CN110699298B - 一种产脲酶抑制剂的凝结芽孢杆菌p1-678菌株及其应用 - Google Patents

一种产脲酶抑制剂的凝结芽孢杆菌p1-678菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种产脲酶抑制剂的凝结芽孢杆菌P1‑678菌株及其应用，该菌株已于2019年9月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其保藏编号为CGMCC NO：18601。该凝结芽孢杆菌P1‑678菌株具有产生脲酶抑制剂的高活性，能够抑制畜禽粪便中的尿素或尿酸被脲酶分解成氨。

Description

一种产脲酶抑制剂的凝结芽孢杆菌P1-678菌株及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一种产脲酶抑制剂的凝结芽孢杆菌P1-678菌株及其应用。
背景技术
近几年来，随着集约化、规模化养殖业的快速发展，畜禽排泄物氨的挥发和排放引起的环境污染越来越受到人们的关注，氨的挥发和排放不仅对地表水和土壤造成污染，而且带来严重的空气污染，对饲养动物、饲养员及饲养场周围居民的健康造成很大危害。在当前的养殖粪便处理系统中，畜禽粪便中含有的大量尿素(猪等畜类)或尿酸(鸡等禽类，经分解后可转变为尿素)很容易被微生物产生的脲酶分解成氨而挥发，使排泄物中75％的氮都因此而损失，还导致了畜禽粪便的N/P比失调，如新鲜猪粪的N/P比约为5∶1，而贮存后的猪粪N/P比却为1∶1，氮元素大量流失，降低了肥效。因此，减少畜禽粪便的氨排放对于环境保护、畜禽粪便再利用具有重要意义。
目前，在生产实践中脲酶抑制剂已被用来降低氨排放。现有的脲酶抑制剂主要有无机化合物类(如重金属盐类、硼酸盐、氯化物、氟化物、磷酸盐、硝酸镍等)、有机化合物类(如异位酸类、尿素衍生物、羟胺、氧肟酸类、多聚甲醛、醌、多元酚、杂环硫醇等)和植物提取物类(如丝兰属提取物、樟科植物提取物、大蒜提取物等)。无机和有机化合物存在安全性问题，对人畜和环境有毒害和污染，难以满足养殖业需求。植物提取物类相对安全，但植物生长周期长，原料来源不稳定，提取工艺较为复杂，规模化生产成本高、效率较低，且对脲酶的抑制作用较低，对于减少氨气挥发的能力有限。
发明内容
针对现有的脲酶抑制剂对人畜和环境有毒害和污染、对氨的抑制率不高的技术问题，本发明提供一种产脲酶抑制剂的凝结芽孢杆菌P1-678菌株。
以及，本发明还提供上述凝结芽孢杆菌P1-678菌株在减少粪便氨排放中的应用。
以及，本发明还提供一种复合菌剂。
为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：
一种产脲酶抑制剂的凝结芽孢杆菌P1-678菌株，其分类名称为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)，于2019年9月17日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC NO：18601；保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明所提供的凝结芽孢杆菌P1-678菌株从蛋鸡养殖场健康雏鸡的新鲜粪便中分离、筛选得到，属于芽孢杆菌属，无毒、无污染，具有产生脲酶抑制剂的高活性，其16SrDNA序列如SEQ ID NO.1所示。该凝结芽孢杆菌P1-678菌株可在畜禽肠道中生长繁殖并产生脲酶抑制剂，抑制畜禽粪便中的尿素或尿酸被脲酶分解成氨，对猪、鸡等粪便中的脲酶活性的抑制率可达到99.1％，有效降低畜禽肠道、血液中氨的含量。试验证明，该凝结芽孢杆菌P1-678菌株能在兼性厌氧条件下利用“类饲粮培养基”(成分与畜禽饲料接近的培养基)良好生长，并能产生75.18U/ml的酸性蛋白酶，表明该菌株能适应畜禽肠道环境，且能够在肠道起到促进蛋白消化的益生作用。并且，凝结芽孢杆菌P1-678菌株随粪便排出体外或直接添加入体外粪便中时，还能够在堆肥过程中继续抑制脲酶活性，在体外粪便氨排放试验中对氨的抑制率可达77.07％，从而起到氨减排的作用。
另一方面，该凝结芽孢杆菌P1-678菌株还能产生抗菌肽类物质，在摇瓶试验条件下可产生相当于土霉素45.29U/ml的抗菌活性，具有抑制大肠杆菌、沙门氏菌及魏氏梭菌等腹泻病原菌的作用，可防治畜禽腹泻。
该凝结芽孢杆菌P1-678菌株的筛选方法具体包括以下步骤：
①取蛋鸡养殖场健康雏鸡的新鲜鸡粪便在常温放置24h，制成菌悬液，80℃水浴10min，梯度稀释后涂布在用NA培养基常规培养，将培养所得菌落接种于平板初筛培养基培养48h；平板初筛培养基中含有20mg/ml尿素、1mg/ml酚红、10mg/ml蔗糖、10mg/ml蛋白胨、3mg/ml牛肉粉、5mg/ml氯化钠和20mg/ml琼脂，余量为蒸馏水，pH为6.4。
