CN103013888A - 一种活性发酵液及其应用 - Google Patents

Abstract

一种发酵液及其应用，属生物农药技术领域。该活性发酵液经如下步骤得到：a. 将保藏号：CGMCC No. 6358的无色杆菌（Achromobacter sp.）CD-253保存在酵母提取物胰蛋白胨（LB）培养基（酵母提取物：5.0g，胰蛋白胨：10.0g，氯化钠：10.0g，水1000ml，pH：7.0）中，使用时在同样的液体培养基中活化24小时；b.将活化后菌种100μl接种于装有50ml-250ml液体LB培养基三角瓶中，在温度为28℃-37℃，转速为120-180rpm的条件下培养96小时，得培养液。将培养液8000rpm离心10分钟后，取上清放入4℃的冰箱中备用，得到活性发酵液。该活性发酵液在制备毒杀南方根结线虫（M. incognita）、秀丽隐杆线虫（C. elegans）、及全齿复合线虫（P. redivivus）生物制剂中的应用。本发明的活性物，具有成本低，制备方法简便，高效低毒的优点。

Description

一种活性发酵液及其应用

技术领域：

本发明涉及一种活性发酵液及其应用，属生物农药技术领域。

背景技术:

线虫是农业生产中重要的传染性病原之一，使作物减产从而给农业生产带来重大损失。目前对线虫的防治有多种方法，但主要以化学杀线剂为主。由于化学杀线剂的高毒、高残留对人类健康及环境造成潜在威胁，因此生物杀线剂成为线虫防治的一个研究方向。微生物由于易培养，生长周期短，因此利用微生物及其代谢产物防治线虫受到人们的关注。

秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）和全齿复合线虫（Panagrellus redivivus）易培养和观察，体形大，对环境条件敏感，在室内研究中常用其作为指示线虫。南方根结线虫（Meloidogyne incognita）是危害最为严重的植物病原线虫之一，所引起的病害是一种极难防治的土传性病害。

发明内容:

本发明的目的在于提供一种活性发酵液及其应用。

本发明是这样实现的：

1、活性发酵液的制备：

本发明使用的细菌菌株为无色杆菌（Achromobacter sp.）CD-253，该菌株已于2012年7月12日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所；保藏号：CGMCC No. 6358。

无色杆菌（Achromobacter sp.）CD-253保存在酵母提取物胰蛋白胨(LB)培养基（酵母提取物：5.0 g, 胰蛋白胨：10.0 g, 氯化钠：10.0 g, 水1000 ml, pH：7.0）中，使用时在LB液体培养基中活化24小时。将活化后菌种100 μl接种于装有50 ml-250 ml液体LB培养基三角瓶中，在温度为28℃-37℃，转速为120-180 rpm的条件下培养96小时，即可得到培养液。将培养液8000 rpm离心10分钟后，取上清放入4℃的冰箱中备用。这样就得到本发明的活性发酵液。

2、制备试验用的秀丽隐杆线虫（C. elegans）、全齿复合线虫（P.redivivus）和南方根结线虫（M. incognita）：

燕麦培养基用于秀丽隐杆线虫（C. elegans）和全齿复合线虫（P.redivivus）培养；燕麦片10 g，水10 ml 浸润燕麦片，混匀后加入到50 ml 三角瓶中，120℃高温灭菌20 min。在超菌工作台中按无菌操作在燕麦片培养基中接入线虫，接种后的三角瓶放置于28℃的培养箱中培养7-10天后，置于4℃冰箱中保存备用。使用时将载有线虫的培养基在无菌条件下，挑取适量已培养好的含线虫的燕麦于擦镜纸上，用简易贝曼漏斗法洗出线虫，用无菌水制成线虫悬液备用（每毫升1000条左右）。

番茄根系用于南方根结线虫（M. incognita）的制备。取发病严重的番茄根系，洗净后统计根结数量，放入水中浸泡过夜，收集浸泡液；同法再泡洗3次，弃去根系。残液和泥土经2000 rpm离心2 min，弃去上清液，加入494 g/L蔗糖，混匀后2000 rpm离心2 min，将上清液用800目的分离筛清洗，收集分离筛上的幼虫和虫卵。洗液再用100、200和500目的分离筛反复漂洗，收集500目分离筛上的收集物-大部分为虫卵；500目分离筛上的滤过液再经800目的分离筛清洗，收集分离筛上的虫体-2龄幼虫。所分离的虫和虫卵储于4℃的冰箱中备。

