CN101243774A - 一种以幼嫩叶片为外植体的川芎组织培养快繁方法 - Google Patents

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马丹炜
吴洁
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Abstract

本发明公开了一种以幼嫩叶片为外植体的川芎组织培养快繁方法，该方法包括外植体的消毒、愈伤组织的培养、分化培养、生根培养、炼苗和移栽步骤，所采用的愈伤组织培养基为MS+6－BA 0～0.5mg/L+2，4－D1～3mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5～7.0g/L；分化培养基为MS+6－BA0.1～0.5mg/L+NAA0.1～0.8mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5～7.0g/L；生根培养基为1/2MS+NAA0.1～0.5mg/L+IBA0.1～0.5mg/L+蔗糖15g/L+琼脂6.5～7.0g/L。本发明方法可以大量快速繁殖出生长速度快、品质优、染菌率低的川芎组培苗，从而满足大规模生产川芎的需求。

Description

一种以幼嫩叶片为外植体的川芎组织培养快繁方法
技术领域
本发明涉及一种通过组织培养技术的植物再生方法，特别是涉及一种以幼嫩叶片为外植体的川芎组织培养快繁方法。
背景技术
川芎为我国最常见的中药材之一，同时也是近几年国际市场的畅销植物药，是许多保健品和药品的重要原料。由于该药材受地理条件的限制，所以其栽种面积有限，主要分布在我国四川省都江堰。川芎为两年生植物，由于川芎植物结实困难，历来川芎的育种方法都是采用传统的茎节营养繁殖栽培，这种方法由于育种期间需要进行山区育苓、坝区栽种等环节，因此育种周期较长；另外，所采用的种芎种质资源“苓种”自身存在易衰老和易受病毒侵染等缺陷，因而造成川芎种性退化和品质下降，并易使川芎在生产和储藏中大量产生各种严重的病虫害。因此川芎的种质资源质量问题及育种时间长一直是困扰川芎大规模生产和提高产品质量的难题。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中存在的育种时间长、种质资源不稳定、“苓种”自身易衰老和带菌等问题而提供一种以幼嫩叶片为外植体的川芎组织培养快繁方法，该方法可以大量快速地繁殖出生长速度快、品质优和染菌率低的川芎组培苗。
为达到上述目的，本发明采用的解决方案是：先将作为外植体的川芎幼嫩叶片进行消毒处理，然后将叶片剪成适当大小，接种到愈伤组织培养基上；45天后将愈伤组织分割成适当大小，再转接到不定芽的分化培养基上，当芽长至2～3cm以上时，将其切下转接到生根培养基上进行生根培养，并将基部愈伤组织再切成小块，转接到不定芽分化培养基上，以便形成更多的不定芽；当组培苗不定根长至2cm以上时，打开瓶盖，在室内炼苗3～4天后，将组培苗从培养瓶中取出，洗去培养基，将其移栽至松软的蛭石介质中；
上述愈伤组织培养基为：MS+6-BA 0～0.5mg/L+2.4-D 1～3mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L，PH值5.8～6.5；
上述分化培养基为：MS+6-BA 0.1～0.5mg/L+IAA 0.1～0.8mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L，PH值5.8～6.5；
上述生根培养基为：1/2MS+NAA 0.1～0.5mg/L+IBA 0.1～0.5mg/L+蔗糖15g/L+琼脂7.0g/L，PH值5.8～6.5；
上述培养条件为：温度18～22℃、每天光照11～13小时、光照强度1500～2000Lx。
上述解决方案中可采用的外植体消毒方法可以有很多，常用的消毒剂有70～75％乙醇、次氯酸钠溶液、二氯化汞溶液等，本发明优选的方法是先用洗衣粉浸泡外植体2～5分钟，再用流水冲洗2～3小时，然后在无菌条件下分别采用浓度为70～75％的乙醇消毒10～20秒、浓度为0.1％的升汞处理3～6分钟，最后用无菌水冲洗3～4次。
上述解决方案中将组培苗移栽至松软的蛭石介质后，应适当遮光，并保持温度在18～22℃，相对湿度为75～85％，这样组培苗的生长更快、更健壮。
上述解决方案中的最佳愈伤组织培养基为：MS+6-BA 0.5mg/L+2，4-D2mg./L+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L。经试验发现，一定范围内的2，4-D有利于愈伤组织生长，但过高的2.4-D浓度则有抑制愈伤组织生长的作用，并发现单独使用2，4-D的培养基产生的愈伤组织生长速度较快，且十分有利于川芎进行细胞悬浮培养，但不利于后期的不定芽分化；而同时加入了2.4-D和6-BA两种激素的培养基产生的愈伤组织虽生长速度稍慢，但有利于后期的不定芽分化，所以本发明优选的愈伤组织培养基为MS+6-BA0.5mg/L+2，4-D 2mg/L。