②从步骤①培养所得菌落中挑取周围未变色的菌落，分别用NA培养基斜面培养24h，然后接种于摇瓶初筛培养基中摇床培养1天，取不浑浊的样品，作为待选样品发酵液；摇瓶初筛培养基中含有20mg/ml尿素、10mg/ml蔗糖、5mg/ml氯化钾、0.5mg/ml硫酸镁、0.5mg/ml氯化钙、1mg/ml磷酸二氢钠和1mg/ml磷酸氢二钠，余量为蒸馏水，pH为6～8。
③从步骤①培养所得菌落中挑取周围变成红色的菌落，分别用NA培养基培养24h，然后接种于NB培养基中摇床培养24h，得到各菌落发酵液；向所得各菌落发酵液中分别加入尿素水溶液和酚红指示剂，摇匀，取粉红色出现时间最短发酵液，即为产脲酶菌株发酵液；取200μl经100℃水浴10min灭活的该产脲酶菌株发酵液，加入10ml尿素缓冲液，充分振摇混合后立即置于30℃±0.5℃恒温水浴中保持30min±10s，加入10ml盐酸溶液，振摇后迅速冷却至20℃以下，用氢氧化钠标准溶液滴定至溶液呈蓝绿色；另取200μl该产脲酶菌株发酵液，加入10ml盐酸溶液振摇，再加入10ml尿素缓冲液振摇，充分振摇后立即置于30℃±0.5℃恒温水浴中保持30min±10s，迅速冷却至20℃以下，用氢氧化钠标准溶液滴定至溶液呈蓝绿色；根据两份所述产脲酶菌株发酵液消耗的氢氧化钠标准溶液体积判断所述产脲酶菌株发酵液的活性；其中尿素缓冲液为含有0.5mol/L尿素、pH为7.0±0.1的磷酸盐缓冲液，盐酸溶液中氯化氢的浓度为0.1mol/L。
④将步骤②所得各待选样品发酵液分别与步骤③所得产脲酶菌株发酵液混合，加入尿素和酚红指示剂，稀释后摇匀，作为试验品；同法制备不含待选样品发酵液的样品，作为阳性对照；对比各试验品与阳性对照的颜色变为粉红色的时间，取变色时间长于阳性对照2min的试验品对应的菌株，即为产脲酶抑制剂的菌株。
⑤用GB/T 8622-2006饲料用大豆制品中尿素酶活性的测定方法检测步骤④所得菌株的活性，复筛得到所述凝结芽孢杆菌P1-678菌株。
以及，本发明实施例还提供上述凝结芽孢杆菌P1-678菌株在减少粪便氨排放中的应用。
本发明提供的凝结芽孢杆菌P1-678菌株具有高效稳定的降氨能力，通过日粮添加或直接添加到粪便中可以有效控制粪中脲酶的活性，减少粪便中尿素氮或尿酸氮的分解，同时，氨排放的减少还能降低堆肥肥效损失，在资源化、无害化处理畜牧业废弃物和治理环境污染，推进畜牧业健康可持续发展方面具有巨大的应用潜力。
优选地，将所述凝结芽孢杆菌P1-678菌株制成微生物菌剂用于饲料添加剂或粪便堆肥菌剂，将所述凝结芽孢杆菌P1-678菌株制成微生物菌剂的方法为：先液态深层发酵，然后将所得发酵液进行连续离心，最后将离心所得沉淀进行喷雾干燥。通过日粮添加或直接添加到粪便中可降低家禽的肠氨浓度和禽舍环境氨浓度，从而改善畜禽圈舍内的环境，减轻氨应激，提高畜禽免疫能力和生产性能。用于粪便堆肥菌剂可减少堆肥N/P比降低情况，促进堆肥腐熟。用于粪便堆肥菌剂可减少堆肥N/P比失调情况，促进堆肥腐熟。用于粪便堆肥菌剂可减少堆肥N/P比失调情况，促进堆肥腐熟。将凝结芽孢杆菌P1-678菌株用液态深层发酵、连续离心与喷雾干燥相结合的工艺，所得菌粉活菌(芽孢)含量可达4.0×1011CFU/g。所得菌粉可与可溶性淀粉混合制成饲料添加剂，使最终制备的微生物饲料添加剂活菌(芽孢)含量为1.0×1010CFU/g，含水量≤8％，所得饲料添加剂可用于饲料中添加，亦可用于饮水，保质期24个月。
以及，本发明实施例还提供一种复合菌剂，该复合菌剂为含上述凝结芽孢杆菌P1-678菌株与其他产脲酶抑制剂的菌株。粪便中产脲酶的微生物多种多样，产生脲酶的结构和性质也存在一定的差异，将不同的脲酶抑制剂合用后在氨减排功能上具有协同作用，可起到提升氨减排的效果。
优选地，所述其他能够产脲酶抑制剂的菌株的筛选方法具体包括以下步骤：
步骤a、将粪便制成菌悬液，用NA培养基常规培养，将培养所得菌落接种于含有尿素和酸碱指示剂的初筛培养基中培养；
步骤b、从步骤a培养所得菌落中挑取周围未变色的菌落，筛选不产脲酶的菌株制成待选样品发酵液；
步骤c、从步骤a培养所得菌落中挑取周围变色的菌落，制成产脲酶菌株发酵液；
步骤d、用步骤c所得产脲酶菌株发酵液与步骤b所得不产脲酶的菌株的发酵液混合，筛选出产脲酶抑制剂的菌株。
该筛选方法实行起来简便易行，不需要昂贵复杂的设备，成本低廉，一般的微生物实验室都可实现，且大规模生产的生产效率高、成本低。步骤b所得的待选样品发酵液中的菌株为不产脲酶的菌株，步骤c所得产脲酶菌株发酵液即为由微生物产生的脲酶溶液，通过步骤b和步骤d两步筛选相结合的方法，能够提高筛选效率，便于筛选出对脲酶具有抑制作用且更适合于降低畜禽粪便氨排放的菌株，节省了大量的人力物力。
