.2％活性炭、海藻酸钠3.5％的1/2MS培养基中，将上述悬液滴至15％的氯化钙溶液中，离子交换时间为10分钟，将得到的凝胶小球用蒸馏水略洗涤。将得到的凝胶小球在脱乙酰壳聚糖和多菌灵混合微粉(混合比例3∶1)中进行包被，即可得到具有抗菌特性和一定韧度的人工种皮。所制备得到的人工种子直径为0.5～0.7cm，外层白色，内层灰色，每粒人工种子含有1～2个子叶期体细胞胚。在进行人工种子育苗时，栽培基质为泥炭土∶土壤(1∶8)的混合物，均匀混合后，要求无明显大颗粒，按重量比1000∶1加入多菌灵可湿性粉剂，搅拌均匀后，塑料布覆盖过夜，之后摊成薄层，阳光下暴晒至干，装袋备用。使用时，将基质粉末加水至含水量45％，再装入育苗容器，铺成5cm厚的薄层，打浅眼，每孔一粒人工种子，覆土1cm左右，调整育苗温度为21℃，每隔3天浇水1次，12天小苗可萌发出土，萌发率可达到45％左右，成活率可达86％。

实例2～5：

参考实施例1步骤，改变各变量浓度/比例进行人工种子的制备和育苗实验，结果如下：

Claims

1. 一种北五味子人工种子的制备方法，其特征在于：

（1）将良种五味子外植体接种到愈伤组织诱导培养基中得到愈伤组织，将愈伤组织在液体培养条件下建立悬浮培养体系，进行胚型愈伤组织的诱导；

（2）将胚型愈伤组织进行体细胞胚诱导，将诱导得到的体细胞胚接种到1/2MS培养基中进行同步化培养；

（3）子叶期体细胞胚重悬于含有壳寡糖200-1000mg/L、0.1—0.5%活性炭、0.5-2%木薯淀粉、海藻酸钠2-5%的1/2MS培养基中，得悬液，然后经离子交换过程形成海藻酸钠-CaCl₂水凝胶小球，将得到的凝胶小球与脱乙酰壳聚糖和多菌灵制得的混合微粉进行反应，即可得到包裹有脱乙酰壳聚糖和多菌灵混合微粉人工种皮的人工种子；

步骤(1)中的愈伤组织诱导培养基为含2,4-二氯苯氧乙酸0.5～2 mg/L 和6-苄氨基嘌呤1.0～3.0 mg/L，蔗糖15～30 g/L，琼脂0.5～1%，最终pH调至5.5～6.5之间的无菌MS固体培养基；

步骤（1）中建立悬浮培养体系后得到足够量的细胞悬液，将其在无菌条件下过滤得到细胞，用除去激素的MS培养基洗涤后，接种于含有0.2～2.0mg/L噻重氮苯基脲和0.5～3mg/L 脱落酸的MS培养基中，进行体细胞胚的诱导；

步骤（2）中将得到的体细胞胚用不同目数的筛网过滤，得到大小相近的体细胞胚，再将体细胞胚接种到去除了磷元素的1/2MS液体培养基中处理2～7天，进行体细胞胚的同步化，然后再进行正常培养，当有70%以上体细胞胚处于子叶胚阶段时，即可进行包埋处理；

步骤（3）中，脱乙酰壳聚糖和多菌灵以1:1～4:1的混合比例制得混合微粉，步骤(3)中的悬液滴至10～20 %的氯化钙溶液中，离子交换时间为10分钟，控制液滴大小，使每滴中含有1～2个体细胞胚。

2. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中的培养基为含有壳寡糖500-1000mg/L、0.5-2%木薯淀粉、0.1～0.5%活性炭、海藻酸钠2-5%的1/2MS。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（3）的氯化钙浓度为12～15%。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）的培养基为含有800～1000 mg/L壳寡糖、1～2%木薯淀粉、0.2～0.4%活性炭、3～5 %海藻酸钠的1/2MS培养基。

5.一种北五味子人工种子的育苗方法，其特征在于：将权利要求1中步骤（3）得到的人工种子在人工栽培基质中进行萌发，即可得到快繁种苗，所述的人工栽培基质为泥炭土：土壤1:5～1:20的混合物。

6.如权利要求5所述的育苗方法，其特征在于，所述的泥炭土：土壤=1:7～1:10。

7.根据权利要求5所述的育苗方法，其特征在于，将泥炭土和土壤均匀混合后，按重量比1000:1加入多菌灵可湿性粉剂，搅拌均匀后，暴晒至干得基质粉末，装袋，使用时，将基质粉末加水至含水量40～60%，再装入育苗容器育苗。

8.根据权利要求7所述的育苗方法，其特征在于，育苗条件如下：基质含水量40～60 %，育苗温度为18～22℃。