上述解决方案中的最佳分化培养基为：MS+6-BA 0.5mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L。采用这种浓度配比的分化培养基进行分化培养时，不定芽的诱导率最高，且苗生长速度快、健壮。
上述解决方案中的最佳生根培养基为：1/2MS+NAA 0.5mg/L+IBA0.5mg/L+蔗糖15g/L+琼脂7.0g/L。采用这种浓度配比的生根培养基进行生根培养时，生根率最高，且根分化速度快、根系发达及根粗壮。
本发明采用组织培养方法培养组培苗所花的时间与传统育种所花的时间相比大大缩短，而且培养的组培苗自身生长健壮、不易感染病毒，因此本发明具有的优点是：能在短时间内大量繁殖出优质的川芎组培苗，从而满足川芎大规模生产的需求。另外实施本发明方法，只需有简单的植物组织培养设备即可进行，因此实用性强，可行性高，且不受季节限制。
下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。
具体实施方式
实施例1
(1)外植体的消毒：
先将作为外植体的川芎幼嫩叶片放入洗衣粉液中浸泡2分钟，再用流水冲洗2.5小时，然后在无菌条件下分别采用浓度为70％的乙醇消毒10秒，浓度为0.1％的升汞处理3分钟，最后用无菌水清洗4次；
(2)愈伤组织的培养：
将消毒后的叶片剪成适当大小，接种到愈伤组织培养基MS+6-BA0.5mg/L+2，4-D2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L上，并在24～26℃、每天光照12小时、光照强度为1500～2000Lx进行培养，45天后统计诱导率为65％；
(3)分化培养：
45天后将愈伤组织分割成适当大小，转接到分化培养基MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L上，并在24～26℃、每天光照12小时、光照强度为1500～2000Lx进行分化培养，培养25天后，陆续开始在愈伤组织上有绿色芽点出现，经3～4周后长出不定芽，培养50天后统计不定芽的诱导率为45％；
(4)生根培养：
将长到2cm以上的不定芽从愈伤组织上切割下来，接种到生根培养基1/2MS+NAA0.5mg/L+IBA0.5mg/L+蔗糖15g/L+琼脂7.0g/L上进行生根培养，并把剩下的基部愈伤组织切成小块，再转接到上述不定芽分化培养基上，继续进行不定芽的诱导，以便形成更多的不定芽。不定芽在转接到生根培养基上35天左右陆续在茎基部四周长出较粗壮的不定根，培养50天后统计生根率为64％；
(5)炼苗和移栽：
当组培苗长至2cm以上时，选择生长较健壮、根系较发达的壮苗逐渐打开瓶盖，让幼苗慢慢地适应周围环境，在室内炼苗3天后，移栽至松软的蛭石介质中，适当遮光，温度保持在20℃左右，相对湿度在75～85％，组培苗生长健壮。
实施例2
愈伤组织培养基采用MS+2，4-D2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L，其它步骤同实施例1。采用该愈伤组织培养基诱导愈伤组织，45天后统计其诱导率为67.5％，略高于实施例1。所产生的愈伤组织生长速度较快，且十分有利于川芎进行细胞悬浮培养，但不利于后期的不定芽分化。而采用实施例1的愈伤组织培养基虽然诱导率稍低，愈伤组织生长速度稍慢，但有利于后期不定芽的分化。
实施例3
愈伤组织培养基采用MS+6-BA0.5mg/L+2，4-D3mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L，其它步骤同实施例1。采用该愈伤组织培养基诱导愈伤组织，45天后统计其诱导率为55％，低于实施例1、实施例2，但不明显。而当2，4-D的浓度为4mg/L时，45天后统计其诱导率仅为25％，出现了明显下降。
实施例4
分化培养基采用MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L，其它步骤同实施例1。50天后统计其不定芽诱导率为27.5％，低于实施例1。
实施例5
分化培养基采用MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L上，其它步骤同实施例1。50天后统计其不定芽诱导率为17.5％。
实施例6
分化培养基采用MS+6-BA0.3mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L，其它步骤同实施例1，50天后统计其不定芽诱导率为42％。
实施例7
生根培养采用1/2MS+NAA0.3mg/L+IBA0.5mg/L+蔗糖15g/L+琼脂7.0g/L，其它步骤同实施例1。50天后统计生根率为53％。
实施例8
生根培养基采用1/2MS+NAA0.1mg/L+IBA0.5mg/L+蔗糖15g/L+琼脂7.0g/L，其它步骤同实施例1。50天后统计生根率为40.2％。
实施例9
生根培养基采用1/2MS+NAA0.5mg/L+IBA0.3mg/L+蔗糖15g/L+琼脂7.0g/L，其它步骤同实施例1。50天后统计生根率为51％。
实施例10
生根培养基采用1/2MS+NAA0.5mg/L+IBA0.1mg/L+蔗糖15g/L+琼脂7.0g/l，其它步骤同实施例1。50天后统计生根率为36.2％。