优选地，步骤a中所述初筛培养基中含有20mg/ml尿素、1mg/ml酚红、10mg/ml蔗糖、10mg/ml蛋白胨、3mg/ml牛肉粉、5mg/ml氯化钠和20mg/ml琼脂，余量为蒸馏水，pH为6.4。
优选地，步骤a中所述畜禽粪便为新鲜畜禽粪便在常温放置24～36h的粪便。
优选地，步骤b中所述筛选不产脲酶的菌株制成待选样品发酵液的方法为：将所述周围未变色的菌落分别用NA培养基24～48h，然后接种于含有尿素的摇瓶初筛培养基中摇床培养1～2天，不浑浊的样品即为待选样品发酵液。在含有尿素的摇瓶培养基内不浑浊则表明菌株不生长，证明该菌株不能产生脲酶，不能利用尿素为氮源。因此，不浑浊的样品对应的菌株为不产脲酶的菌株，该不浑浊的样品为不产脲酶菌株的发酵液。该摇瓶初筛培养基的成分优选为：20mg/ml尿素、10mg/ml蔗糖、5mg/ml氯化钾、0.5mg/ml硫酸镁、0.5mg/ml氯化钙、1mg/ml磷酸二氢钠和1mg/ml磷酸氢二钠，余量为蒸馏水，pH为6～8。用NA培养基培养的方法优选采用斜面培养。
优选地，步骤c中制备产脲酶菌株发酵液的方法为：从步骤a培养所得菌落中挑取周围变成红色的菌落，分别用NA培养基培养24～48h，然后接种于NB培养基中摇床培养24～48h，得到各菌株发酵液；向所得各菌株发酵液中分别加入尿素水溶液和酚红指示剂，摇匀，取粉红色出现时间最短发酵液，即为产脲酶菌株发酵液。周围变成红色的菌落即为产脲酶的菌株菌落，其红色范围扩散越大，说明其产脲酶活性越强，本步骤优选红色范围尽可能大的菌落，以确保所得产脲酶的菌株的活性更强。用NA培养基培养的方法优选采用斜面培养。发酵液的粉红色出现时间越短，则对应的产脲酶菌株的产脲酶活性越高，均有高活性的菌株其粉红色出现时间少于15min。粉红色出现时间最短的发酵液对应的菌株的脲酶活力可达到0.165U/g，可作为筛选工具用于步骤d中进行凝结芽孢杆菌P1-678菌株的筛选。
优选地，步骤c还包括对所得产脲酶菌株发酵液进行复筛，所述复筛的方法为：将所述产脲酶菌株发酵液与尿素缓冲液混合，通过所述尿素缓冲液中的尿素消耗情况判断所述产脲酶菌株发酵液菌株的活性。具体方法可优选为：取200μl经灭活的所述产脲酶菌株发酵液，加入10ml尿素缓冲液，充分振摇混合后立即置于30℃±0.5℃恒温水浴中保持30min±10s，加入10ml盐酸溶液，振摇后迅速冷却至20℃以下，用氢氧化钠标准溶液滴定至溶液呈蓝绿色；另取200μl所述产脲酶菌株发酵液，加入10ml盐酸溶液振摇，再加入10ml尿素缓冲液振摇，充分振摇后立即置于30℃±0.5℃恒温水浴中保持30min±10s，迅速冷却至20℃以下，用氢氧化钠标准溶液滴定至溶液呈蓝绿色；根据两份所述产脲酶菌株发酵液消耗的氢氧化钠标准溶液体积判断所述产脲酶菌株发酵液的活性；其中所述尿素缓冲液为含有0.5mol/L尿素、pH为7.0±0.1的磷酸盐缓冲液，所述盐酸溶液中氯化氢的浓度为0.1mol/L。灭活产脲酶菌株发酵液的方法优选100℃水浴10min。
其中，迅速冷却可采用冰浴或冷水冲淋容器外壁等方式。在判断活性的方法可由下式计算：
Figure BDA0002273705210000071
式中：X为试样的尿素酶活性(U/g)；c为氢氧化钠标准滴定溶液浓度(mol/L)；V0为第二份产脲酶菌株发酵液消耗氢氧化钠标准滴定溶液体积(ml)；V为第一份产脲酶菌株发酵液消耗氢氧化钠标准滴定溶液体积(ml)；14为氮的摩尔质量；30为反应时间(min)；m为试样体积(ml)。根据此方法可以计算出产脲酶菌株的具体脲酶活力。
优选地，步骤d的具体操作方法为：将步骤a所得各所述待选样品发酵液分别与所述产脲酶菌株发酵液混合，加入尿素和酚红指示剂，稀释后摇匀，作为试验品；同法制备不含待选样品发酵液的样品，作为阳性对照；对比各所述试验品与阳性对照的颜色变为粉红色的时间，变色时间长于所述阳性对照至少0.5min的所述试验品对应的菌株，即为产脲酶抑制剂的菌株。
优选地，所述其他能够产脲酶抑制剂的菌剂中的菌株为枯草芽孢杆菌J530菌株，其分类名称为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，于2019年9月17日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC NO：18603；保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。该菌株与上述凝结芽孢杆菌P1-678菌株之间有显著的协同作用，用于畜禽粪便氨减排具有更优的效果。其16S rDNA序列如SEQ ID NO.2所示。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
