CN103695331B - 凝结芽孢杆菌及其制备方法与在生物除臭剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于环保领域，公开了凝结芽孢杆菌及其制备方法与在生物除臭剂中的应用。本发明所涉及的凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans），于2013年05月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC 7646。本发明菌株是从畜禽粪便的样品中筛选得到，该菌对多种恶臭具有明显去除效果，其中NH₃的平均去除率为97.75%，H₂S平均去除率为97.40%，总烃平均去除率为99.85%，臭气浓度平均去除率为90.46%，细菌总数平均去除率为71.23%。本发明生物除臭剂可用于垃圾、污水、畜禽动物舍空气等的除臭和进化。

Description

凝结芽孢杆菌及其制备方法与在生物除臭剂中的应用

技术领域

本发明属于环保领域，涉及一株凝结芽孢杆菌及其制备方法与在生物除臭剂中的应用。

背景技术

随着我国城市化进程的加快，城市人口日益增多，随之而来的是城市生活垃圾量的高速增加。据不完全统计，近年来我国垃圾增长率达到10％以上，每年产生近1.5亿吨。目前，国内城市生活垃圾积存量已高达70亿吨，占地约80多万亩，其中80％～90％来自大中城市，平均每人每天产生的垃圾量约为1.2公斤，但其处理率仅为50％左右。全国600多座城市，已有三分之二的大中城市陷入“垃圾围城”的困境。面对“垃圾围城”的窘境，随之而来的是日趋严重的“臭气扰民”和“蚊蝇扰民”问题。

针对上述问题，目前市场已有的垃圾除臭剂主要有化学除臭剂、植物除臭剂和微生物除臭剂。化学除臭剂成本较高，易造成二次污染；植物除臭剂提取工艺复杂，生产成本更高。因此两者在规模化除臭使用过程中受到了极大的成本限制、推广限制，多用于小场地和小空间的应用或应急应用。因而微生物除臭剂因为“价廉物美”受到热捧。

但现有微生物除臭剂产品或技术中多为酵母菌、乳酸菌等非芽孢杆菌为有效菌，或以酵母菌和乳酸菌为主复配部分芽孢杆菌等为有效菌株，如广东省微生物研究所申请的酵母菌为主的除臭技术（专利号02152024.0和专利号01129774.3），以及中国农业大学申请的以酵母菌、乳酸菌、固氮菌和光合细菌等非芽孢杆复配功能芽孢杆菌除臭技术（专利号200510069515.8）。该类技术采用非芽孢杆菌为除臭有效菌，忽略了非芽孢杆菌在液体环境中不存在抗逆性强的休眠体--芽孢，故在保藏和使用过程中无法保障其在液体制剂中的有效浓度和菌群比例，也必将导致在应用中使用效果的不确定性。因此，芽孢杆菌类除臭技术的开发显得尤为必要，惠飞开发的枯草芽孢杆菌除臭技术（专利号200910034842.8）和戴承镛开发的巨大芽孢杆菌除臭技术（专利号200510091277.0）都说明芽孢杆菌类除臭技术的有效性。但迄今为止尚未见到凝结芽孢杆菌在生物除臭方面的报道。

发明内容

本发明的目的是提供凝结芽孢杆菌及其制备方法，本发明还提供所述凝结芽孢杆菌在生物除臭剂中的应用，具有生产方便、成本低廉、质量可靠、除臭效果稳定显著，且不造成二次环境污染的优点。

本发明通过如下技术方案实现：

凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans），该菌于2013年05月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC7646，其16S rDNA保守序列如序列表1所示。凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC7646，保藏日期为2013年05月27日。

上述凝结芽孢杆菌的制备方法，包括以下步骤：

（1）取畜禽粪便，采用营养琼脂进行平板稀释涂布分离；

（2）挑取80℃水浴25分钟后的单菌落；

（3）采用肉汤营养琼脂斜面保藏单菌落；

（4）采用针对氨气和硫化氢的复筛方法，挑选去除率最高的单菌落，即为凝结芽孢杆菌。

上述的制备方法具体是：将畜禽粪便稀释100-1000倍的无菌水中，经80℃水浴20分钟，再将稀释液取0.1mL涂布于营养琼脂上，置于37℃中培养2-3天，最后挑选单一菌落于营养肉汤琼脂斜面培养基中，于37℃培养箱中培养2-4天后冰箱保藏。其中，营养肉汤琼脂培养基和营养肉汤液体培养基等均为微生物常用培养基。

筛选时，将冰箱中保藏的凝结芽孢杆菌的斜面接种一环至营养肉汤液体培养基中，37℃培养2天制成菌液。

所述复筛主要针对臭气的主要成分--氨气和硫化氢的去除率进行。具体方法如下：

（1）降氨试验：取18mL菌液于2L大烧杯中，并加入500mg/L的氨水2mL；再往大烧杯中放入装有20mL0.005N硫酸吸收液的50mL小烧杯，盖上双层塑料薄膜密封。

