CN105660357B

CN105660357B - 一种浒苔人工半咸水生态育苗法

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Publication number: CN105660357B
Application number: CN201610055157.3A
Authority: CN
Inventors: 周呈祥; 张繁荣; 叶伟武; 甄凯旋
Original assignee: 叶伟武
Current assignee: HANGZHOU ENJOY SCIENTECH Co.,Ltd.
Priority date: 2016-01-27
Filing date: 2016-01-27
Publication date: 2018-10-26
Anticipated expiration: 2036-01-27
Also published as: CN105660357A

Abstract

本发明公开了一种浒苔人工半咸水生态育苗法，其按如下步骤进行：（1）配制人工半咸水培养液，备用；（2）黄绿色浒苔清洗数次，吸干表面水份，将样品放置于的干燥箱中阴至半干；（3）将阴至半干的浒苔样品在含有碘液人工咸水中消毒数分钟；剪切藻段处理后，放入盛有人工半咸水培养液与附着基质的培养容器中并用保鲜膜封口；（4）置于光照培养箱中培养；（5）待发散的浒苔孢子或配子充分附着在附着基质后，引入浮游动物、并投加食用酵母，使培养容器中形成一个生态育苗系统。本发明浒苔人工半咸水生态育苗方法操作简单，且原料易得、价格便宜、成本低、培养粗放，特别适合于内陆地区或实验室进行浒苔相关的研究。

Description

一种浒苔人工半咸水生态育苗法

技术领域

本发明属于藻类的人工半咸水生态育苗技术领域，具体涉及一种浒苔(Ulvaprolifera)人工半咸水生态育苗的培养方法。

背景技术

浒苔隶属绿藻门(Chlorophyta)、绿藻纲(Chlorophyceae)、石莼目(UlvaIes)、石莼科(Ulvaceae)、浒苔属(Enteromorpha prolifera)，主要有条浒苔、肠浒苔、扁浒苔、浒苔、小管浒苔5种，是我国海洋野生植物资源中极为丰富的大型经济藻类，广泛地分布于海洋沿岸中、低潮区的沙砾、岩石、滩涂和石沼中。浒苔藻体管状、中空、膜质，细胞单层，主枝明显，分枝细长，高可达lm。浒苔藻色鲜艳，味道鲜美，含有许多人体必需的营养成份，我国浒苔的生长盛期大致为12月至次年4月。

沿海海域的富营养化是导致大型海藻大量繁殖的主要原因之一，自2007年至今，我国黄海外海已连续9年暴发浒苔绿藻灾害，导致了一系列的环境问题与经济损失。目前对浒苔的研究多见于营养价值、繁殖生物学、种质鉴定、营养盐的吸收动力学等方面。浒苔的实验室研究培育多用天然海水，且多为无菌培养，其具有育苗时间长、内地实验室对其研究成本高等不足。

发明内容

本发明针对浒苔本盐度适应范围广的特点，设计出一种适合于浒苔生长的人工半咸水配方、与粗放式生态育苗法，其特别适合于内陆地区或实验室进行浒苔相关的研究。

本发明采取如下技术方案：

一种浒苔人工半咸水生态育苗法，其按如下步骤进行：

(1)配制人工半咸水培养液，备用；

(2)黄绿色浒苔清洗数次(如4-5次)，吸干表面水份，将样品放置于(如5-15℃)的干燥箱中阴至半干；

(3)将阴至半干的浒苔样品在含有碘液人工咸水中消毒数分钟(如2分钟)，以清除其中含有杂菌、杂藻、原生动物；剪切藻段处理后，放入盛有人工半咸水培养液与附着基质的培养容器中并用保鲜膜封口；

(4)置于光照培养箱中培养；此步骤优选是：温度(22±1)℃，前48h全黑暗培养；48h后开始增加光照，光照强度3000～3500Lx，光照周期L：D＝12h：12h，全部用日光灯照明，培养方式为液体静置培养，每天早、晚晃动培养液1次。