本发明实施例提供了一种产脲酶抑制剂的凝结芽孢杆菌P1-678菌株，该菌株通过以下步骤筛选得到：
1、不产脲酶菌株的筛选
1.1培养基配方
平板初筛培养基：20mg/ml尿素、1mg/ml酚红、10mg/ml蔗糖、10mg/ml蛋白胨、3mg/ml牛肉粉、5mg/ml氯化钠和20mg/ml琼脂，余量为蒸馏水，pH为6.4。
摇瓶初筛培养基：20mg/ml尿素、10mg/ml蔗糖、5mg/ml氯化钾、0.5mg/ml硫酸镁、0.5mg/ml氯化钙、1mg/ml磷酸二氢钠和1mg/ml磷酸氢二钠，余量为蒸馏水，pH为6～8。
NA培养基：10mg/ml蛋白胨、3mg/ml牛肉膏、5mg/ml氯化钠、20mg/ml琼脂，余量为蒸馏水，pH7.2～7.4
所有培养基均用蒸馏水配制，121℃20min高压蒸汽灭菌。
1.2平板初筛
取保定市某蛋鸡养殖场健康雏鸡的新鲜鸡粪便样品，室温下放置24h，使其中的芽孢杆菌充分形成芽孢。称取5g静置后的粪便样品，加入到盛有45ml无菌水和15粒玻璃珠的250ml的三角瓶中，150r/min摇床上摇动5min，80℃水浴10min，得到浓度为10-1的菌悬液。然后利用无菌水进行10倍梯度稀释，得到浓度为10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和10-7的菌悬液。取浓度为10-4、10-5、10-6和10-7的菌悬液分别各涂布5个NA平板培养基，每平板0.1ml，37℃倒置培养48h。
用灭菌竹签挑取NA平板培养基上生长的菌落，在平板初筛培养基平板上进行划“十字”接种，37℃倒置培养48h后观察“十字”菌苔周围的颜色变化。筛选挑取周围仍为黄色(不变成红色)的菌落于NA斜面培养基，37℃培养24h后保藏备用。
1.3摇瓶初筛
用灭菌竹签挑取1.2平板初筛中得到的斜面菌苔，接种至50ml摇瓶初筛培养基中(250ml三角瓶)，37℃、150r/min摇床培养1天，观察培养基浑浊情况。不浑浊的发酵液即为不产脲酶菌株的发酵液，保藏备用。共从5000余株菌中筛选出127株不产脲酶的菌株。
2、产脲酶菌株的筛选
2.1试剂及培养基配方
尿素：分析纯。
酚红指示剂：称取0.1g酚红，加1.43ml 0.1mol/L氢氧化钠溶液，在研钵中研磨以促溶解，然后转移至250ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀备用。
平板初筛培养基：20mg/ml尿素、1mg/ml酚红、10mg/ml蔗糖、10mg/ml蛋白胨、3mg/ml牛肉粉、5mg/ml氯化钠和20mg/ml琼脂，余量为蒸馏水，pH为6.4；
NA培养基：10mg/ml蛋白胨、3mg/ml牛肉膏、5mg/ml氯化钠、20mg/ml琼脂，余量为蒸馏水，pH为7.2～7.4；
NB培养基：10mg/ml蛋白胨、3mg/ml牛肉膏、5mg/ml氯化钠，余量为蒸馏水，pH为7.2～7.4；
所有培养基均为蒸馏水配制，121℃20min高压蒸汽灭菌。
尿素缓冲溶液(pH7.0±0.1)：称取8.95g磷酸氢二钠，3.40g磷酸二氢钾溶于水并稀释至1000ml，再将30g尿素溶解在此缓冲液中，有效期一个月。
盐酸溶液[c(HCl)＝0.1mol/L]：移取8.3ml盐酸，用水稀释至1000ml。
氢氧化钠溶液[c(NaOH)＝0.1mol/L]：称取4g氢氧化钠溶于水并稀释至1000ml。
混合指示剂：即甲基红、溴甲酚绿混合乙醇溶液：称取0.1g甲基红，溶于95％乙醇并稀释至100ml，再称取0.5g溴甲酚绿，溶于95％乙醇并稀释至100ml，两种溶液等体积混合，储存于棕色瓶中。
2.2产脲酶菌株的初筛
取1.2中平板初筛培养基平板上“十字”接种后菌苔周围变成红色且扩散范围较大的菌落于NA斜面培养基，37℃培养24h后保藏备用。将这些菌株接种到盛有50ml NB培养基的250ml三角瓶中，150r/min摇床培养24h，即制成发酵液。
取1.0ml上述发酵液，加入到25ml的比色管中，加0.02g尿素(现配的2％(m/v)尿素水溶液1.0ml)，加酚红指示剂2滴，再加水20ml，充分摇匀15秒。记录粉红色出现时间，并根据时间判断脲酶活性。另设样品空白(不加尿素)及试剂空白(不加样品)，样品空白及试剂空白加入酚红指示剂后不改变颜色，说明试验结果可靠。记录粉红色出现时间最短(少于15min)的发酵液，即为本发明的产脲酶菌株发酵液，其对应的菌株脲酶活性最高，保藏备用。
2.3产脲酶菌株的复筛
