CN107372067A - 一种培育金线莲种苗的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种培育金线莲种苗的方法，该方法包括如下步骤：选取金线莲进行人工授粉并套袋，取授粉后的蒴果为外植体；将外植体洗净，浸泡处理后，将蒴果内的种子全部洗脱至无菌水中，制成种子悬浮液；无菌条件下将种子悬浮液均匀分布在培养基中，置于全自然光培养室中在一定的光照和室温下培养，通过调节光照的强度和温度，达到出苗的标准，培育得到金线莲种苗。该方法只需培养一次即可成苗，不需转接人工，加上采用全自然光照培养，根据不同生长阶段对光的需求不同而移动培养的位置，生产出来的种苗健壮易成活，移栽前不需要经过专门的炼苗处理，可直接出瓶移栽，显著降低了生产成本，成活率可达98％以上。

Description

一种培育金线莲种苗的方法

技术领域

本发明属于生态环境材料技术领域，更具体地，涉及一种培育金线莲种苗的方法。

背景技术

金线莲别名金线兰、金丝草，是兰科(Orchidaceae)开唇植物花叶兰属(Anoectochilus Bl.)多年生珍稀草本植物，我国有23种左右，其中部分种全草民间作药用,为传统珍稀名贵中药材，它在民间使用范围较广，多用于治疗糖尿病、高血脂、乙型肝炎等疾病，素有“药王”、“金草”、“神药”、“乌人参”等美称，被称为“药中之王”。多年来，由于其市场需求大而导致人工过度采挖，加上金线莲自然繁殖率低、生长缓慢，野生的金线莲资源已非常稀少，濒临灭绝，早在1987年国务院就将金线莲列为重点保护的中药材之一，为国家二级保护植物。而由于人工种植金线莲又有较大的难度，目前人工种植的数量还非常有限。由于原材料量的限制，近年来金线莲产业有所萎缩。因此大力发展人工种植已显得非常必要和迫切。因为金线莲在临床中广泛应用，而且疗效极好,具有极高的经济效益和社会效益，因此市场需求越来越大，而人工种植的金线莲还远不能满足市场的需求，目前市场价格昂贵，由金线莲制成的干品目前售价每公斤达到1万元，市场金线莲鲜品价格亦高达800-1000元/公斤，若每亩能产出300公斤以上鲜品，则亩产值可达24万元以上。是目前农业种植业中效益最高的产业之一。大力发展金线莲的人工种植，不但可以满足人们对金线莲的需求，而且还可以因减少对野生资源的依赖而起到保护野生资源的目的。目前金线莲种苗生产已有很多的报道，普遍存在培养周期长、操作复杂、生产成本较高的问题。因此，人工种植金线莲不但有很好的市场前景，而且对野生资源的保护也有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的缺陷，提供一种培育金线莲种苗的方法。该方法利用高萌发率的种子、营养丰富的培养基、全自然光培养室进行金线莲种苗一次成苗大规模生产，具有低成本，高效率的特点，繁殖的优质种苗，能满足金线莲产业的发展巨大种苗市场需求，以种子来繁殖种苗具有贴近其自然繁殖的特性，能确保收获金线莲植株成品的多样性及其其药效，提高金线莲中药材使用的安全性，对濒危紧缺金线莲药用植物资源再生和持续利用具有十分重要意义，满足健康产业对珍贵中药材金线莲的巨大市场需求。

本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：

一种培育金线莲种苗的方法，包括如下具体步骤：

S1.选取生长健壮、萌芽率高、抗逆性、抗病虫害强的金线莲，于开花季节进行人工授粉并套袋，取授粉后的蒴果为外植体；

S2.种子悬浮液的制作：将外植体洗净，经浸泡处理后用无菌水冲洗，用无菌纸吸干蒴果表面水分，再用无菌刀切开蒴果，将蒴果内的种子全部洗脱至无菌水中，制成种子悬浮液；

S3.原球茎诱导培养：无菌条件下将种子悬浮液均匀分布在培养基中，置于全自然光培养室中，在光照和温度为20～24℃下培养，种子萌发形成原球茎，原球茎长出根和叶片形成幼苗；

