CN104604681B - 一种提高植物组培外植体成活率的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种在植物组培中以含营养成分、植物激素的衣膜剂包囊外植体以提高培养成活率的方法，属农林领域的植物组织培养技术。包括以透气、透水、透光性好，对植物组织安全、耐高压灭菌衣膜剂包囊外植体。成膜剂为海藻酸钠溶液，混溶营养成分、激素，与已表面消毒的外植体混合，取出外植体浸入氯化钙溶液，交联固化成粒状。通过包囊，可扩大外植体对营养、激素的接触、吸收面积，提高诱导培养成活率。在植物组培中，利用茎尖分生组织的脱毒培养，避免外植体块为嵌合体而带来组培无性系变异，都尽量切取小块外植体，本发明包囊微小外植体对提高培养成活率效果明显，且该方法操作简便，成本低廉，便于推广应用。

Description

一种提高植物组培外植体成活率的方法

技术领域

本发明属农林领域的植物组织培养技术，具体涉及提高植物组培外植体初代培养成活率的方法。

背景技术

植物组织培养技术在种苗生产、脱除病毒、种质改良等具有广阔的市场前景。目前植物组织培养技术环节还存在不少问题，外植体(种子、芽、茎段、叶、根、花瓣、果实等)初代诱导期间死亡而致组织培养失败是普遍现象。外植体死亡的原因，除了合适的培养基配方外，外植体没有专门的吸收组织或器官，主要靠接触到培养基的切口吸收营养成分和激素，接触面积小且吸收功能非常低下，无法满足脱分化或再分化的细胞分裂、生长的需要，也是导致外植体死亡的主要原因，尤其是微小外植体，自身贮存营养物质少，对组培环境适应能力差，更是难以成活，此外,外植体切口细胞所含的酚类物质在空气(氧气)中酶促反应成醌类物质，后者再通过非酶促反应产生有色物质毒害细胞，从切口发生褐化,最后导致整块死亡。但目前没有有效的外植体保活方法。植物分生组织培养是脱除病毒的最有效方法，但植物仅茎尖生长点分生组织不带毒或病毒浓度低，由于分生组织只是一群细胞，只能切取仅0.1-1mm外植体接种，外植体极其微小接种培养成活率极低，限制了茎尖脱毒法在脱除病毒的广泛应用，以致植物脱除病毒进展缓慢。此外，植物的同一组织常常是由2种或者2种以上遗传型细胞组成的，称嵌合体，切取的外植体组织块含不同遗传型细胞，培养所得无性系(愈伤组织、瓶苗)仍是遗传上异质的嵌合体，这种变异影响组培无性系的纯度和质量，给组织培养技术的应用造成障碍，所以必须尽量切取较小块外植体，可望保证外植体细胞同一性，规避培养出的愈伤组织、瓶苗为嵌合体，保证组培无性系的遗传一致性。

发明内容

本发明以含营养成分和激素的衣膜剂包囊整个组培外植体再接种到培养基培养，衣膜透水、透气、透光，培养基的营养及激素能被外植体吸收，细胞呼吸不受影响，相对常规接种方法，扩大了外植体与营养成分、激素的接触面积，增强营养成分和激素的吸收，可减轻外植体因营养不良而坏死，衣膜包囊整个外植体，隔绝了大部分空气，减轻细胞酚类物质被酶促氧化成醌类物质而毒害组织细胞，外植体可减轻或免于发生褐化，提高成活率。

一种提高植物组培外植体成活率的包囊培养法，其特征在于，所采用的成膜剂配成的衣膜透气、透水性好，凝固的衣膜透光性好，对植物细胞伤害小，本发明以海藻酸钠为成膜剂，附加成分包括营养成分、植物生长调节物质(激素)，种类和浓度及酸碱度与培养基的营养成分、激素及酸碱度一致。

本发明提供的技术方案如下：

衣膜各组分含量：所述的成膜剂海藻酸钠浓度2％-5％，海藻酸钠交联固化剂为2％氯化钙溶液。附加营养成分、激素种类和浓度与培养基成分相同。

海藻酸钠衣膜剂配制、使用方法：海藻酸钠先用少量水溶化，与耐高压灭菌的营养成分、激素混合，定容，调pH与培养基酸碱度一致(一般pH5.8)，高压灭菌，冷却待用。不耐高压灭菌的营养成分、激素溶液过滤除菌，加入已经高压灭菌的海藻酸钠成膜剂，搅拌混匀待用。氯化钙单独高压灭菌。接种前将已经消毒的外植体泡入海藻酸钠衣膜剂，用滴管吸取外植体，连同衣膜剂滴入氯化钙溶液，也可从海藻酸钠衣膜剂夹取外植体，轻轻抖掉外植体表面多余衣膜剂粘稠液，投入氯化钙溶液，固化数分钟。取出外植体投入无菌水洗去多余氯化钙，在无菌滤纸上吸去无菌水，接种时轻压外植体，使其稍陷入琼脂培养基表面。

本发明的有益效果在于：常规组培方法的营养成分、激素仅存在于培养基，外植体接触吸收面积小。本发明将含营养、激素的衣膜剂包囊整个外植体，可扩大外植体吸收养分、激素面积，提高组培外植体成活率，为外植体诱导成功提供保障。该方法操作简便，效果明显，便于推广应用。