量取200μl±1μl产脲酶菌株发酵液于比色管中，加入10ml尿素缓冲液，立即盖好比色管剧烈振摇，然后将该比色管马上置于30℃±0.5℃恒温水浴中，计时保持30min±10s。当停止反应时加入10ml盐酸溶液，振摇后迅速冷却至20℃。将该比色管内容物全部转入250ml锥形瓶中，加入8～10滴混合指示剂，以氢氧化钠标准溶液滴定至溶液呈蓝绿色，记录消耗的氢氧化钠体积。
另取比色管做空白试验，量取200μl±1μl经100℃水浴10min灭活的产脲酶菌株的发酵液于比色管中，加入10ml盐酸溶液，振摇后再加入10ml尿素缓冲液，立即盖好比色管盖剧烈振摇，然后将该比色管马上置于30℃±0.5℃恒温水浴中，计时保持30min±10s。停止反应时将该比色管迅速冷却至20℃，然后将该比色管内容物全部转入250ml锥形瓶中加入8～10滴混合指示剂，以氢氧化钠标准溶液滴定至溶液呈蓝绿色，记录消耗的氢氧化钠体积。
Figure BDA0002273705210000101
式中：X为试样的尿素酶活性(U/g)；c为氢氧化钠标准滴定溶液浓度(mol/L)；V0为空白消耗氢氧化钠标准滴定溶液体积(ml)；V为试样消耗氢氧化钠标准滴定溶液体积(ml)；14为氮的摩尔质量；30为反应时间(min)；m为试样体积(ml)。
3、产脲酶抑制剂的菌株筛选
取1.0ml产脲酶菌株发酵液加入到25ml的比色管中，加入1.0ml上述1.3所得的不产脲酶菌株的发酵液，混匀，加0.02g尿素(现配的2％(m/v)尿素水溶液1.0ml)和酚红指示剂2滴，再加水20ml，充分摇匀15秒，作为试验组。同时除不加入不产脲酶菌株的发酵液的样品外，其余制备方法同试验组，作为阳性对照组。记录试验组比色管与阳性对照组比色管粉红色出现时间，并根据时间判断发酵液中有无脲酶抑制剂，如果试验组比色管粉红色出现时间比阳性对照组比色管长，说明有脲酶抑制剂存在；如果试验组比色管粉红色出现时间与阳性对照组比色管相同或者更短说明无脲酶抑制剂存在，根据此原理即可挑选出可以含脲酶抑制剂的发酵液，其对应的菌株即为产脲酶抑制剂的菌株。取变色时间长于阳性对照2min的试验品对应的菌株。
4、产脲酶抑制剂菌株的复筛
将上述初步筛选出来的产脲酶抑制剂的菌株，运用GB/T 8622-2006饲料用大豆制品中尿素酶活性的测定方法来对所得菌株的产脲酶抑制剂活性进行定量检测，在试样试管和空白试管中都加入产脲酶抑制剂的菌株发酵液200μl，测定加入脲酶抑制剂之后的产脲酶菌株的脲酶活力，再将此脲酶活力与之前已知的未加脲酶抑制剂的产脲酶菌株的脲酶活力相比较，计算得到脲酶活力降低值，从而就能筛选出具有产脲酶抑制剂的凝结芽孢杆菌P1-678菌株。
5、凝结芽孢杆菌P1-678菌株的鉴定
对凝结芽孢杆菌P1-678菌株进行鉴定，生理生化鉴定特征结果如表1所示。
表1
Figure BDA0002273705210000111
Figure BDA0002273705210000121
对凝结芽孢杆菌P1-678菌株进行16S rDNA序列检测，所得序列如SEQ ID NO.1所示。根据表1的鉴定特征及16S rDNA序列检测，可鉴定P1-678菌株为凝结芽孢杆菌。
将该凝结芽孢杆菌P1-678菌株保藏于2019年9月17日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC NO：18601；保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
实施例2
本实施例提供了凝结芽孢杆菌P1-678菌株作为饲料添加剂在减少粪便氨排放中的应用。
将实施例1所得凝结芽孢杆菌P1-678菌株按0.1％(m/m)的添加量加入到猪饲料中，检测猪粪便及肠道中蛋白酶活性变化情况。结果如表2所示。
表2
Figure BDA0002273705210000122
Figure BDA0002273705210000131
由表2的结果可见，在饲料中添加凝结芽孢杆菌P1-678菌株后，可显著提高蛋白酶活性。蛋白酶活性的提高可提高饲料蛋白利用率，减少蛋白质等含氮物质的排泄，从氨气产生源头降低粪便氨气的排放。
实施例3
本实施例提供了凝结芽孢杆菌P1-678菌株作为粪便堆肥菌剂在减少粪便氨排放中的应用。
1、试剂及配制方法
硫酸，ρ(H2SO4)＝1.84g/ml；
硫酸吸收液，c(1/2H2SO4)＝0.01mol/L：量取2.7ml硫酸加入水中，并稀释至1L，配得0.1mol/L的贮备液，临用时再稀释10倍；
纳氏试剂：称取12g氢氧化钠(NaOH)溶于60ml水中，冷却，称取1.7g二氯化汞(HgCl2)溶解在30ml水中，称取3.5g碘化钾(KI)于10ml水中，在搅拌下将上述二氯化汞溶液慢慢加入碘化钾溶液中，直至形成的红色沉淀不再溶解为止，在搅拌下，将冷却至室温的氢氧化钠溶液缓慢地加入到上述二氯化汞和碘化钾的混合液中，再加入剩余的二氯化汞溶液，混匀后于暗处静置24h，倾出上清液，储于棕色瓶中，用橡皮塞塞紧，2℃～5℃保存并在1个月内使用；
