CN106399166B - 一株防治植物根结线虫的木糖氧化无色杆菌及其应用 - Google Patents

一株防治植物根结线虫的木糖氧化无色杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株防治植物根结线虫的木糖氧化无色杆菌及其应用，所述的木糖氧化无色杆菌为Achromobacter xylosoxidans AH‑5，CCTCC NO:M 2016458。在室内杀线活性测定试验中，AH‑5菌株发酵上清液对线虫二龄幼虫的24h的致死率可达92.4%；室内盆栽试验结果显示，AH‑5发酵菌液处理组的豌豆根系根结数明显减少，40天后防效可达72.29%。在豌豆根结线虫病的大田试验中，AH‑5处理组的豌豆根系根结数明显减少，120天对根结线虫病的防效为43.59%；而该菌的发酵菌液还可以具有促进豌豆植株生长、根系伸长的作用，是一株极具开发潜力的线虫病害的生防细菌。

Description

一株防治植物根结线虫的木糖氧化无色杆菌及其应用
技术领域
本发明属于植物病害生物防治技术领域，具体涉及一种防治植物线虫病害的无色杆菌及其应用。
背景技术
根结线虫因其世界范围性的地理分布以及广泛的寄主范围，对许多重要的经济作物造成严重危害，被认为是世界范围内最重要的病原物之一。据估计，最常见的种可以侵染超过5500种植物。根结线虫的寄主遍及粮食、油料、蔬菜、果树等作物，例如番茄、生菜、黄瓜、花生、烟草、柑橘等植物都可被根结线虫侵染。植物根系发病后多个根结连在一起,形成大小不一的肿瘤，发病晚期根变得粗糙且容易腐烂。根部畸形导致整个植物运输系统受损，从而导致植株地上部分出现发育不良、矮化、黄化以及果实畸形等症状，更加严重时则导致植株死亡。
线虫病害在生产上已成为一类重要的顽固性病害，控制该病害的发生与蔓延是确保作物产量与品质而急需解决的问题。目前根结线虫病的防治主要有以下3种方法，即农业防治、化学防治和生物防治。
种植抗性品种是一种重要的控制线虫病害发生的农业措施，而抗病品种的缺乏限制了它的发展，而且部分抗性品种并没有很全面的应用。部分番茄抗性品种的种植与其它防治手段的联合使用虽然已经取得了一定的效果，但是因为有些品种在一些国家当地产量低，所以推行后并没有受到种植者们的欢迎。
长期以来，我国农作物的病虫害防治主要依赖化学农药，现阶段防治根结线虫的主要方法还是依赖于化学药剂。化学药剂高效，易使用，但是由于农药污染较为严重，食品中农药检出率高达90％以上，这严重危害了消费者的身体健康。同时，由于食品农药残留问题导致我国农产品出口受阻，这对我国现代农业产业的发展构成了严重影响。因此，农药残留已成为食品安全生产中急需解决的问题。相比化学农药，生物农药具有安全、环保和无残留等优点。注重低毒、高效和选择性强的生物农药开发已成为当前的研究热点之一。
目前，许多研究者提倡并在重点研究开发利用生物防治技术来控制线虫病害。生物防治措施既对环境友好，对人畜安全，又能有效控制病害的发生与蔓延所以颇受青睐。目前已经报道过的生防真菌有淡紫紫孢菌(Purpureocillium lilacinum)、厚垣轮枝菌(Verticillium chlamydosporium)、被毛孢(Hissutella spp.)、绿色木霉(Trichodermaviride)等，杀线效果较好的生防细菌有巴氏杆菌(Pasteuria spp.)、芽孢杆菌(Bacillusspp.)和假单胞菌(Pseudomonas spp.)、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)等。
迄今为止，利用细菌防治线虫病害的报道不少，但是关于利用木糖氧化无色杆菌防治植物线虫病害研究尚未被报道过。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种木糖氧化无色杆菌Achromobacterxylosoxidans AH-5(本发明或称为AH-5菌株)，该菌株对根结线虫病有较强的防治效果。该菌株已于2016年9月5日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：Achromobacterxylosoxidans AH-5；保藏编号：CCTCC NO：M 2016458；地址：中国武汉武汉大学。