(5)待发散的浒苔孢子或配子充分附着在附着基质(如1-2天)后，引入浮游动物、并投加食用酵母，使培养容器中形成一个简易的共生共荣的生态育苗系统。

优选的，步骤(1)：配制人工半咸水培养液：

A、培养液包括：主要阴阳离子(Na⁺、Cl^-、Mg²⁺、SO₄ ^2-、K⁺、HCO₃ ^-)、微量元素(Fe、Br、B、Sr、I)及营养元素(N、P)构成。

B、具体优选的配方有如下四种：

C、配方中除NaHCO₃采用水溶液进微孔滤膜过滤除菌，微孔滤膜的孔径为0.22μm最后加入到冷却至30℃以下的培养基外，其它配方组分均逐一溶解，配成培养液进行高温灭菌。

优选的，步骤(2)中：

A、用滤纸片或纸巾吸干浒苔幼苗表面的多余水分。

B、对浒苔藻体进行低温阴至半干，有利于诱导浒苔形成孢子囊。

C、浒苔孢子/配子苗的附着基质：为大理石、玻璃、卵石上、蓝色/蓝绿色渔网网片、窗纱、塑料片等。

优选的，步骤(3)中：

A、含有碘液人工咸水：含有0.7％碘液的人工半咸水。

B、用手术剪或手术刀剪切浒苔成0.1-1mm藻段，有利于诱导浒苔形成孢子囊。

优选的，步骤(4)：先全暗培养48小时，48小时后打开光照灯。

优先的，步骤(5)：

A、引入浮游动物：首选为蒙古祼腹溞、褶皱臂尾轮虫。

B、投加食用酵母：首选海洋酵母、安琪酶母。

用人工半咸水进行浒苔育苗优点：1、有利于克服地域限制，吸引更多的研究者参加研究，加速浒苔工程研究的进展。2、人工半咸水培养液中不含或极少含(可能作为其它成分的杂质而微量掺入)硅元素，也没含硅藻，因此，用人工半咸水培养液进行培养可以有效防止由培养液里的硅藻或其它杂藻的污染(故培养液中不用加入GeO₂)。即使不慎因种藻处理不彻底进入了硅藻污染，也不易引起后者大量生长与繁殖而造成严重危害。3、本发明设计人工半咸水配方时，主配方是内陆地区河蟹工厂化育苗的生产配方，故更能贴近生产的实际应用。

浒苔在人工半咸水育苗废水的循环利用中的应用前景：虾、蟹工厂化人工育苗技术试验研究成功后，经过几十年实践，已建立了较为完整的技术体系。人工半咸水虾、蟹育苗，其配制半咸水的原料费用在育苗成本所占比例较大，所以，对育苗废水进行净化与回收利用是降低育苗成本的重要途径。

水质是育苗成功与否的关键因子之一，为了摸清在河蟹人工繁育中水质主要因子的动态变化规律，何望在河蟹的人工海水育繁育中，对水质进行了跟踪分析，人工海水在整个河蟹的繁育中，其Ca²⁺、Mg²⁺、SO₄ ^2-、PH、S‰的稳定性是很强的。在育苗过程中水质恶化的主要原因是残饵和泄物造成的三氮含量的提高、以及由此引起的单胞藻的大量繁殖和未分解的残饵、粪便和幼苗尸体死亡尸体残骸造成的COD升高。赵乃刚、杨振久利用物理、化学、生物学相结合的方法使育苗废水得以净化(经过廿天左右的循环，人工半咸水的主要成分含量没有显著变化。如果排除分析上的误差，主要差异反映在镁离子浓度与PH下降上)，实现了半咸水的循环再利用，大大地降低节约了海水的消耗。王武在“生物包”技术中引种了刚毛藻和根枝藻型丝状藻(建议拟引种高等藻类如江蓠、裙带菜为佳)对育苗水体进行深度净化处理，脱氮效果显著，而且过多的丝状藻类也便于捞取，生物量容易控制，相较杨振久利用小球藻净化效果显得更为优越。