S4.幼苗培养：将幼苗在光照和温度为20～24℃下培养，长成大苗；

S5.大苗培养：将大苗在光照和温度为21～25℃下培养，达到出苗的标准，培育得到金线莲种苗。

移栽时，取出金线莲种苗，洗净附着的培养基后，用0.1％的高锰酸钾溶液浸泡5～10min，种植基质采用混合基质(泥炭：珍珠岩＝8：1)，保持湿度在85％RH以上，温度在23～27℃，光照强度为5000～10000Lux条件下，成活率可达98％以上，30d左右成活后的植株能产生新的根系，进行正常水、肥和药管理。

优选地，步骤S1中所述授粉的时间为60～70天，所述套袋为硫酸纸。

优选地，步骤S2中所述冲洗的次数为3～5次，所述种子悬浮液的浓度为15～20粒/毫升。

优选地，步骤S2中所述所述浸泡处理是先在洗衣粉水中并摇动，清水洗净后用75％的乙醇浸泡，再在0.1％的升汞中浸泡并摇动。

优选地，所述洗衣粉水的浓度0.2％～0.5％，所述浸泡的时间为30～60s。

优选地，步骤S3中所述培养基的配方为：每升水溶液中含花宝1号2～3g，花宝2号2～3g，蛋白胨2～3g，土豆泥50～60g，香蕉泥80～100g，苹果泥10～20g，活性碳1.5～2g，肌醇80～120mg，甘氨酸2～3mg，盐酸硫胺素0.2～0.5mg，盐酸吡哆醇0.5～1mg，烟酸4～5mg，萘乙酸0.2～0.5mg，蔗糖20～30g和琼脂5～5.5g，所述培养基的pH＝5.4～5.6。

优选地，步骤S3中所述全自然光培养室是使用钢化玻璃建成透光的培养室，包括遮阳系统、控温设备和培养架；所述遮阳系统包括内遮阳网和外遮阳网，所述控温设备采用冷暖两用空调，可将玻璃培养室的温度控制在20～25℃。

优选地，步骤S3中所述光照的强度为100～1000Lux，所述培养的时间为60～90天。

优选地，步骤S4中所述光照的强度为1000～2000Lux，所述培养的时间为80～90天。

优选地，步骤S5中所述光照的强度为3000～5000Lux，所述培养的时间为60～90天。

本发明中所述金线莲幼苗的苗高为3～5cm，叶片数为3～5片，根数为3～5条根须，根长为1～3厘米。所述的金线莲苗的大苗的苗高为8.0～10.0cm，每茎有4-6节，4片以上叶片，3条以上根，茎粗为2.0mm以上。对每个蒴果种子悬浮液进行种子密度的检测，在摇匀情况下用无菌移液枪吸取10微升于生物显微镜下计算其种子数量，每瓶种子悬浮液重复取10次计算其平均每毫升种子数，根据每瓶悬浮液种子浓度用无菌水进一步稀释成种子浓度为15～20粒/毫升的接种用的种子悬浮液。为保证金线莲在长达7-8个月的培养时间中有足够的营养供应，除了培养基中有丰富的有机成分外，加入的量比平常的量多20％～50％。全自然光的培养室中培养架分为底层，第二层、第三层和顶层，培养架的宽为60厘米，高为250厘米，离地面10厘米为底层，层距60厘米，培养架的层距比普通的要大一倍左右，目的是保证每层的培养材料受光更好。通过调控内遮阳网和外遮阳网使顶层的光照强度为3000～5000Lux，第二层和第三层的光照强度为1000～3000Lux，底层的光照强度为100～1000Lux，，培养架长度可根据培养室的大小而定。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1.本发明利用高萌发率的种子、营养丰富的培养基、全自然光培养室进行金线莲种苗一次成苗大规模生产，具有低成本，高效率的特点，繁殖的优质种苗，能满足金线莲产业的发展巨大种苗市场需求。