本发明的第二个目的是在于提供了一种Achromobacter xylosoxidans AH-5在制备防治根结线虫病生物制剂药物中的应用，特别适合于根结线虫病的防治。
本发明最后一个目的在于提供了一种Achromobacter xylosoxidans AH-5在促进豌豆生长中的应用。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施：
一种Achromobacter xylosoxidans AH-5，通过以下方式获得：
申请人从中国安徽省土壤土样中分离、筛选得到一株对根结线虫具有较强防治效果的菌株，将其命名为AH-5。通过形态学、生理生化测定及分子生物学的鉴定，鉴定为木糖氧化无色杆菌Achromobacter xylosoxidans。
该菌株已于2016年9月5日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：Achromobacter xylosoxidans AH-5；保藏编号：CCTCC NO：M 2016458；地址：中国武汉武汉大学。
Achromobacter xylosoxidans AH-5菌株菌落特征：菌落圆形，浅黄色，半透明，菌落凸起，革兰氏染色后菌体呈现红色，为阴性菌。
平板培养Achromobacter xylosoxidans AH-5使用的是NA培养基，该培养基组分及配方如下：蛋白胨5g，葡萄糖2.5g，牛肉膏3g，琼脂20g，补充蒸馏水至1000mL，调pH至7.0，在121℃高压蒸汽灭菌30min；35℃，暗培养。
一种木糖氧化无色杆菌AH-5在制备防治根结线虫病生物制剂药物中的应用，包括利用该菌株作为唯一有效成分或有效成分之一制备成防治植物线虫病害的药物。
本发明的保护内容还包括木糖氧化无色杆菌AH-5在制备生物杀线虫剂的应用。
一种木糖氧化无色杆菌AH-5在促进豌豆生长中的应用，包括所述的木糖氧化无色杆菌AH-5发酵液用于制备豌豆促生长制剂。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1.本发明筛选出一株防治根结线虫病的新菌株AH-5，该菌株是一种木糖氧化无色杆菌，目前没有关于该菌株防治根结线虫病的相关报道。
2.利用该菌的发酵菌液，能有效地控制线虫病害的发生和危害。本发明筛选出的AH-5菌株对根结线虫在室内生测试验中，AH-5发酵上清液对二龄幼虫24h的致死率可达到92.4％；室内盆栽试验结果表显示，AH-5发酵菌液处理组的豌豆根系根结数明显减少，40天后防效可达72.29％，60天后防效为41.75％。在豌豆根结线虫病的大田试验中，120天后AH-5处理组的豌豆根系根结数明显减少，对根结线虫病的防效高达43.59％。
3.在盆栽试验、田间试验中，AH-5菌株对豌豆有较好的促生作用，在株高、根长、根部鲜重方面均与对照组存在显著差异(P≤5％)。
4.本发明使用的菌株对根结线虫病防效较高，对人畜无毒；成本低。
5.本发明利用木糖氧化无色杆菌AH-5菌株的发酵菌液直接防治根结线虫病，生产和使用均十分简单，生产中没有用到有机溶剂，降低了生产过程中和产品中的污染，也不会产生溶剂中毒，具有生物农药对人畜安全的优点。
附图说明
图1为菌株AH-5在牛肉膏蛋白胨平板上的菌落形态、革兰氏染色图片。
图2为盆栽试验中AH-5处理组与清水对照组60天豌豆根系图片。
图3为盆栽试验中AH-5处理组与清水对照组60天豌豆植株图片。
图4为田间试验中AH-5处理组与清水对照组120天豌豆植株图片。
图5为田间试验中AH-5处理组与清水对照组120天豌豆根系图片。
具体实施方式
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术。本发明所用试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
实施例1：
AH-5菌株的分离及鉴定
1.1AH-5菌株的分离
申请人从中国安徽省土壤土样中分离、筛选得到一株对根结线虫具有较强防治效果的菌株，将其命名为AH-5。本发明的AH-5菌株的分离和纯化采用稀释涂布平板法、平板划线法、生物测定法等方法。