工厂化集约养殖中，氨氮过高成为制约因素，传统方法只有依靠频繁换水来弥补这一问题，排放的污水势必会造成对水质资源的破坏，增加水质的富营养化。为了解决氨氮对单位养殖产量的影响，各国在逐步建立工厂循环养殖系统，利用微生物技术将过高的氨氮转换为硝酸氮，使养殖系统能够维持一定的高密度养殖水平。但这一系统存在致命的缺陷，即由氨氮转换来的硝酸氮并没有从系统中除去，仍以很高的浓度(20～80mg/l)积累在养殖系统中，也必须依靠换水来降低度过高的硝酸氮。因此，目前各国都在研究和发展一种环保式综合循环养殖系统，即利用海藻深度净化吸收系统中的氮和磷，这是应用海藻生物技术和生态修复原理对水产养殖系统的进行的一次革命。王阳阳、史明华、田千桃等研究的浒苔对NO₃-N、NH₄-N、PO₄-P、吸收动力学特性中，结果显示浒苔对于水体中的氮、磷有着极强的吸收能力，特别是对氮的吸收达到极高数值，几乎不受环境氮磷比变化的影响。李俭平的研究表明，浒苔可以有效利用NO₃-N、NH₄-N、和有机N源酵母抽提物及中低度浓度的NO₂-N(≤50umol)和尿素氮，与其他N源共同存在时浒苔可以优先利用NH₄-N。田千桃的研究表明，浒苔与条浒苔在5h内对NH4-N的去除率的效率要高于细基江蓠繁枝变种、龙须菜和真江蓠。

综合上述，本发明考虑运用浒苔人工育苗技术，充分利用浒苔的高效吸收氮、磷的特性，对虾、蟹育苗人工半咸水的废水进行深度净化，以实现海水的高效利用，最终达到提高苗种成活率与降低生产成本之目的。

本发明浒苔人工半咸水生态育苗方法操作简单，且原料易得、价格便宜、成本低、培养粗放，特别适合于内陆地区或实验室进行浒苔相关的研究。

附图说明

图1是黄绿色浒苔种藻图。

图2是有气泡的浒苔种藻图。

图3是藻段生殖细胞囊图。

图4是盖玻片上附着的浒苔小苗图。

图5是蓝色尼龙丝附着的孢子图。

图6是附着在人造大理石上的浒苔苗图。

图7是蓝绿色网片附着的浒苔小苗图。

图8是附着在藻段上的浒苔小苗图。

图9是附网静置培养45d的浒苔图。

具体实施方式

下面对本发明优选实施例作详细说明。

浒苔样品＜苏州大学沈颂东教授(海洋藻类专家)对其进行分子生物学方法鉴定为浒苔＞于2013年11月17日采自江苏省东台紫菜养殖区的紫菜养殖网架，选择藻体浒苔颜色鲜艳，状态良好的藻体1.0kg，采集后滤干水分装入塑料袋中通过快递公司送达滁州市(气温约10～15℃，中途历时48h)，收到浒苔立即采用淡水稍作清洗后，放入人工半咸水中进行充氧(充气泵)12h复苏后备用。

1.2、实验步骤

1.2.1、附着基的准备

用盖玻片、6cm*10cm人造大理石,缠绕有红、白、蓝、蓝绿尼龙丝的载波片；2cm*2cm红色网片、蓝色渔网网片、蓝绿色渔网网片,白色窗纱网片各若干作为浒苔孢子/配子的附着基。将附着基反复用沸水浸泡数次，以清除附着基上的对浒苔有害物质后备用。

1.2.2、人工半咸水的配方

按如下表1配置四组配方。

表1

配制人工海水时，先将除NaHCO₃以外的各种成份用煮沸腾后的自来水(冷却到80℃)依次溶解并保持在900ml左右；待水温降到40℃以下时再加入经抽滤(微孔滤膜的孔径为0.22μm)除菌的NaHCO₃溶液和冷却到30℃以下的自来水(煮沸)至所需的数量和定容。

1.2.3、样品处理

1.2.3.1、称取5份黄绿色浒苔(成熟藻体；见附图1～2)

1.2.3.2、称取5份黄绿色浒苔，用面巾纸吸干水份，每份均为0.2g。将样品放在数显鼓风干燥箱(型号GZX-9140MBE上海博迅)中进行阴至半干((7℃，用时4h)，低温(7℃)处理6h后,再先用煮沸过冷却后的淡水快速冲洗，再用0.7％的碘液消毒2分种，以清除中含有杂菌、杂藻、原生动物。用1^#人工半咸水清洗；将浒苔剪切成0.5～1mm的藻段，分别放入盛有1#～5#人工半咸水培养的5个白口试剂瓶(125ml)中备用参照1.2.3.1中的方法对样品进行消毒、剪切藻段处理后，分别放入盛有1#-4#人工半咸水培养的5个烧杯(1000ml)中，备用。

