CN103609425A - 一种浒苔的无菌化培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种藻类的无菌化培养方法，特别涉及一种浒苔的无菌化培养方法，首先将浒苔幼苗清洗2-3次，吸干表面水分；然后将青霉素G，新霉素及多粘菌素B三种抗生素加入到VSE培养液中，配成抗生素培养液；取上述浒苔幼苗放于抗生素培养液中，培养温度为18-25℃，光照强度为130-150μmol/m²·s，光照周期为12L:12D，充气培养，每隔3-6天更换抗生素培养液,直到发育至成熟藻体为止。本方法是将野外采集的浒苔，在实验室中进行无菌化培养，经过测试，未有杂菌生长，从而大大提高了浒苔后期的实验结果的准确性。本发明方法操作简单，无需改换浒苔培养体系，而且原料易得、价格便宜，成本低。

Description

一种浒苔的无菌化培养方法

技术领域

本发明涉及一种藻类的无菌化培养方法，特别涉及一种浒苔的无菌化培养方法。

背景技术

自2008年以来，绿潮已成为我国近海的最主要有害生态现象之一，对沿海经济发展和生态环境造成了严重破坏。绿潮的发生是由于绿潮藻的爆发性增长所导致，其中最主要的绿潮藻种为浒苔。在植物分类学上，浒苔属于绿藻类。虽然它的植物体非常纤细，肉眼看去呈绿色细丝状，但这样的大小已经足以让人们称之为“大型藻类”。近年来，针对浒苔的研究已经成为绿潮研究领域的一个重要方向。浒苔常生长在潮间带岩石上或石沼中，或泥沙滩的石砾上，有时也可附生在大型海藻的藻体上。这样的生长环境下，浒苔不可避免地与很多杂藻及杂菌存在着共生关系，因此，从野外采回的浒苔藻样，即使在实验室中培养很长一段时间，也无法达到无菌效果。但是在针对浒苔的研究中，对于藻间相互作用和针对藻体的微观研究，都需要以无菌藻为实验材料，才能确保浒苔研究的可靠性。所以获得无菌藻种对于实验室中浒苔研究至关重要。

目前，浒苔的无菌化培养主要采用消毒法、物理法等，但是，消毒法和物理法都需对现有的浒苔培养系统进行多处改换，且存在一定的操作难度，而且也无法达到无菌化。

抗生素法，以其除菌的快速有效性和彻底性受到普遍认可，微藻的除菌方法通常会采用抗生素法，但是抗生素法用在浒苔的无菌化培养中，还没有相关文献进行报道过。

发明内容

本发明的目的是提供一种浒苔的无菌化培养方法，该方法针对浒苔自身的生长特点，达到无菌化培养效果，为提高浒苔后期的实验结果的准确性奠定了基础。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种浒苔的无菌化培养方法，其步骤包括：

（1）将浒苔幼苗清洗2-3次，吸干表面水分；

（2）将青霉素G，新霉素及多粘菌素B三种抗生素加入到VSE培养液中，配成抗生素培养液；然后取步骤（1）中的浒苔幼苗放于抗生素培养液中，培养温度为20℃，光照强度为130-150μmol/m²·s，光照周期为12L:12D，充气培养，每隔3-6天更换抗生素培养液,直到发育至成熟藻体为止。

所述步骤（1）中，用无菌滤纸片吸干浒苔幼苗表面的多余水分。

所述步骤（2）中，青霉素G，新霉素及多粘菌素B的重量加入比为1-2:1-2:1。

所述步骤（2）中，青霉素G与VSE培养液的加入量配比为80-130μg/mL，新霉素与VSE培养液的加入量配比为80-130μg/mL，多粘菌素B与VSE培养液的加入量配比为50-100μg/mL。

所述步骤（2）中，浒苔幼苗与抗生素培养液的放置比例为1株：40-60mL。

所述步骤（2）中，青霉素G，新霉素及多粘菌素B在使用前，采用微孔滤膜过滤除菌，微孔滤膜的孔径为0.22μm。

本发明是针对大型藻浒苔的生长机制，即在自然环境中，浒苔自身不可避免地与多种微生物共生，而将野外采回的浒苔，即使通过多道除菌过程，依然无法达到无菌效果，本发明是采用抗生素法，将野外采集的浒苔进行无菌化培养，成功得到无菌藻种，有利于浒苔后续的实验室研究。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1、本发明方法是将野外采集的浒苔，在实验室中进行无菌化培养。将无菌化培养的成熟藻体平铺于LB固体培养基表面，培养10天，未有杂菌生长，从而大大提高了浒苔后期的实验结果的准确性。

2、本发明方法操作简单，无需改换浒苔培养体系，而且原料易得、价格便宜，成本低。

3、本发明是采用抗生素法进行除菌，加入的抗生素在除菌的同时也促进了浒苔的生长，比普通培养的浒苔生长状态更良好，色泽更鲜绿。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明作进一步说明：