1.2菌株的鉴定
1.2.1菌株的形态学鉴定
通过观察菌落的颜色、形态、边缘、透明度、光泽度、培养基的颜色等，并通过革兰氏染色观察个体形态特征。
将AH-5菌株在牛肉膏蛋白胨培养基平板上划线培养，从图1中可以看到：AH-5菌落浅黄色、半透明、菌落凸起、无光泽、边缘略整齐，无色素产生。镜检发现菌体呈杆状，无芽孢，革兰氏染色呈红色，为阴性菌。
1.2.2菌株生理生化特征检测
采用酶试验、药物敏感试验、氨基酸水解试验、6.5％NaCl生长耐受试验、产H2S试验、尿素水解试验等生理生化实验测定。
AH-5部分生理生化实验结果如表1。结果表明，细菌菌株AH-5生理生化特征与无色杆菌属生理生化特征基本相似。
表1 AH-5部分生理生化特征
注：“+”表示阳性，“—”表示阴性。
1.2.3菌株AH-5的分子鉴定
将AH-5无菌操作台中用接种环挑取单菌落于分装好的NA液体培养基中，35℃，180rpm条件下震荡培养12h，并利用细菌鉴定常用的细菌16SrDNA区通用引物：27f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)、1492r(5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)进行菌液PCR扩增。PCR扩增程序为：95℃预变性5min，95℃30s、55℃30s、72℃45s，30个循环，72℃10min，4℃保存。PCR反应产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，检测合格后送生工公司测序。
经测序获得菌株AH-5的16S rDNA序列大小为1437bp(其序列为SEQ ID NO.1所示)，通过Blast分析，选取与之同源性较高的菌株，利用软件MEGA5.20进行系统发育分析、NJ法构建菌株的16S rDNA系统发育树。结果表明AH-5与Achromobacter xylosoxidans聚在一个分支上，同源性为99％，结合菌株形态特征和生理生化实验，将AH-5鉴定为木糖氧化无色杆菌。
该菌株已于2016年9月5日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：Achromobacter xylosoxidans AH-5；保藏编号：CCTCC NO：M 2016458；地址：中国武汉武汉大学。
培养AH-5菌株使用的是NA培养液，其组分及配方如下：蛋白胨5g，葡萄糖2.5g，牛肉膏3g，补充蒸馏水至1000mL，调pH至7.0，在121℃高压蒸汽灭菌30min。
摇瓶发酵参数条件：用挑针挑取细菌单个菌落，接种于装有150mL NA培养液的三角瓶中，35℃，160rpm，摇培72h。将细菌菌液分装入离心管中，8000r/min离心3min，将菌体与上清液分开，上清液过0.22μm的细菌过滤器，收集至另一离心管中。用于实施例2和实施例3。
实施例2：
AH-5菌株发酵上清液对根结线虫卵孵化的影响
24孔板的每孔加入AH-5的上清液700μL，同时每孔中加入100个根结线虫卵与细菌上清液均匀混合，重复三次，设置无菌水为对照；将装有根结线虫卵和AH-5上清液的24孔板放置在25℃恒温箱中，7天后于体式显微镜下观察，计数，并计算根结线虫卵孵化率与相对抑制率。
表2 AH-5发酵上清液对根结线虫卵孵化的影响(7d，25℃)
注：表中字母不同表示差异显著(SPSS 17.0t检验，P≤0.05)
AH-5菌株发酵液对根结线虫卵孵化的结果显示：以ddH2O为对照组的CK在7天后卵的孵化率达到了86.5％，经AH-5发酵液处理的卵孵化率为77.4％，对根结线虫卵的孵化无明显的抑制作用(P≤0.05)，相对抑制率仅为10.5％(表2)，说明AH-5菌株发酵液不能够有效的抑制根结线虫卵的孵化。
实施例3：
AH-5菌株发酵上清液对根结线虫二龄幼虫的影响
24孔板的每孔加入AH-5的上清液700μL，每孔中加入100条根结线虫二龄幼虫与上清液均匀混合，重复三次，同时设置无菌水作为对照参考，将装有根结线虫卵和AH-5上清液的24孔板放置在25℃恒温箱中，分别在12h与24h后于体式显微镜下观察，并记录结果。