3 实验方法

液体浸泡法：取5 ml测试样品溶液、200 μl约含有200条线虫的悬液于直径为6 cm的培养皿中，轻轻混匀后将培养皿室温放置。在解剖镜下随机选择10个视野定时（1小时、3小时、6小时、24小时）进行观察，计数病虫数（以线虫不动作为标准）和总线虫数。每个测试样品设三个重复，并以未接种菌株的培养基为对照，得到测试样品对线虫的致死率，以致死率高低评定样品对线虫的毒力。

本发明的活性发酵液在制备毒杀南方根结线虫（M. incognita）、秀丽隐杆线虫（C. elegans）、及全齿复合线虫（P. redivivus）生物制剂中的应用。

本发明具有制备方法简单，高效低毒的优点，能够作为制备生物农药杀线剂的应用。

具体实施方式：

下面用实施例来进一步详述本发明，但本发明的内容并不局限于此。

实施例一 ：

将活化后的无色杆菌（Achromobacter sp.）CD-253 100 μl接种于液体LB培养基中（250 ml三角瓶装50 ml培养基），于30℃，180rpm条件下培养96小时。将培养液8000 rpm离心10分钟后，取上清作为测试样品，稀释十倍后用液体浸泡法测试活性。结果见表1。

表 1无色杆菌（Achromobacter sp.）CD-253发酵液对南方根结线虫（M. incognita）液体浸泡法测定的活性

-没有明显活性

结果表明：本发明的发酵液对南方根结线虫（M. incognita）有强的毒杀作用，其稀释10倍后的发酵液24小时时对南方根结线虫（M. incognita）的致死率达到98.42%。南方根结线虫（M. incognita）24小时在培养基对照中的死亡率是3.37%。

实施例二：

基本同实施例一，不同之处是发酵时为250 ml三角瓶装100ml培养基，37℃、120 rpm培养96小时。测试活性时不进行稀释，使用发酵原液进行液体浸泡法测试，测试的线虫为秀丽隐杆线虫（C. elegans）。活性结果见表2。

表 2无色杆菌（Achromobacter sp.）CD-253发酵液对秀丽隐杆线虫（C. elegans）液体浸泡法测定的活性

结果表明：本发明的发酵液对秀丽隐杆线虫（C. elegans）有极强的毒杀作用，其发酵原液在1小时对秀丽隐杆线虫（C. elegans）的致死率达到90％以上。秀丽隐杆线虫（C. elegans）24小时在培养基对照中的死亡率是0.82%

实施例三：

基本同实施例二，不同之处是发酵时为500 ml三角瓶装250 ml培养基，28℃、120 rpm培养7天的发酵上清液作为测试样品，测试线虫为全齿复合线虫（P. redivivus）。活性结果见表3。

表 3无色杆菌（Achromobacter sp.）CD-253发酵液对全齿复合线虫（P. redivivus）液体浸泡法测定的活性（%）

结果表明：本发明的发酵液对全齿复合线虫（P. redivivus）有很好的毒杀作用, 其发酵原液1小时对全齿复合线虫（P. redivivus）的致死率达90%以上。全齿复合线虫（P. redivivus）24小时时在培养基对照中的死亡率是1.78%。

本例试验与前例采用的菌株和培养基完全相同，仅仅是培养体积、温度和时间以及测试线虫不同。前例是250 ml三角瓶装100 ml培养基37℃培养96小时，本例则是500 ml三角瓶装250 ml培养基28℃培养7天。本例试验获得的发酵液对全齿复合线虫（P. redivivus）活性基本与前例对秀丽隐杆线虫（C. elegans）的活性一致。

Claims (2)

1.一种活性发酵液，其特征在于该活性发酵液经如下步骤得到：

a. 将保藏号为CGMCC No. 6358的无色杆菌（Achromobacter sp.）CD-253保存在酵母提取物胰蛋白胨（LB）培养基（酵母提取物：5.0 g, 胰蛋白胨：10.0 g, 氯化钠：10.0 g, 水1000 ml, pH：7.0）中，使用时在同样的液体培养基中活化24小时；

b.将活化后菌种100 μl接种于装有50 ml-250 ml液体LB培养基三角瓶中，在温度为28℃-37℃，转速为120-180 rpm的条件下培养96小时，即可得到培养液。将培养液8000 rpm离心10分钟后，取上清放入4℃的冰箱中备用，得到活性发酵液。

2.权利书1所述的活性发酵液在制备毒杀南方根结线虫（M. incognita）、秀丽隐杆线虫（C. elegans）、及全齿复合线虫（P. redivivus）生物制剂中的应用。