（2）降硫化氢试验：取10mL菌液于2L大烧杯中，并加入10mg/L的硫化氢溶液10mL，再往大烧杯中放入装有20mL氢氧化镉吸收液的50mL小烧杯，盖上双层塑料薄膜密封。

以上处理均以等量的无菌水作为对照，每个处理重复3次，置于30℃的培养箱中培养。24小时后，取出小烧杯检测氨或硫化氢的浓度。氨的测定采用纳氏试剂比色法，硫化氢的测定采用亚甲基蓝比色法。

在复筛中挑取氨气和硫化氢去除率最高的一株，经分子测序，其16S rDNA保守序列如序列表1所示。结合《伯杰氏细菌鉴定手册》第八版和《常见细菌鉴定手册》鉴定为凝结芽孢杆菌。挑取第一代凝结芽孢杆菌培养后制成斜面送交中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）保藏，保藏号为CGMCC7646，保藏日期为2013年05月27日。

本发明中的凝结芽孢杆菌（CGMCC7646）具有以下微生物学特征：

1.形态学特征

细胞呈杆状，0.6～1×2.5～5微米，作色均匀，无荚膜，运动，革兰氏阳性。芽孢椭圆，无伴孢晶体。油镜观察，担搁、成对或链状排列，芽孢端生。

2.培养学特征

凝结芽孢杆菌在营养琼脂培养基中37℃培养48小时后菌落凸起，表面湿润，边缘光滑，白色而有光泽，无可溶性色素。

3.常见生理生化性质如表1：

表1

上述凝结芽孢杆菌在生物除臭剂中的应用，将凝结芽孢杆菌接种至肉汤营养液体培养基，制成第一代种，再移至发酵罐，经扩大培养形成芽孢后，即得液体凝结芽孢杆菌除臭菌剂。

发酵罐中液体配方是：每1000mL水中，糖类10-25g、酵母膏1-3g、麸皮过滤水1wt%、pH为5.5。

上述应用中，扩大培养是37℃的培养温度条件下扩大培养48-52小时。

上述种子液体培养基和发酵液体培养基的液体配方均为：糖类1-2.5%、酵母膏0.1-0.3%、麸皮过滤水1%、pH为5.5，且均在121℃下灭菌30min。

凝结芽孢杆菌在37℃的培养温度条件下扩大培养48-52小时。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：

本发明提供的菌株是一株新型的凝结芽孢杆菌，其对恶臭的主要成分具有良好的去除效果，如NH₃的平均去除率为97.75%，H₂S平均去除率为97.40%，总烃平均去除率为99.85%，臭气浓度平均去除率为90.46%，细菌总数平均去除率为95.05%。同时，本发明提供的菌株具有良好的抑菌效果，可通过代谢产生的抑菌物质抑制大量有害微生物的生长繁殖，从而从根本上抑制了NH₃和H₂S等臭气成分的产生。故本发明提供的菌株可广泛用于垃圾、污水、畜禽动物舍空气等的除臭和净化。

作为芽孢杆菌属的一种，凝结芽孢杆菌在保藏性上区别于其他常见的生物除臭菌剂，如乳酸菌、酵母菌和醋酸杆菌等，凝结芽孢杆菌尤其其产芽孢的特点，可长期保藏，从而保障了其产品的使用效果，而其他非芽孢菌除臭产品往往随保藏时间延长，效果逐渐消失。并且本发明的凝结芽孢杆菌液体生物除臭剂组分单一，更是便于生产控制，质量保证。

本发明所涉及的生物除臭剂中使用的凝结芽孢杆菌为安全无害微生物，将其制成除臭剂具有绿色无污染的优点，加之其为非转基因产品，消除了外来物种的入侵。

具体实施方式

以上内容已经对本发明作了充分的公开，以下再结合实例对本发明的实施作进一步说明。

实施例：

1.生物除臭剂的制备方法

在无菌操作下，于保藏斜面中挑取一环凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans），接种至种子培养基中（水100mL、糖类1.0-2.5g、酵母膏0.1-0.3g、麸皮过滤水0.1、pH为5.5），200r/min下37℃培养48小时得到种子液。

将种子液按照1%-3%的接种量接入10L灭菌液体发酵培养基中（水10mL、糖类100-250g、酵母膏10-30g、麸皮过滤水100mL、pH为5.5，121℃下灭菌30min）采用静置培养方式。发酵过程中每6小时取样，利用梯度稀释涂平皿法检测发酵液中芽孢数，当芽孢数达到1×10⁸cfu/mL时停止发酵，即得凝结芽孢杆菌液体生物除臭剂。