表3 AH-5发酵上清液对根结线虫二龄幼虫的影响(25℃)
注：表中字母不同表示差异显著(SPSS 17.0t检验，P≤0.05)
AH-5菌株发酵上清液对根结线虫二龄幼虫的影响的实验结果显示：经过ddH2O处理后12h，24h的二龄幼虫均无死亡，AH-5菌株发酵上清液处理组在处理后12h和24h后，对二龄幼虫致死的死亡率分别为77.9％和92.4％(表3)。实验证明AH-5菌株发酵上清液对根结线虫二龄幼虫致死率具有显著效果(P≤0.05)。
实施例4：
AH-5菌株防治豌豆根结线虫的温室盆栽试验
供试材料和方法：
豌豆：中豌六号
线虫：南方根结线虫Meloidogyne incognita
豌豆种子浸泡7-8个小时后播种于口径为18cm、高为11cm的营养钵中，每营养钵1.5kg无线虫土壤，出苗后每个营养钵留一棵豌豆苗。
AH-5液体发酵培养：发酵培养基为牛肉膏蛋白胨液体培养基(溶剂为水，蛋白胨5g，葡萄糖2.5g，牛肉膏3g，补充蒸馏水至1000mL，调pH至7.0，在121℃高压蒸汽灭菌30min。)。挑取AH-5单菌落接种到装有150mL NA液体培养基的三角瓶中，35℃，160rpm，摇培72h，得到AH-5发酵液。该AH-5发酵液中，AH-5的含量为2×109cfu/mL。
试验设如下两个处理：
AH-5处理组：待豌豆幼苗长出4片真叶后接种南方根结线虫：将孵化的南方根结线虫二龄幼虫配制成100条/mL的线虫悬浮液，取10mL均匀加入在植株根系周围。同时在当天进行发酵液处理，用2×109cfu/mL的AH-5发酵液10mL灌根处理豌豆幼苗。实验设3次重复，每个重复处理8株豌豆幼苗。然后放置在温室中进行培养。培养30天后补施一次发酵液，正常田间管理。
对照组：将AH-5发酵液替换为等量的清水，其它实验操作与AH-5处理组相同。
病害调查：分别距离第一次施药40d和60d进行病害调查，拍照记录。①豌豆生长情况的调查：测量并统计株高、地上部分鲜重(不含果实)、根部长度、根部鲜重等数据。②豌豆根结线虫病发病情况调查：将豌豆植株的根剪下，将每组各处理的根收集在一起，剪碎并在榨汁机中打浆2次，第1次10s，第2次20s，先后用200目、325目的筛子过滤，蒸馏水冲洗筛子，收集留在325目筛子上的线虫和卵；各处理每组各取1mL的悬液，置于自制的双层玻片中观察，对其中的根结线虫与根结线虫卵进行计数，并计算每棵豌豆根部中根结线虫和根结线虫卵的数量。
防治效果＝(对照组根结数—处理组根结数)/对照组根结数×100％
表4 AH-5发酵液对豌豆生长情况的影响(40d)
注：表中字母不同表示差异显著(SPSS 17.0t检验，P≤0.05)
表5 AH-5发酵液对豌豆生长情况的影响(60d)
注：表中字母不同表示差异显著(SPSS 17.0t检验，P≤0.05)
豌豆生长情况的调查结果表明：在第一次药剂处理后40天进行豌豆幼苗的生长指标测定，发现豌豆株高、地上部分鲜重、根长经AH-5发酵液处理后相对清水处理组CK在0.05水平上具有显著性差异，但是AH-5处理组的根重与CK组无显著性差异(表4)；在60天时对豌豆幼苗生长指标进行统计分析时发现AH-5处理组的株高、地上部分鲜重均高于与CK组，并且在0.05水平上存在显著性差异，而AH-5组的根长、根重指标高于CK组，但在0.05水平上无显著性差异(表5)。实验证明AH-5发酵液在豌豆生长有显著地促进作用。
表6盆栽试验中AH-5对根结线虫的防治效果(40d)
注：表中字母不同表示差异显著(SPSS 17.0t检验，P≤0.05)
表7盆栽试验中AH-5对根结线虫的防治效果(60d)
注：表中字母不同表示差异显著(SPSS 17.0t检验，P≤0.05)
AH-5发酵液对根结线虫的防治效果证明：AH-5液体发酵培养物在没有任何助剂填加的条件下，施用2次，40天时对豌豆根结线虫病防效达72.29％(表6)，60天后对豌豆根结线虫病防效仍达41.75％(表7)。经AH-5处理后的豌豆苗根系发达，根结少，植株生长正常，未发现明显的药害，对豌豆安全，具有良好的应用价值，该浓度已经达到产业化开发利用的浓度要求。
实施例5：
AH-5菌株防治豌豆根结线虫的田间试验