2.本发明只需一次成苗，不需转接人工，加上采用全自然光照培养，根据不同生长阶段对光的需求不同而移动培养的位置，生产出来的种苗健壮易成活，移栽前不需要经过专门的炼苗处理，可直接出瓶移栽，显著降低了生产成本，成活率可达98％以上。

3.本发明以种子来繁殖种苗具有贴近其自然繁殖的特性，能确保收获金线莲植株成品的多样性及其其药效，提高金线莲中药材使用的安全性，是种苗的规模化生产的高新生物技术，技术独特且简单实惠，应用价值高，对濒危紧缺金线莲药用植物资源再生和持续利用具有十分重要意义，满足健康产业对珍贵中药材金线莲的巨大市场需求。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

本发明实施例中金线莲的培育在广东省惠州市博罗县罗浮山金线莲原生地中(北纬114°，东经23°)，选取生长健壮、茎粗、叶色艳红、叶片大、叶片网纹清晰且多、抗逆性、抗病虫害强的野外健康株系，于玻璃水帘温室中建立金线莲种质圃中。

本发明全自然光照培养室是使用钢化玻璃建成透光的培养室，配备遮阳系统、控温设备、培养架。遮阳系统包括内外遮阳网，通过调控内外遮阳网使培养室内的光照强度为500～5000Lux。控温设备采用冷暖两用空调，可将玻璃培养室的温度控制在20～25℃。培养架宽为60厘米，高为250厘米，离地面10厘米为培养架底层，层距60厘米，共四层，培养架长度可根据培养室的大小而定。

实施例1

1.金线莲于开花季节进行人工授粉并套袋，选取授粉后60天的蒴果为外植体，自来水下洗净后，浸泡在洗衣粉水中并轻轻摇动约10min，清水洗净后拿至超净工作台，75％酒精浸泡30s，再在0.1％升汞中浸泡并摇动15min，无菌水冲洗5次后，用无菌纸吸干蒴果表面水分，接着用无菌手术刀切开蒴果，将蒴果内的种子全部洗脱至一装有100毫升无菌水的三角瓶中，每个蒴果的种子对应洗脱至一瓶装有100毫升无菌水的三角瓶，制成种子悬浮液。

2.对每个蒴果种子悬浮液进行种子密度的检测，在摇匀情况下用无菌移液枪吸取10微升于生物显微镜下计算其种子数量，每瓶种子悬浮液重复取10次计算其平均每毫升种子数。根据每瓶悬浮液种子浓度用无菌水进一步稀释成种子浓度为15粒/毫升的接种用的种子悬浮液。无菌条件下用无菌吸管吸取播种用的种子悬浮液2毫升至装有120毫升的一次成苗固体培养基的650毫升的兰花培养瓶中，每瓶金线莲的种子数量30粒。

3.培养基的配方：每升含花宝1号2.0～3.0g，花宝2号2.0～3.0g，蛋白胨2.0～3.0g，土豆泥50.0～60.0g，香蕉泥80.0～100.0g，苹果泥10.0～20.0g，活性碳1.5～2.0g，肌醇80.0～120.0mg，甘氨酸2.0～3.0mg，盐酸硫胺素(VB1)0.2～0.5mg，盐酸吡哆醇(VB6)0.5～1.0mg，烟酸4.0～5.0mg，萘乙酸(NAA)0.2～0.5mg，蔗糖20.0～30.0g，琼脂5.0～5.5g，pH 5.4～5.6。

4.原球茎诱导培养：将种子悬浮液均匀分布培养基表面上，将此培养瓶放置全自然光培养室中的培养架的底层上，保持其光照强度在1000Lux，保持培养室温度在20℃。此条件下培养60天，种子萌发形成原球茎，原球茎长出根和叶片形成幼苗。