1.2.4、培养条件

1.2.4.1、将放入有浒苔藻段、缠绕有蓝、蓝绿、白色、尼龙丝的载波片、大量石、载玻片、窗纱网片(附着基质均多次清洗并经过80℃水浴1小时以除去有害物质)的1#～4#人工半咸水培养液的烧杯(装培养液300ml)进行用保鲜膜封口(防水份蒸发)，置于光照培养箱(PGX-280B-22H)中培养，温度(22±1)℃，前48h黑暗培养；48h后开始增加光照，光照强度3000～3500Lx，光照周期L：D＝12h：12h，全部用日光灯照明，培养方式为液体静置培养，每天早、晚晃动培养液1次，待浒苔放散的孢子/配子充分附着后(目测窗纱网片或烧杯壁呈绿色)，后引入蒙古祼腹溞、褶皱臂尾轮虫(100-500ind/l)，每天早晚投喂1次活性海洋酵母/安琪酵母(10-20mg每次，投喂前用人工海水充分溶解，取上层菌悬液投喂)，以形成藻-蚤-菌简易生态系统，对培养时间为10d-45d，试验期间培养液不更换。

1.2.4、实验观察、图片采集

不定期用生物显微镜(OLYMPUS BH-2)对浒苔藻段放散孢子/配子，载玻片、尼龙丝、网片附着基附着孢子/配子等进行观察和数码相机(SONY)拍照与摄相。

2、结果

2.1、细胞在人工半咸水中发育与再生情况概述

根据本实施例在2013年11月19日至2014年1月10日期间，多次试验的结果来看，浒苔藻段的成活率，孢子/配子的释放量，附着基的附着量与孢子萌发与再生情况随人工海水培养液的不同也有所不同。但从总体上来看：1、许苔能在各种人工海水培养液中生长发育与释放孢子/配子。2、的配方均能进行强烈的光合作用，释放大量孢子/配子，附着在附着基上的孢子也能快速萌发与生长。3、向光的瓶(杯)壁有大量浒苔孢子/配子聚集附着。4、通过藻段通过阴干与黑暗培养处理能促进生浒苔生殖细胞囊的形成与孢子/配子放散，此观察结果与林阿朋试验情况一致。

2.2、不同配方人工半咸水培养结果的比较

兹将烧杯中浒苔藻段在不同培养液10天的颜色变化，盖玻片上附着浒苔小苗的情况的观察结果，简述如表2，见附图4。

表2光合作用与盖玻片上小苗情况对比

	1^#	2^#
			光合作用(产氧)	极强	极强
盖玻片小苗数(个)	18	25

*是在相同放大倍数下，藻段10个视视野中白色藻细胞数量占整个藻细胞的百分比的平均数。

**取出烧杯中的盖玻片，在相同显微镜放大倍数下，随机观察10个视野中附着的浒苔小苗数量并计数，最后取平均数。

2.3、附着物的附着孢子情况

从试验结果来看，浒苔孢子/配子能在玻璃(玻片、烧杯壁)、人造大理石、红色、蓝色、蓝绿色与白色网片上大量附着、萌发与生长；从实际应用出发，着重观察4^#与5^#人工半咸水培养液中缠绕在载玻片上蓝色、蓝绿色渔网网片(渔业生产材料--易得，廉价)与白色(窗纱)尼龙丝上浒苔孢子/配子的附着情况，其结果如表3。蓝色尼龙丝附着情况见附图5。

表3大口瓶中浒苔孢子/配子在蓝色、蓝绿色渔网与白色单股尼龙丝上附着情况*

	1^#	2^#
			蓝色尼龙丝(渔网)	147(个)	301(个)
蓝绿色尼龙丝(渔网)	123(个)	179(个)
			白色尼龙丝(窗纱)	82(个)	123(个)