供试材料和方法：
豌豆：中豌六号
线虫：南方根结线虫Meloidogyne incognita
豌豆种子播种于线虫病害较为严重的温室大棚，每陇3行，每行6穴。出苗10d后间苗，每穴留一株豌豆幼苗。
AH-5液体发酵培养：发酵培养基为牛肉膏蛋白胨液体培养基(溶剂为水，蛋白胨5g，葡萄糖2.5g，牛肉膏3g，补充蒸馏水至1000mL，调pH至7.0，在121℃高压蒸汽灭菌30min)。挑取AH-5单菌落接种到装有150mL NA液体培养基的三角瓶中，35℃，160rpm，摇培72h，得到AH-5发酵液。该AH-5发酵液中，AH-5的含量为2×109cfu/mL。
实验设如下两个处理：
AH-5处理组：播种豌豆种子30d后，进行药剂处理，用109cfu/mL的AH-5发酵液10mL灌根处理豌豆幼苗。1陇即一个重复，每陇共18株豌豆，实验设3次重复，每个重复处理1陇豌豆幼苗，保持正常田间管理。
清水对照组(CK)：将AH-5发酵液替换为等量的清水，其它实验操作与AH-5处理组相同。病害调查：120d后，对豌豆生长情况和发病状况进行调查和拍照记录，并进行数据统计分析。①豌豆生长情况的调查：测量并统计株高、地上部分鲜重(含果实)、根部长度、根部鲜重等数据。②豌豆根结线虫病发病情况调查：将豌豆根系用清水轻轻冲洗干净后，观察根系发病情况，对病害进行分级。
0级：无根结；
1级：有少数根结，占全根系1％-25％；
2级：根系根结数量中等，占全根系的26％-50％；
3级：根系根结数量多，占全根的51％-75％；
4级：根系根结数量很多，占全根系76％-100％
防治效果＝(对照组根结级数—处理组根结级数)/对照组根结级数×100％
表8田间试验中AH-5发酵液对豌豆地上部分生长的影响(120d)
注：表中字母不同表示差异显著(SPSS 17.0t检验，P≤0.05)
豌豆地上部分生长情况的调查证明：通过调查120d后豌豆植株的生理指标发现，AH-5处理组豌豆植株的地上部分鲜重(含果实)为37.00g、株高为41.95mm、单株豆荚数为1.53个、单株豆荚重为2.10g，而CK组的地上部分鲜重(含果实)为21.34g、株高为32.11mm、单株豆荚数为1.13个、单株豆荚重为1.64g。数据统计分析发现，AH-5处理组的各项生长指标均明显高于清水处理组(CK)，并且在0.05水平上存在显著性差异(表8)，也证明AH-5发酵液在豌豆生长有显著地促进作用。
表9 AH-5发酵液对豌豆根结线虫的田间防治效果(120d)
注：表中字母不同表示差异显著(SPSS 17.0t检验，P≤0.05)
AH-5发酵液对豌豆根结线虫的田间防治效果证明：120d后对豌豆地下部分鲜重和根长测量统计，并对根结进行病害分级，并进行数据统计分析发现，AH-5处理组的地下部分鲜重为1.31g高于CK组的0.77g，并且在0.05水平上存在显著性差异；AH-5处理组的单株根结病害级数仅为0.73，相对于CK组的1.30也显著下降，AH-5发酵液对于豌豆根结线虫的防治效果可达到43.59％(表9)。经AH-5处理后的豌豆苗根系发达，根结少，植株生长正常，未发现明显的药害(图4，图5)，对豌豆安全，具有良好的应用价值。
SEQUENCE LISTING
<110> 华中农业大学
<120> 一株防治植物根结线虫的木糖氧化无色杆菌及其应用
<130> 一株防治植物根结线虫的木糖氧化无色杆菌及其应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 1437
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tcccaatgcg gagcttacac atgcagtcga acggcagcac ggacttcggt ctggtggcga 60
gtggcgaacg ggtgagtaat gtatcggaac gtgcccagta gcgggggata actacgcgaa 120
agcgtagcta ataccgcata cgccctacgg gggaaagcag gggatcgcaa gaccttgcac 180
tattggagcg gccgatatcg gattagctag ttggtggggt aacggctcac caaggcgacg 240