酒石酸钾钠溶液，ρ＝500g/L：称取50g酒石酸钾钠(KNaC4H6O6·4H2O)，加入60ml蒸馏水，水浴加热溶解，冷却后定容至100ml。
2、试验步骤
将用实施例1中得到的凝结芽孢杆菌P1-678菌株接种到NB培养基中，150r/min 37℃摇床培养24h，制成菌株的发酵液。称取200g新鲜猪粪，均匀放入1000ml大烧杯中，将凝结芽孢杆菌P1-678菌株的发酵液按20％的接种量(即40ml)倒入大烧杯中并混合均匀，然后将盛有40ml硫酸吸收液的50ml小烧杯也放入大烧杯中。先在大烧杯的外杯壁上涂抹一层凡士林，以保证保鲜膜与杯壁的贴合性和气密性，然后用双层保鲜膜封住大烧杯的口，以保证产生的氨气不会泄露到大气中，都能被硫酸吸收液吸收。以上为试验组。
同时设置一个对照组，对照组不接种菌株的发酵液而是添加等量的无菌水，其余都与试验组相同。
然后将密封好的大烧杯放入30℃恒温的生化培养箱中，培养7天。培养结束后利用中华人民共和国国家环境保护标准HJ 533-2009环境空气和废气中氨的测定纳氏试剂分光光度法来测定出试验组和对照组的相对氨气含量。通过对比试验组和对照组产生氨气的差别，判断出凝结芽孢杆菌P1-678菌株对于畜禽粪便有无氨减排的作用。
3、氨气释放量的测定
分别取上述培养7天后各组的硫酸吸收液10ml于25ml比色管中，分别加入0.50ml酒石酸钾钠溶液，摇匀，再分别加入0.50ml纳氏试剂，摇匀，放置10min后，以水作参比，用10mm比色皿在波长420nm处测定吸光度。因为稀硫酸溶液吸收空气中的氨，生成的铵离子与纳氏试剂反应生成黄棕色络合物，该络合物在420nm的吸光度与氨的含量成正比，所以通过比较试验组和对照组在420nm波长处的吸光度，即可得知试验组氨气比对照组减少了多少，从而看出本发明提供的产脲酶抑制剂的菌株筛选方法筛选所得的菌株对于畜禽粪便的氨减排效果。通过此方法得出对照组样品稀释6倍后的吸光度值为0.499，添加上述凝结芽孢杆菌P1-678菌株的试验组的吸光度为0.686。根据计算可得知，凝结芽孢杆菌P1-678菌株在体外粪便试验中对氨气的抑制率为77.09％。说明本发明提供的凝结芽孢杆菌P1-678菌株可大幅度降低畜禽粪便的氨气排放。
实施例4
本实施例提供了一种复合菌剂。
制备其他产脲酶抑制剂的菌株，具体制备方法为：
①取保定市某肉牛养殖场雄牛的新鲜牛粪便在常温放置36h，制成菌悬液，用NA培养基常规培养，将培养所得菌落接种于初筛培养基培养36h；初筛培养基中含有20mg/ml尿素、1mg/ml酚红、10mg/ml蔗糖、10mg/ml蛋白胨、3mg/ml牛肉粉、5mg/ml氯化钠和20mg/ml琼脂，余量为蒸馏水，pH为6.4。
②从步骤①培养所得菌落中挑取周围未变色的菌落，分别用NA培养基36h，然后接种于摇瓶初筛培养基中摇床培养1天，取不浑浊的样品，作为待选样品发酵液；摇瓶初筛培养基中含有20mg/ml尿素、10mg/ml蔗糖、5mg/ml氯化钾、0.5mg/ml硫酸镁、0.5mg/ml氯化钙、1mg/ml磷酸二氢钠和1mg/ml磷酸氢二钠，余量为蒸馏水，pH为6～8。
③从步骤①培养所得菌落中挑取周围变成红色的菌落，分别用NA培养基培养24h，然后接种于NB培养基中摇床培养24h，得到各菌落发酵液；向所得各菌落发酵液中分别加入尿素水溶液和酚红指示剂，摇匀，取粉红色出现时间最短发酵液，即为产脲酶菌株发酵液；取200μl该产脲酶菌株发酵液，加入10ml尿素缓冲液，充分振摇混合后立即置于30℃±0.5℃恒温水浴中保持30min±10s，加入10ml盐酸溶液，振摇后迅速冷却至20℃以下，用氢氧化钠标准溶液滴定至溶液呈蓝绿色；另取200μl经100℃水浴10min灭活的该产脲酶菌株发酵液，加入10ml盐酸溶液振摇，再加入10ml尿素缓冲液振摇，充分振摇后立即置于30℃±0.5℃恒温水浴中保持30min±10s，迅速冷却至20℃以下，用氢氧化钠标准溶液滴定至溶液呈蓝绿色；根据两份所述产脲酶菌株发酵液消耗的氢氧化钠标准溶液体积判断所述产脲酶菌株发酵液的活性；其中尿素缓冲液为含有0.5mol/L尿素、pH为7.0±0.1的磷酸盐缓冲液，盐酸溶液中氯化氢的浓度为0.1mol/L。
④将步骤②所得各待选样品发酵液分别与步骤③所得产脲酶菌株发酵液混合，加入尿素和酚红指示剂，稀释后摇匀，作为试验品；同法制备不含待选样品发酵液的样品，作为阳性对照；对比各试验品与阳性对照的颜色变为粉红色的时间，取变色时间长于阳性对照2min的试验品对应的菌株，得到产脲酶抑制剂的菌株。