*1、以2.57cm单股尼龙丝上附着孢子/配子个数来计(每色尼龙丝取样3根计数，取平均数)。

Claims

1.一种浒苔人工半咸水生态育苗法，其按如下步骤进行：

(1)配制人工半咸水培养液，备用；

(2)黄绿色浒苔清洗数次，吸干表面水份，将样品放置于干燥箱中阴至半干；

(3)将阴至半干的浒苔样品在含有碘液人工咸水中消毒数分钟；剪切藻段处理后，放入盛有人工半咸水培养液与附着基质的培养容器中并用保鲜膜封口；

(4)置于光照培养箱中培养；

(5)待发散的浒苔孢子或配子充分附着在附着基质后，引入浮游动物、并投加食用酵母，使培养容器中形成一个生态育苗系统；

所述的培养液选用如下四种之一的配方：

一、1000ml自来水混配14.0g NaCl、5.0g MgSO₄、0.5g CaCl₂、0.2g KCl、0.2g NaHCO₃、0.2g NaNO₃、25.0g Na₂HPO₄.12H₂O、2.0g FeCl₃、0.1g NaBr、30.0g H₃BO₃、25.0gSrC_l2.2H₂O；

二、1000ml自来水混配14.5g NaCl、5.0g MgSO₄、0.5g CaCl₂、0.2g KCl、0.2g NaHCO₃、0.2g NaNO₃、25.0g Na₂HPO₄.12H₂O、2.0g FeCl₃、0.1g NaBr、30.0g H₃BO₃、25.0gSrC_l2.2H₂O；

三、1000ml自来水混配14.0g NaCl、1.5g MgSO₄、3.5g MgCl₂、0.5g CaCl₂、0.2g KCl、0.2g NaHCO₃、0.2g NaNO₃、25.0g Na₂HPO₄.12H₂O、2.0g FeCl₃、0.1g NaBr、30.0g H₃BO₃、25.0g SrC_l2.2H₂O；

四、1000ml自来水混配14.5g NaCl、1.5g MgSO₄、3.5g MgCl₂、0.5g CaCl₂、0.2g KCl、0.2g NaHCO₃、0.2g NaNO₃、25.0g Na₂HPO₄.12H₂O、2.0g FeCl₃、0.1g NaBr、30.0g H₃BO₃、25.0g SrC_l2.2H₂O。

2.如权利要求1所述的浒苔人工半咸水生态育苗法，其特征在于：步骤(1)，所述的培养液包括：阴阳离子Na⁺、Cl^-、Mg²⁺、SO₄ ^2-、K⁺、HCO₃ ^-；微量元素Fe、Br、B、Sr；及营养元素N、P。

3.如权利要求1所述的浒苔人工半咸水生态育苗法，其特征在于：所述的配方，除NaHCO₃采用水溶液进微孔滤膜过滤除菌，微孔滤膜的孔径为0.22μm，最后加入到冷却至30℃以下的培养基外，其它配方组分均逐一溶解，配成培养液进行高温灭菌。

4.如权利要求1所述的浒苔人工半咸水生态育苗法，其特征在于：所述的附着基质选自：大理石、玻璃、卵石、蓝色或蓝绿色渔网网片、窗纱、塑料片。

5.如权利要求1所述的浒苔人工半咸水生态育苗法，其特征在于：步骤(3)，所述含有碘液人工咸水选自含有0.7％碘液的人工半咸水。

6.如权利要求1或5所述的浒苔人工半咸水生态育苗法，其特征在于：步骤(3)，剪切浒苔成0.1-1mm藻段。

7.如权利要求1所述的浒苔人工半咸水生态育苗法，其特征在于：步骤(4)，温度22±1℃，前48h全黑暗培养；48h后开始增加光照，光照强度3000～3500Lx，光照周期L：D＝12h：12h，全部用日光灯照明，培养方式为液体静置培养，每天早、晚晃动培养液1次。

8.如权利要求1所述的浒苔人工半咸水生态育苗法，其特征在于：步骤(5)，引入浮游动物选自蒙古祼腹溞或褶皱臂尾轮虫。

9.如权利要求1或8所述的浒苔人工半咸水生态育苗法，其特征在于：步骤(5)，投加食用酵母选自海洋酵母或安琪酶母。