CN103439426B - 挥发性化合物硫代丁酸甲酯及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及挥发性化合物硫代丁酸甲酯及其应用，属微生物生物农药技术领域。该挥发性化合物硫代丁酸甲酯经如下步骤检测到：a.使用的细菌菌株为无色杆菌（Achromobacter sp.）CD-253，保藏号：CGMCC No.6358；b.将CD-253菌株采用LB培养基，用常规发酵方法培养，将发酵液用固相微萃取技术进行顶空萃取；c.将萃取物质经GC-MS分析；d.经NIST数据库比对得到挥发性代谢产物硫代丁酸甲酯。该挥发性化合物硫代丁酸甲酯对秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）和南方根结线虫（Meloidogyne incognita）有抑制作用，能作为制备杀虫药制剂和前体物质的应用。本发明与现有的杀线虫农药相比，具有对环境无污染、成本低、毒杀线虫效果极佳的优点。

Description

挥发性化合物硫代丁酸甲酯及其应用

技术领域：

本发明涉及挥发性化合物硫代丁酸甲酯及其应用，属微生物生物农药技术领域。

背景技术：

植物线虫病害是一种危害严重的植物病害，据估计全球每年由植物寄生线虫所造成的作物损失达1570亿美元(Abad et al.2008)。目前，化学防治仍然是控制植物线虫的重要措施之一，但长期使用巨毒化学杀虫剂给环境和人类的健康带来的危害日渐显露。因此生物杀线剂成为线虫防治的一个研究方向。微生物由于易培养，生长周期短，因此利用微生物及其代谢产物防治线虫受到人们的关注。

本发明使用的细菌菌株为无色杆菌（Achromobacter sp.）CD-253，该菌产生的挥发性物质具有杀线虫活性。对该菌产生的挥发性物质用GC-MS进行检测，该菌产生的挥发性化合物硫代丁酸甲酯的MS数据与NIST数据库标准品的MS数据比对结果相同；用购买自Sigma的化合物硫代丁酸甲酯，进行毒杀线虫活性测试，证明化合物硫代丁酸甲酯具有杀线虫活性。经国内外文献检索，未见与本发明相同的公开报道。

发明内容：

本发明的目的在于提供挥发性化合物硫代丁酸甲酯及其应用。

本发明使用的细菌菌株无色杆菌（Achromobacter sp.）CD-253已于2012年7月12日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏号：CGMCC No.6358。

CD-253菌株主要形态特征和生理生化性质为：在LB培养基上28℃下培养，菌落圆形，轻微隆起，淡黄色，湿润，半透明，边缘整齐，光滑。该菌革兰氏染色阴性、杆状、无芽孢。该菌种的培养常规条件是好氧培养。用于培养菌种的糖质原料碳源是无机碳源。氮源是有机氮源，即为无机铵盐、无机硝酸盐或蛋白胨、

酵母膏。该菌种的生长温度范围25℃～37℃。pH范围为6.0～8.0。

本发明的挥发性化合物硫代丁酸甲酯经如下步骤检测到：

a.将CD-253菌株采用LB培养基，用常规发酵方法培养，将发酵液用固相微萃取技术进行顶空萃取；

b.将萃取物质经GC-MS分析，GC-MS参数：气质联用仪为Agilent7890GC/5975MSD，色谱柱型号HP-5MS0.25mm，填料为5%-苯基-甲基聚硅氧烷；GC-MS条件：载气为氦气(He)，流速1.0mL/min；进样口温度250℃；炉温：起始温度50℃，保持2min，以6℃/min升温至180℃，再以8℃/min升温至280℃，保持10min；分流进样，分流比10:1；质谱扫描范围35-550u；离子源：EI源；电子能量：70EV；

c.经NIST数据库比对得到挥发性代谢产物硫代丁酸甲酯，该化合物的结构如下：

菌株CD-253的总离子色谱图如附图1所示。本发明的挥发性代谢产物硫代丁酸甲酯的保留时间为4.558min。该化合物的MS数据与NIST数据库标准品的MS数据比对结果如附图2所示。由附图知：该菌产生的挥发性化合物硫代丁酸甲酯的MS数据与NIST数据库标准品的MS数据比对结果相同。

购买自Sigma的化合物硫代丁酸甲酯，在两格板法的抗线虫活性测试中，对秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）和南方根结线虫（Meloidogyne incognita）有抑制作用，能作为制备杀虫药制剂和前体物质的应用。