5.幼苗培养：将幼苗移动至培养架的第二或第三层，加强其自然光照培养，其光照强度在1000Lux，促进小苗生长，培养温度为24℃，此时期培养时间为90天，小苗长成大苗，苗高3～5cm，3～5片～叶片，3～5条根须，根长1～3厘米。

6.大苗培养：将大苗移动至培养架的第一层，在光照强度未5000Lux，培养温度为21℃下进行培养60天，既可以促进大苗的生长，又可以达到炼苗的效果。此时金线莲苗苗高8.0～10.0cm，有4-6节，4片以上叶片，3条以上根，茎粗2.0mm以上，达到出苗的标准，培育得到金线莲种苗。

7.瓶苗移栽：移栽时将金线莲种苗从培养瓶中取出生根苗，洗净附着的培养基后，用0.1％的高锰酸钾溶液浸泡5.0min，种植基质采用混合基质(泥炭：珍珠岩＝8:1)，注意保持湿度在85％RH以上，温度为27℃，光照强度为5000Lux条件下，30d左右成活后的植株能产生新的根系，进行正常水、肥、药管理，成活率可达98％。

实施例2

1.金线莲于开花季节进行人工授粉并套袋，选取授粉后70天的蒴果为外植体，自来水下洗净后，浸泡在洗衣粉水中并轻轻摇动约10min，清水洗净后拿至超净工作台，75％酒精浸泡30s，再在0.1％升汞中浸泡并摇动15min，无菌水冲洗3次后，用无菌纸吸干蒴果表面水分，接着用无菌手术刀切开蒴果，将蒴果内的种子全部洗脱至一装有100毫升无菌水的三角瓶中，每个蒴果的种子对应洗脱至一瓶装有100毫升无菌水的三角瓶，制成种子悬浮液。

2.对每个蒴果种子悬浮液进行种子密度的检测，在摇匀情况下用无菌移液枪吸取10微升于生物显微镜下计算其种子数量，每瓶种子悬浮液重复取10次计算其平均每毫升种子数。根据每瓶悬浮液种子浓度用无菌水进一步稀释成种子浓度为20粒/毫升的接种用的种子悬浮液。无菌条件下用无菌吸管吸取播种用的种子悬浮液2毫升至装有150毫升的一次成苗固体培养基的650毫升的兰花培养瓶中，每瓶金线莲的种子数量40粒。

3.培养基的配方：每升含花宝1号2.0～3.0g，花宝2号2.0～3.0g，蛋白胨2.0～3.0g，土豆泥50.0～60.0g，香蕉泥80.0～100.0g，苹果泥10.0～20.0g，活性碳1.5～2.0g，肌醇80.0～120.0mg，甘氨酸2.0～3.0mg，盐酸硫胺素(VB1)0.2～0.5mg，盐酸吡哆醇(VB6)0.5～1.0mg，烟酸4.0～5.0mg，萘乙酸(NAA)0.2～0.5mg，蔗糖20.0～30.0g，琼脂5.0～5.5g，pH 5.4-5.6。

4.原球茎诱导培养：将种子悬浮液均匀分布培养基表面上，将此培养瓶放置全自然光培养室中的培养架的底层上，保持其光照强度在100Lux，保持培养室温度在24℃，此条件下培养90天，种子萌发形成原球茎，原球茎长出根和叶片形成幼苗。

5.幼苗培养：将幼苗移动至培养架的第二或第三层，加强其自然光照培养，其光照强度在2000Lux，促进小苗生长，培养温度为20℃，此时期培养时间为90天，小苗长成大苗，苗高3～5cm，3～5片～叶片，3～5条根须，根长1～3厘米。

6.大苗培养：将大苗移动至培养架的第一层，在光照强度未5000Lux，培养温度为25℃下进行培养60天，既可以促进大苗的生长，又可以达到炼苗的效果。此时金线莲苗苗高8.0～10.0cm，有4-6节，4片以上叶片，3条以上根，茎粗2.0mm以上，达到出苗的标准，培育得到金线莲种苗。