Claims (6)

1.一种以幼嫩叶片为外植体的川芎组织培养快繁方法，其特征在于：先将作为外植体的川芎幼嫩叶片进行消毒处理，然后将叶片剪成适当大小，接种到愈伤组织培养基上；45天后将愈伤组织分割成适当大小，再转接到不定芽的分化培养基上；当芽长至2～3.0cm以上时，将其切下转接到生根培养基上进行生根培养，并将基部愈伤组织再切成小块，转接到不定芽分化培养基上，以便形成更多的不定芽；当组培苗不定根长至2cm以上时，打开瓶盖，在室内炼苗3～7天后，将组培苗从培养瓶中取出，洗去培养基，将其移栽至松软的蛭石介质中；
上述愈伤组织培养基为：MS+6-BA 0～0.5mg/L+2，4-D 1～3mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L，PH值5.8～6.5；
上述分化培养基为：MS+6-BA 0.1～0.5mg/L+IAA 0.1～0.8mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L，PH值5.8～6.5；
上述生根培养基为：1/2MS+NAA 0.1～0.5mg/L+IBA 0.1～0.5mg/L+蔗糖15g/L+琼脂7.0g/L，PH值5.8～6.5；
上述培养条件为：温度18～22℃、每天光照11～13小时、光照强度1500～2000Lx。
2.根据权利要求1所述的一种以幼嫩叶片为外植体的川芎组织培养快繁方法，其特征在于：所采用的消毒方法是先用洗衣粉浸泡外植体2～5分钟，再用流水冲洗2～3小时，然后在无菌条件下分别采用70～75％的乙醇消毒10～20秒、0.1％升汞处理3～6分钟，最后用无菌水冲洗3～4次。
3.根据权利要求1或2所述的一种以幼嫩叶片为外植体的川芎组织培养快繁方法，其特征在于：将组培苗移栽至松软的蛭石介质后，应适当遮光，并保持温度在20～25℃，相对湿度为75～85％。
4.根据权利要求1所述的一种以幼嫩叶片为外植体的川芎组织培养快繁方法，其特征在于：愈伤组织培养基为MS+6-BA 0.5mg/L+2，4-D 2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L。
5.根据权利要求1所述的一种以幼嫩叶片为外植体的川芎组织培养快繁方法，其特征在于：分化培养基为：MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L。
6.根据权利要求1所述的一种以幼嫩叶片为外植体的川芎组织培养快繁方法，其特征在于：生根培养基为1/2MS+NAA 0.5mg/L+IBA 0.5mg/L+蔗糖15g/L+琼脂7.0g/L。
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