本发明与现有的杀线虫农药相比，具有对环境无污染、成本低、毒杀线虫效果极佳的优点。

附图说明：

图1：菌株CD-253的总离子色谱图。

图2：硫代丁酸甲酯的MS数据与NIST数据库标准品的MS数据比对结果。

具体实施方式：

本发明的挥发性化合物硫代丁酸甲酯经与发明内容描述相同的步骤检测到。实施例所用的挥发性化合物硫代丁酸甲酯购买自Sigma。

实施例1：

用两格法检测化合物硫代丁酸甲酯对秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）活性的实验：

1.线虫的培养与制备

将秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）接种于燕麦培养基上（燕麦20g，水80mL），于28℃培养5～7天。用贝尔曼漏斗法洗出所需线虫，用无菌蒸馏水将线虫稀释为1000条/mL作为线虫悬液。

2.试验方法

在两格板中各加入水琼脂，一格在水琼脂表面分别加入1mL线虫（约1000条），另一格中加入化合物纯品10μL、40μL，用Parafilm封口膜封口。置于室温中，分别于6，12，24小时在光学显微镜下检查计算线虫死亡率。

鉴定死亡的方法：死亡线虫僵直或呈“J”型，活线虫则卷曲扭动。将僵直的线虫转移到无菌水中，线虫仍未做出任何反应则鉴定为死亡。

死亡率=(死亡线虫数/(死亡线虫数+活线虫数))×100%

以未加样品的测试溶液为对照，整个实验重复三次，取三次平均值，计算出平均死亡率和校正死亡率。

3.实验结果

表1供试化合物对秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的毒杀结果（%）

结果表明：化合物硫代丁酸甲酯对秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）有强的毒杀作用，40μL时在12小时对秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的致死率达到100％。

实施例2：

本实施例与实施例1使用相同的试验用药剂、实验方法一致，只是将供试线虫替换为南方根结线虫（Meloidogyne incognita）。用两格法检测挥发性化合物硫代丁酸甲酯的单体抗南方根结线虫（Meloidogyne incognita）的实验方法如下：

1.线虫的培养与制备

番茄根系用于南方根结线虫（Meloidogyne incognita）的制备。取发病严重的番茄株根系，洗净根系，统计根结数量，继续泡入水中浸泡过夜，收集浸泡液；同法再泡洗3次，弃去根系。残液和泥土经2000r/min离心2min，弃去上清液，加入494g/L蔗糖，混匀后2000r/min离心2min，将上清液用800目的分离筛清洗，收集分离筛上的幼虫和虫卵。洗液再用100、200和500目的分离筛反复漂洗，收集500目分离筛上的收集物，即大部分为虫卵；500目分离筛上的滤过液再经800目的分离筛清洗，收集分离筛上的虫体，即2龄幼虫（J2）。所分离的虫和虫卵储于4℃的冰箱中备。

2.试验方法

在两格板中各加入水琼脂，一格在水琼脂表面分别加入1mL线虫（±1000条），另一格中加入化合物纯品20μL，用Parafilm封口膜封口。置于室温中，分别于6，12，24小时在光学显微镜下检查计算线虫死亡率。

鉴定死亡的方法：死亡线虫僵直或呈“J”型，活线虫则卷曲扭动。将僵直的线虫转移到无菌水中，线虫仍未做出任何反应则鉴定为死亡。

死亡率=(死亡线虫数/(死亡线虫数+活线虫数))×100%

以未加样品的测试溶液为对照，整个实验重复三次，取三次平均值，计算出平均死亡率和校正死亡率。

4.实验结果

表2供试化合物对南方根结线虫（Meloidogyne incognita）的毒杀结果（%）

结果表明：化合物硫代丁酸甲酯对南方根结线虫（Meloidogyne incognita）有强的毒杀作用，40μL时在24小时对南方根结线虫（Meloidogyne incognita）的致死率达到90％以上。

实际应用表明：本发明的化合物硫代丁酸甲酯对秀丽隐杆线虫（Caenorhabditiselegans）和南方根结线虫（Meloidogyne incognita）有抑制作用，能作为制备杀虫药制剂和前体物质的应用。

Claims (1)

1.一种挥发性化合物硫代丁酸甲酯的应用，其特征在于该挥发性化合物硫代丁酸甲酯在制备杀植物线虫秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)和南方根结线虫(Meloidogyne incognita)药制剂和前体物质中的应用。