具体实施方式

实施例一

蝴蝶兰(Phalaenopsis spp.)组培的无菌类原球茎放置超净台，把体视显微镜放在超净台，在体视显微镜下，离茎尖先端约1mm切取茎尖为外植体，对照组直接接种，培养基配方为1/2MS+6-BA5mg/L+椰子汁200ml/L+蔗糖20g/L，pH5.8。衣膜包囊外植体方法，海藻酸钠浓度3％，附加营养激素同培养基各组分，调pH至5.8，高压灭菌后冷却待用，另2％氯化钙高压灭菌待用。接种时将茎尖投入海藻酸钠衣膜剂，用镊子取出轻轻抖掉多余粘稠液，投入氯化钙溶液，固化3分钟，取出投入无菌水洗去多余氯化钙，在无菌滤纸上吸去无菌水，接种时轻压外植体，使其稍陷入琼脂培养基表面。每瓶接种5个外植体，每次3瓶，重复3次。接种后在25℃、1500lux光下培养，光照12h/d。培养期间均未发生微生物污染，不同培养时间的茎尖褐化率、诱导(细胞分裂而膨大)率结果见表1。

表1蝴蝶兰类原球茎茎尖的衣膜包囊培养法效果观察

*诱导率以未发生褐化的绿色外植体统计。

蝴蝶兰茎尖外植体在培养其间均未污染，在培养第15天，对照外植体死亡率20％，本发明(衣膜包囊茎尖)外植体没有褐化，不发生褐化的外植体鲜绿或浅绿色，大部分膨大(被诱导)。在培养第30天，对照茎尖褐化率31.1％，衣膜包囊茎尖死亡率仅15.6％，约为对照的一半，衣膜包囊保护外植体活力的效力显著，不统计褐化死亡外植体，衣膜包囊外植体诱导率与对照相当(前者高0.3％)，所以衣膜包囊小外植体对培养后期生长发育没有明显的不良影响。所以本发明在提高蝴蝶兰类原球茎尖小外植体培养成活率优势明显。

实施例二

切取菊花(Chrysanthemum morifolium)顶芽或腋芽3-5cm，去掉叶片，用洗涤液洗涤，在超净台将材料用0.1％升汞溶液消毒8min,再用无菌水冲洗3-5次。把体视显微镜放在超净台，材料放在体视显微镜剥去端部的嫩苞叶,

露出锥形体,切取0.5mm长度的茎尖,带2个叶原基，对照外植体迅速接种到培养基上，茎尖向上。培养基为MS+BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L、pH5.8。衣膜包囊外植体方法，海藻酸钠浓度3％，附加营养激素同培养基各组分，调pH至5.8，高压灭菌后冷却待用，另2％氯化钙高压灭菌待用。接种时将0.5mm长的茎尖投入海藻酸钠衣膜剂，用滴管吸取外植体，连同衣膜剂滴入氯化钙溶液，固化3分钟，取出胶球投入无菌水洗去多余氯化钙，在无菌滤纸上吸去无菌水，接种时茎尖向上，轻压胶球，使其稍陷入琼脂培养基表面。每瓶接种5个外植体，每次3瓶，重复3次。培养温度25℃，光照度1000lx,光照时数12

h/d。茎尖接种10d左右诱导分化出芽，30d后伸长生长，培养期间均未有微生物污染，褐化率、萌发率观测结果见表2。

表2菊花茎尖衣膜包囊外植体培养法效果观察*

*萌发率以未发生褐化的外植体统计。

在培养的前10天，衣膜包囊保护外植体免褐化死亡，但萌发率较对照稍低，可能相对较厚的衣膜一定程度限制小外植体呼吸透气有关。在培养的第30天，衣膜包囊外植体褐化死亡率24.5％，约为对照外植体褐化率(40％)的61％，衣膜包囊保护外植体活力的效力显著，不统计褐化死亡外植体，衣膜包囊外植体萌发率与对照相当(前者提高1.6％)，所以衣膜包囊小外植体对培养后期生长发育没有明显的不良影响。所以本发明在提高菊花茎尖小外植体培养成活率优势明显。

Claims (2)

1.一种提高植物组培外植体成活率的方法，其特征在于：以衣膜包囊外植体,衣膜剂包括海藻酸钠成膜剂、营养成分、植物激素，衣膜剂粘液无色透明，与已表面消毒的外植体混合，用滴管吸取外植体，连同衣膜剂滴入氯化钙溶液，或夹取表面沾粘有衣膜剂的外植体块，投入氯化钙溶液，衣膜固化，接种在培养基培养；

所述海藻酸钠浓度为2％-5％，高压灭菌,所述的氯化钙溶液浓度2％，高压灭菌后冷却；所述衣膜剂的营养成分，植物激素、酸碱度与培养基的营养成分、植物激素、酸碱度一致。

2.如权利要求1所述的一种提高植物组培外植体成活率的方法，其特征在于：所述的营养成分、植物激素，耐高压灭菌的混溶于海藻酸钠溶胶一起高压灭菌，不耐高压灭菌的过滤除菌后混溶于已高压灭菌海藻酸钠溶胶。