CN102972295A - 太子参人工脱毒种子的制作方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种太子参人工脱毒种子的制作方法，该方法通过将太子参外植体脱毒后，诱导微球形种根，种根在生物反应器内扩繁后用海藻酸钠包埋成人工种子，土壤发芽试验发现，发芽率达90％以上。用本发明的方法制作的太子参人工种子，可以在4℃下，存放一年以上，生产上有巨大的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程，特别涉及一种太子参人工脱毒种子的制作方法。
背景技术
太子参是一味珍贵的滋补类中草药，以根入药，具有补气健脾，增强人体免疫力的作用，《神农本草经》中列为上品。近年来太子参在医疗、保健、化妆品等方面的价值被全面开发，由于用量巨大，造成对野生植物资源的超量采挖，目前市场上的太子参主要来源于大田种植。太子参多采用无性繁殖，“种根”在繁殖过程中很容易感染植物病毒，一经染毒很难去除而且会越来越严重，极大降低了太子参的产量和质量。经对现有技术文献的检索发现，吴朝峰等在《福建农林大学学报》上发表的文章“太子参脱毒与增产效果”一文中指出，脱毒太子参的增产效果达到102.7％，但脱毒品种大田培养3-5年后，有很大的概率再次感染病毒。大规模种植时，需要反复脱毒、诱导种根，造成大量的时间和资源浪费。
发明内容
本发明的目的，就是为了提供一种太子参人工脱毒种子的制作方法。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：一种太子参人工脱毒种子的制作方法，包括如下步骤：
步骤一，用氯气对太子参种子表面进行消毒，然后将太子参种子接种到种子萌发培养基中暗培养；
步骤二，种子萌发后切取胚尖生长点进行脱毒处理，然后将胚尖生长点接种到成苗培养基中成苗；
步骤三，胚尖生长点成苗后进行病毒检测，选择不带病毒的植株，转入诱导培养基中培养，生产微球型根；
步骤四，将微球型根接种到生物反应器内扩繁；
步骤五，将扩繁后的微球型根用海藻酸钠包埋，形成微球型根的海藻酸钠包埋丸；
步骤六，将包埋丸捞出来，放入无菌水中浸泡10分钟后捞出，于4℃保存。
步骤一所述种子萌发培养基为添加1-2mg/L赤霉素的MS培养基。
步骤二所述成苗培养基为添加0.8-1.5mg/L6-苄氨基嘌呤的MS培养基。
步骤三所述胚尖生长点为带一片叶原基的生长点。
步骤三所述诱导培养基为添加35-50mg/L矮状素，0.05-0.1mg/L噻苯隆的MS培养基。
步骤四所述生物反应器为鼓泡式连续培养生物反应器。
步骤五所述用海藻酸钠包埋是指，先将扩繁后的微球型根浸泡到含3.5％海藻酸钠的1/2MS液体培养基中，然后用吸管将微球型根逐个吸起滴入2％CaCl2中停留15分钟，使每个微球型根都形成被海藻酸钠包埋的微球型根的海藻酸钠包埋丸。
步骤三所述微球型根是直径4-10毫米的不规则球形根。
上述MS培养基为Murashige和Skoog(1962)公开的培养基，其中1/2MS培养基为大量元素减半的MS培养基。
本发明太子参人工脱毒种子的制作方法将太子参外植体脱毒后，诱导微球形种根，种根在生物反应器内扩繁后用海藻酸钠包埋成人工种子。土壤发芽试验发现，发芽率达90％以上。本发明制作的太子参人工种子，可以在4℃下，存放一年以上，生产上有巨大的应用价值。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
本实施例的太子参种子来自中国药科大学。
本实施例所述MS培养基采用Murashige和Skoog(1962)公开的培养基，具体成分如表1所示：
表1
本发明太子参人工脱毒种子的制作方法具体包括如下步骤：
步骤一，用75毫升次氯酸钠与25毫升浓盐酸生成的氯气对太子参种子表面消毒60分钟后，接种到添加有1-2mg/L赤霉素的MS培养基中，获得无菌材料，并于黑暗中培养一周；
步骤二，种子萌发后切取带一个叶原基的生长点，接种到成苗培养基中培养成苗，所用成苗培养基为添加0.8-1.5mg/L6-苄氨基嘌呤的MS培养基。
步骤三，生长点成苗后用扫描电镜检测进行病毒检测；
步骤四，选择不带病毒的植株，转入诱导培养基产生微球型根；所用诱导培养基为添加35-50mg/L矮状素和0.05-0.1mg/L噻苯隆的MS培养基。
步骤五，将微球型根接种到鼓泡式连续培养生物反应器内扩繁；
步骤六，将扩繁后的微球型根浸泡到含3.5％海藻酸钠的1/2MS液体培养基中，然后用吸管将微球型根逐个吸起滴入2％CaCl2中停留15分钟，使每个微球型根都形成被海藻酸钠包埋的微球型根的海藻酸钠包埋丸。
步骤七，将包埋丸捞出来，放入无菌水中10分钟后捞出，于4℃保存。
本方法中，平均每棵苗可以诱导出来15个微球型根。所用反应器为鼓泡式，工作体积为5升，通气速率为0.3vvm。微球型根在反应器中21天内数量增加了两倍。海藻酸钠包埋后形成的人工种子，在土壤中的出苗率达到90％以上。
Claims (8)
1.一种太子参人工脱毒种子的制作方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，用氯气对太子参种子表面进行消毒，然后将太子参种子接种到种子萌发培养基中暗培养；
步骤二，种子萌发后切取胚尖生长点进行脱毒处理，然后将胚尖生长点接种到成苗培养基中成苗；
步骤三，胚尖生长点成苗后进行病毒检测，选择不带病毒的植株，转入诱导培养基中培养，生产微球型根；
步骤四，将微球型根接种到生物反应器内扩繁；
步骤五，将扩繁后的微球型根用海藻酸钠包埋，形成微球型根的海藻酸钠包埋丸；
步骤六，将包埋丸捞出来，放入无菌水中浸泡10分钟后捞出，于4℃保存。
2.如权利要求1所述的太子参人工脱毒种子的制作方法，其特征在于：步骤一所述种子萌发培养基为添加1-2mg/L赤霉素的MS培养基。
3.如权利要求1所述的太子参人工脱毒种子的制作方法，其特征在于：步骤二所述成苗培养基为添加0.8-1.5mg/L6-苄氨基嘌呤的MS培养基。
4.如权利要求1所述的太子参人工脱毒种子的制作方法，其特征在于：步骤三所述胚尖生长点为带一片叶原基的生长点。
5.如权利要求1所述的太子参人工脱毒种子的制作方法，其特征在于：步骤三所述诱导培养基为添加35-50mg/L矮状素，0.05-0.1mg/L噻苯隆的MS培养基。
6.如权利要求1所述的太子参人工脱毒种子的制作方法，其特征在于：步骤四所述生物反应器为鼓泡式连续培养生物反应器。
7.如权利要求1所述的太子参人工脱毒种子的制作方法，其特征在于：步骤五所述用海藻酸钠包埋是指，先将扩繁后的微球型根浸泡到含3.5％海藻酸钠的1/2MS液体培养基中，然后用吸管将微球型根逐个吸起滴入2％CaCl2中停留15分钟，使每个微球型根都形成被海藻酸钠包埋的微球型根的海藻酸钠包埋丸。
8.如权利要求1所述的太子参人工脱毒种子的制作方法，其特征在于：步骤三所述微球型根是直径4-10毫米的不规则球形根。
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