2.室内模拟垃圾除臭效果试验

于一密闭房间内堆放已高度腐烂并产生恶臭的生活垃圾，将该生物除臭剂（按照实施例1方法所制备的生物除臭剂）用自来水稀释10倍（体积比），用喷枪均匀喷洒100mL-200mL。20分钟后在垃圾周围不同采集地点采样，检测氨气、硫化氢气体和总烃的浓度，对比喷洒前后氨气和硫化氢的去除率。采样点设在离臭源边缘1m处，高度为1.5m，5点采样，取平均值。臭气浓度采用三点比较式臭袋法（GB/T14675),氨气采用次氯酸钠-水杨酸分光光度法（GB/T14679），硫化氢采用聚乙烯醇磷酸铵吸收-亚甲基蓝比色法（GB/T16489),细菌总数采用撞击法（GB/T17093),总烃采用气相色谱法（GB/T15263）。检测结果如表2：

表2凝结芽孢杆菌生物除臭剂室内模拟除臭效果试验

注：臭气浓度单位，无量纲；细菌总数单位，cfu/m³。

3.除臭菌剂效果对比试验

将一吨生活垃圾分为四份，分别置于面积和空间均相同的房子，各自喷洒4中生物除臭菌剂。按照实施例2的方法，对比相同体积、相同稀释度的不同品牌除臭剂的除臭效果，结果如表3所示：

表3不同生物除臭剂除臭效果对比结果

序列表

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳市新宝环保能源科技有限公司

<120> 凝结芽孢杆菌及其制备方法与在生物除臭剂中的应用

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1421

<212> DNA

<213> 凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）

<400> 1

tgcaagtcgt gcggaccttt taaagcttgc ttttaaaagg ttagcggcgg acgggtgagt 60

aacacgtggg caacctgcct gtaagatcgg gataacgccg ggaaaccggg gctaataccg 120

gatagttttt tcctccgcat ggaggaaaaa ggaaagacgg cttttgctgt cacttacaga 180

tgggcccgcg gcgcattagc tagttggtgg ggtaacggct caccaaggca acgatgcgta 240

gccgacctga gagggtgatc ggccacattg ggactgagac acggcccaaa ctcctacggg 300

aggcagcagt agggaatctt ccgcaatgga cgaaagtctg acggagcaac gccgcgtgag 360

tgaagaaggc cttcgggtcg taaaactctg ttgccgggga agaacaagtg ccgttcgaac 420

agggcggcgc cttgacggta cccggccaga aagccacggc taactacgtg ccagcagccg 480

cggtaatacg taggtggcaa gcgttgtccg gaattattgg gcgtaaagcg cgcgcaggcg 540

gcttcttaag tctgatgtga aatcttgcgg ctcaaccgca agcggtcatt ggaaactggg 600

aggcttgagt gcagaagagg agagtggaat tccacgtgta gcggtgaaat gcgtagagat 660

gtggaggaac accagtggcg aaggcggctc tctggtctgt aactgacgct gaggcgcgaa 720

agcgtgggga gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac gatgagtgct 780

aagtgttaga gggtttccgc cctttagtgc tgcagctaac gcattaagca ctccgcctgg 840

ggagtacggc cgcaaggctg aaactcaaag gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga 900

gcatgtggtt taattcgaag caacgcgaag aaccttacca ggtcttgaca tcctctgacc 960

tccctggaga cagggccttc cccttcgggg gacagagtga caggtggtgc atggttgtcg 1020

tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc ttgaccttag 1080

ttgccagcat tcagttgggc actctaaggt gactgccggt gacaaaccgg aggaaggtgg 1140

ggatgacgtc aaatcatcat gccccttatg acctgggcta cacacgtgct acaatggatg 1200

gtacaaaggg ctgcgagacc gcgaggttaa gccaatccca gaaaaccatt cccagttcgg 1260

attgcaggct gcaacccgcc tgcatgaagc cggaatcgct agtaatcgcg gatcagcatg 1320

ccgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg tcacaccacg agagtttgta 1380

acacccgaag tcggtgaggt aacctttacg gagccagccg c 1421

Claims (4)

1.凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans），其特征在于该菌于2013年05月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC 7646，其16S rDNA保守序列如序列表1所示。

2.权利要求1所述凝结芽孢杆菌在生物除臭剂中的应用，其特征在于将凝结芽孢杆菌接种至肉汤营养液体培养基，制成第一代种，再移至发酵罐，经扩大培养形成芽孢后，即得液体凝结芽孢杆菌除臭菌剂。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于发酵罐中液体配方中，每1000mL水中，糖类10-25g、酵母膏1-3g、麸皮过滤水1 wt %、pH为5.5。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于扩大培养是在37℃的培养温度条件下扩大培养48-52小时。