VSE培养液的配制：

Na₂EDTA             3.72g/L

VB₁                 0.2g/L

VB₁₂                0.001g/L

生物素              0.001g/L

NaNO₃               42.5g/L

MgCl₂·4H₂O         0.0198g/L

FeSO₄·7H₂O         0.278g/L

Na₂HPO₄·12H₂O      10.75g/L。

实施例1

（1）浒苔幼苗的预处理

将前期放散培养的浒苔幼苗用无菌海水对表面刷洗3次，然后用无菌滤纸片吸干藻体表面的多余水分。

（2）无菌化培养过程

将青霉素G，新霉素及多粘菌素B三种抗生素溶解后，分别用微孔滤膜过滤除菌法进行除菌处理、备用，其中微孔滤膜的孔径为0.22μm。

将25mg青霉素G，25mg新霉素及12.5mg多粘菌素B加入至250mL的VSE培养液中，配制出抗生素培养液。

将预处理好的浒苔幼苗放于抗生素培养液中，按照每株浒苔幼苗加入50mL抗生素培养液的比例进行放置；然后在温度为20℃，光照强度为140μmol/m²·s、光照周期为12L:12D的条件下充气培养，期间每5天换一次抗生素培养液，直至培养成成熟藻体为止。

（3）检测结果

随机挑取部分步骤（2）中培养的藻样，平铺于LB固体培养基表面，培养10天，观察是否有杂菌生长，未有杂菌生长的藻体为合格藻体。使用本发明无菌化培养方法培养出的浒苔，获得生长状况良好的浒苔无菌藻种，为提高后续浒苔的研究结果奠定了基础；将没有经过无菌化培养，只是通过物理法除菌的藻样也在同样的条件下平铺于LB固体培养基表面培养10天，进行对比实验，结果有杂菌伴着藻体共同生长。

实施例2

（1）浒苔幼苗的预处理

将前期放散培养的浒苔幼苗用无菌海水对表面刷洗3次，然后用无菌滤纸片吸干藻体表面的多余水分。

（2）无菌化培养过程

将青霉素G，新霉素及多粘菌素B三种抗生素溶解后，分别用微孔滤膜过滤除菌法进行除菌处理、备用，其中微孔滤膜的孔径为0.22μm。

将25mg青霉素G，25mg新霉素及25mg多粘菌素B加入至250mL的VSE培养液中，配成抗生素培养液。将预处理好的浒苔幼苗放于抗生素培养液中，按照每株浒苔幼苗加入45mL抗生素培养液的比例进行放置；然后在温度为20℃，光照强度为140μmol/m²·s、光照周期为12L:12D的条件下充气培养，期间每4天换一次抗生素培养液，直至培养成成熟藻体为止。

（3）检测结果

随机挑取部分步骤（2）中培养的藻样，平铺于LB固体培养基表面培养10天，结果可获得生长状况良好的浒苔无菌藻种，而且比普通培养的浒苔生长状态更良好，色泽更鲜绿；将没有经过无菌化培养，只是通过物理法除菌的藻样也在同样的条件下平铺于LB固体培养基表面培养10天，进行对比实验，结果有杂菌伴着藻体共同生长。

以上所述为本发明的较佳实施例而已，但本发明不应该局限于该实施例所公开的内容。所以凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。

Claims (6)

1.一种浒苔的无菌化培养方法，其步骤包括：

（1）将浒苔幼苗清洗2-3次，吸干表面水分；

（2）将青霉素G，新霉素及多粘菌素B三种抗生素加入到VSE培养液中，配成抗生素培养液；然后取步骤（1）中的浒苔幼苗放于抗生素培养液中，培养温度为18-25℃，光照强度为130-150μmol/m²·s，光照周期为12L:12D，充气培养，每隔3-6天更换抗生素培养液,直到发育至成熟藻体为止。

2.根据权利要求1所述的浒苔的无菌化培养方法，其特征在于：所述步骤（1）中，用无菌滤纸片吸干浒苔幼苗表面的多余水分。

3.根据权利要求1所述的浒苔的无菌化培养方法，其特征在于：所述步骤（2）中，青霉素G，新霉素及多粘菌素B的重量加入比为1-2:1-2:1。

4.根据权利要求1所述的浒苔的无菌化培养方法，其特征在于：所述步骤（2）中，青霉素G与VSE培养液的加入量配比为80-130μg/mL，新霉素与VSE培养液的加入量配比为80-130μg/mL，多粘菌素B与VSE培养液的加入量配比为50-100μg/mL。

5.根据权利要求1所述的浒苔的无菌化培养方法，其特征在于：所述步骤（2）中，浒苔幼苗与抗生素培养液的放置比例为1株：40-60mL。

6.根据权利要求1或3中所述的浒苔的无菌化培养方法，其特征在于：所述步骤（2）中，青霉素G，新霉素及多粘菌素B在使用前，采用微孔滤膜过滤除菌，微孔滤膜的孔径为0.22μm。