atccgtagct ggtttgagag gacgaccagc cacactggga ctgagacacg gcccagactc 300
ctacgggagg cagcagtggg gaattttgga caatggggga aaccctgatc cagccatccc 360
gcgtgtgcga tgaaggcctt cgggttgtaa agcacttttg gcaggaaaga aacgtcgtgg 420
gttaataccc cgcgaaactg acggtacctg cagaataagc accggctaac tacgtgccag 480
cagccgcggt aatacgtagg gtgcaagcgt taatcggaat tactgggcgt aaagcgtgcg 540
caggcggttc ggaaagaaag atgtgaaatc ccagagctta actttggaac tgcattttta 600
actaccgggc tagagtgtgt cagagggagg tggaattccg cgtgtagcag tgaaatgcgt 660
agatatgcgg aggaacaccg atggcgaagg cagcctcctg ggataacact gacgctcatg 720
cacgaaagcg tggggagcaa acaggattag ataccctggt agtccacgcc ctaaacgatg 780
tcaactagct gttggggcct tcgggccttg gtagcgcagc taacgcgtga agttgaccgc 840
ctggggagta cggtcgcaag attaaaactc aaaggaattg acggggaccc gcacaagcgg 900
tggatgatgt ggattaattc gatgcaacgc gaaaaacctt acctaccctt gacatgtctg 960
gaatgccgaa gagatttggt agtgctcgca agagaaccgg aacacaggtg ctgcatggct 1020
gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttgtca 1080
ttagttgcta cgaaagggca ctctaatgag actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg 1140
gatgacgtca agtcctcatg gcccttatgg gtagggcttc acacgtcata caatggtcgg 1200
gacagagggt cgccaacccg cgagggggag ccaatcccag aaacccgatc gtagtccgga 1260
tcgcagtctg caactcgact gcgtgaagtc ggaatcgcta gtaatcgcgg atcagcatgt 1320
cgcggtgaat acgttcccgg gtcttgtaca caccgcccgt cacaccatgg gagtgggttt 1380
taccagaagt agttagccta accgcaaggg gggcgatacc acgtagaatc agggtct 1437

Claims (7)

1.一种分离的木糖氧化无色杆菌，其特征在于：所述的木糖氧化无色杆菌为Achromobacter xylosoxidans AH-5；保藏编号为：CCTCC NO:M 2016458。
2.权利要求1所述的木糖氧化无色杆菌的发酵上清液。
3.权利要求2所述的发酵上清液在制备防治根结线虫制剂中的应用。
4.权利要求1所述的木糖氧化无色杆菌在制备防治根结线虫制剂中的应用。
5.权利要求1所述的木糖氧化无色杆菌在制备植物促生剂中的应用。
6.权利要求1所述的木糖氧化无色杆菌在制备同时促进植物生长和防治根结线虫制剂中的应用。
7.根据权利要求5或6所述的应用，所述的植物为豌豆。
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