按实施例3的方法，以作为粪便堆肥菌剂的形式考察该菌株在减少粪便氨排放中的效果，结果证明，该菌株在与实施例3中相同接种量的情况下其吸光度为0.487(稀释3倍)，即，该菌株在体外粪便试验中对氨气的抑制率为51.20％。将该菌株与凝结芽孢杆菌P1-678菌株按质量比1:1进行复配，按实施例3的方法，以作为粪便堆肥菌剂的形式考察该复合菌剂在减少粪便氨排放中的效果。结果证明，在与实施例3中相同接种量的情况下，本实施例所提供的复合菌剂试验组的吸光度为0.791，即，在体外粪便试验中对氨气的抑制率为73.58％，比单用该菌株的抑制率提高了22.38％，且比该菌株与凝结芽孢杆菌P1-678菌株的抑制率平均值提高了9.44％，说明凝结芽孢杆菌P1-678菌株能够提高其他产脲酶抑制剂的菌株氨减排的效果。
实施例5
本实施例提供了另一种复合菌剂。
制备其他产脲酶抑制剂的菌株，具体制备方法为：
①取保定市某肉鸡养殖场健康鸡群的新鲜鸡粪便在常温放置24h，制成菌悬液，80℃水浴10min，梯度稀释后涂布在用NA培养基常规培养，将培养所得菌落接种于初筛培养基培养24h；初筛培养基中含有20mg/ml尿素、1mg/ml酚红、10mg/ml蔗糖、10mg/ml蛋白胨、3mg/ml牛肉粉、5mg/ml氯化钠和20mg/ml琼脂，余量为蒸馏水，pH为6.4。
②从步骤①培养所得菌落中挑取周围未变色的菌落，分别用NA培养基斜面培养36h，然后接种于摇瓶初筛培养基中摇床培养1天，取不浑浊的样品，作为待选样品发酵液；摇瓶初筛培养基中含有20mg/ml尿素、10mg/ml蔗糖、5mg/ml氯化钾、0.5mg/ml硫酸镁、0.5mg/ml氯化钙、1mg/ml磷酸二氢钠和1mg/ml磷酸氢二钠，余量为蒸馏水，pH为6～8。
③从步骤①培养所得菌落中挑取周围变成红色的菌落，分别用NA培养基培养48h，然后接种于NB培养基中摇床培养48h，得到各菌落发酵液；向所得各菌落发酵液中分别加入尿素水溶液和酚红指示剂，摇匀，取粉红色出现时间最短发酵液，即为产脲酶菌株发酵液；取200μl经100℃水浴10min灭活的该产脲酶菌株发酵液，加入10ml尿素缓冲液，充分振摇混合后立即置于30℃±0.5℃恒温水浴中保持30min±10s，加入10ml盐酸溶液，振摇后迅速冷却至20℃以下，用氢氧化钠标准溶液滴定至溶液呈蓝绿色；另取200μl该产脲酶菌株发酵液，加入10ml盐酸溶液振摇，再加入10ml尿素缓冲液振摇，充分振摇后立即置于30℃±0.5℃恒温水浴中保持30min±10s，迅速冷却至20℃以下，用氢氧化钠标准溶液滴定至溶液呈蓝绿色；根据两份所述产脲酶菌株发酵液消耗的氢氧化钠标准溶液体积判断所述产脲酶菌株发酵液的活性；其中尿素缓冲液为含有0.5mol/L尿素、pH为7.0±0.1的磷酸盐缓冲液，盐酸溶液中氯化氢的浓度为0.1mol/L。
④将步骤②所得各待选样品发酵液分别与步骤③所得产脲酶菌株发酵液混合，加入尿素和酚红指示剂，稀释后摇匀，作为试验品；同法制备不含待选样品发酵液的样品，作为阳性对照；对比各试验品与阳性对照的颜色变为粉红色的时间，取变色时间长于阳性对照1.5min的试验品对应的菌株，得到产脲酶抑制剂的菌株。按实施例3的方法，以作为粪便堆肥菌剂的形式考察该菌株在减少粪便氨排放中的效果，结果证明，该菌株在与实施例3中相同接种量的情况下其吸光度为0.276，即，该菌株在体外粪便试验中对氨气的抑制率为90.78％。将该菌与凝结芽孢杆菌P1-678菌株按质量比1:1进行复配，按实施例3的方法，以作为粪便堆肥菌剂的形式考察该复合菌剂在减少粪便氨排放中的效果。结果证明，在与实施例3中相同接种量的情况下，本实施例所提供的复合菌剂试验组的吸光度为0.080，即，在体外粪便试验中对氨气的抑制率为97.33％，比单用该菌株的抑制率提高了6.55％，且比该菌株与凝结芽孢杆菌P1-678菌株的抑制率平均值提高了13.40％，并比单用凝结芽孢杆菌P1-678菌株提高了20.24％，说明凝结芽孢杆菌P1-678菌株能够提高其他产脲酶抑制剂的菌株氨减排的效果，且该菌株同样还能提高凝结芽孢杆菌P1-678菌株氨减排的效果。该菌株经鉴定为枯草芽孢杆菌，将其进行保藏，菌株名称为枯草芽孢杆菌J530，其分类名称为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，于2019年9月17日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC NO：18603；保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 乌拉特前旗荣生大地生物科技饲料有限责任公司，河北农业大学
<120> 一种产脲酶抑制剂的凝结芽孢杆菌P1-678菌株及其应用