7.瓶苗移栽：移栽时将金线莲种苗从培养瓶中取出生根苗，洗净附着的培养基后，用0.1％的高锰酸钾溶液浸泡5.0～10.0min，种植基质采用混合基质(泥炭：珍珠岩＝8:1)，注意保持湿度在85％RH以上，温度为23～27℃，光照强度为5000～10000Lux条件下，30d左右成活后的植株能产生新的根系，进行正常水、肥、药管理，成活率可达99％。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合和简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种培育金线莲种苗的方法，其特征在于，包括如下具体步骤：

S1.选取生长健壮、萌芽率高、抗逆性、抗病虫害强的金线莲，于开花季节进行人工授粉并套袋，取授粉后的蒴果为外植体；

S2.种子悬浮液的制作：将外植体洗净，经浸泡处理后用无菌水冲洗，用无菌纸吸干蒴果表面水分，再用无菌刀切开蒴果，将蒴果内的种子全部洗脱至无菌水中，制成种子悬浮液；

S3.原球茎诱导培养：无菌条件下将种子悬浮液均匀分布在培养基中，置于全自然光培养室中，在光照和温度为20～24℃下培养，种子萌发形成原球茎，原球茎长出根和叶片形成幼苗；

S4.幼苗培养：将幼苗在光照和温度为20～24℃下培养，长成大苗；

S5.大苗培养：将大苗在光照和温度为21～25℃下培养，达到出苗的标准，培育得到金线莲种苗。

2.根据权利要求1所述的培育金线莲种苗的方法，其特征在于，步骤S1中所述授粉的时间为60～70天，所述套袋为硫酸纸。

3.根据权利要求1所述的培育金线莲种苗的方法，其特征在于，步骤S2中所述冲洗的次数为3～5次，所述种子悬浮液的浓度为15～20粒/毫升。

4.根据权利要求1所述的培育金线莲种苗的方法，其特征在于，步骤S2中所述浸泡处理是先在洗衣粉水中并摇动，清水洗净后用75％的乙醇浸泡，再在0.1％的升汞中浸泡并摇动。

5.根据权利要求4所述的培育金线莲种苗的方法，其特征在于，所述洗衣粉水的浓度为0.2％～0.5％，所述浸泡的时间为30～60s。

6.根据权利要求1所述的培育金线莲种苗的方法，其特征在于，步骤S3中所述培养基的配方为：每升水溶液中含花宝1号2～3g，花宝2号2～3g，蛋白胨2～3g，土豆泥50～60g，香蕉泥80～100g，苹果泥10～20g，活性碳1.5～2g，肌醇80～120mg，甘氨酸2～3mg，盐酸硫胺素0.2～0.5mg，盐酸吡哆醇0.5～1mg，烟酸4～5mg，萘乙酸0.2～0.5mg，蔗糖20～30g和琼脂5～5.5g，所述培养基的pH＝5.4～5.6。

7.根据权利要求1所述的培育金线莲种苗的方法，其特征在于，步骤S3中所述全自然光培养室包括遮阳系统、控温设备和培养架；所述遮阳系统包括内遮阳网和外遮阳网，所述培养架分为底层，第二层、第三层和顶层共四层，所述控温设备采用冷暖两用空调，可将玻璃培养室的温度控制在20～25℃。

8.根据权利要求1所述的培育金线莲种苗的方法，其特征在于，步骤S3中所述光照的强度为100～1000Lux，所述培养的时间为60～90天。

9.根据权利要求1所述的培育金线莲种苗的方法，其特征在于，步骤S4中所述光照的强度为1000～2000Lux，所述培养的时间为80～90天。

10.根据权利要求1所述的培育金线莲种苗的方法，其特征在于，步骤S5中所述光照的强度为3000～5000Lux，所述培养的时间为60～90天。