<130> 2019.10.08
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1377
<212> DNA
<213> 凝结芽孢杆菌P1-678 16R rDNA
<400> 1
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<210> 2
<211> 1371
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌J530 16S rDNA
<400> 2
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aatcgctagt aatcgcggat cagcatgccg cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca 1320
ccgcccgtca caccacgaga gtttgtaaca cccgaagtcg gtgaggtaac c 1371

Claims (9)

1. 一种产脲酶抑制剂的凝结芽孢杆菌P1-678菌株，其分类名称为凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans），于2019年9月17日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC NO：18601；保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.权利要求1所述的凝结芽孢杆菌P1-678菌株在减少粪便氨排放中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，将所述凝结芽孢杆菌P1-678菌株制成微生物菌剂用于饲料添加剂或粪便堆肥菌剂，将所述凝结芽孢杆菌P1-678菌株制成微生物菌剂的方法为：先液态深层发酵，然后将所得发酵液进行连续离心，最后将离心所得沉淀进行喷雾干燥。
4.一种复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂为含权利要求1项所述凝结芽孢杆菌P1-678菌株与其他产脲酶抑制剂的菌株。
5.根据权利要求4所述的复合菌剂，其特征在于：所述其他能够产脲酶抑制剂的菌株的筛选方法具体包括以下步骤：
步骤a、将粪便制成菌悬液，用NA培养基常规培养，将培养所得菌落接种于含有尿素和酸碱指示剂的平板初筛培养基中培养；
步骤b、从步骤a培养所得菌落中挑取周围未变色的菌落，筛选不产脲酶的菌株制成待选样品发酵液；
步骤c、从步骤a培养所得菌落中挑取周围变色的菌落，制成产脲酶菌株发酵液；
步骤d、用步骤c所得产脲酶菌株发酵液与步骤b所得不产脲酶的菌株的发酵液混合，筛选出产脲酶抑制剂的菌株。
6.根据权利要求5所述的复合菌剂，其特征在于：步骤a中所述平板初筛培养基中含有20mg/ml尿素、1mg/ml酚红、10mg/ml蔗糖、10mg/ml蛋白胨、3mg/ml牛肉粉、5mg/ml氯化钠和20mg/ml琼脂，余量为蒸馏水，pH为6.4；和/或
步骤a中所述粪便为新鲜畜禽粪便在常温放置24~36h的粪便。
7. 根据权利要求5所述的复合菌剂，其特征在于，步骤b中所述筛选不产脲酶的菌株制成待选样品发酵液的方法为：将所述周围未变色的菌落分别用NA培养基24~48h，然后接种于含有尿素的摇瓶初筛培养基中摇床培养1~2天，不浑浊的样品即为待选样品发酵液。
8.根据权利要求5所述的复合菌剂，其特征在于，步骤c中制备产脲酶菌株发酵液的方法为：从步骤a培养所得菌落中挑取周围变色的菌落，分别用NA培养基培养24~48h，然后接种于NB培养基中摇床培养24~48h，得到各菌株发酵液；向所得各菌株发酵液中分别加入尿素水溶液和酚红指示剂，摇匀，取粉红色出现时间最短发酵液，即为产脲酶菌株发酵液；和/或
步骤c还包括对所得产脲酶菌株发酵液进行复筛，所述复筛的方法为：将所述产脲酶菌株发酵液与尿素缓冲液混合，通过所述尿素缓冲液中的尿素消耗情况判断所述产脲酶菌株发酵液菌株的活性。
9.根据权利要求5所述的复合菌剂，其特征在于，步骤d的具体操作方法为：将步骤b所得各所述待选样品发酵液分别与所述产脲酶菌株发酵液混合，加入尿素和酚红指示剂，稀释后摇匀，作为试验品；同法制备不含待选样品发酵液的样品，作为阳性对照；对比各所述试验品与阳性对照的颜色变为粉红色的时间，变色时间长于所述阳性对照至少0.5min的所述试验品对应的菌株，即为产脲酶抑制剂的菌株。
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