CN1373633A - 一种改进的培养海藻的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种改进的培养海藻的方法,包括培育一种快速生长的变种,该变种克服了在聚乙烯袋中产量降低的不足,并且得到的生物量与在无袋的开放培养基中生长得到的生物量相近。而且,从组织培养发育的植株中得到的半提纯角叉菜胶产量和质量与对照亲本植株相似。还提供了通过着色愈伤组织细胞进行体细胞胚胎发生大规模克隆繁殖小无性芽的方法。

Description

一种改进的培养海藻的方法
发明领域
本发明涉及一种改进的藻类培养方法，本发明涉及大型植物多细胞海藻(seaweed)领域，尤其是海上养殖海藻。
发明背景
海藻被认为是重要的藻胶来源，例如琼脂，角叉菜胶和藻酸盐。琼脂和角叉菜胶是某些红藻细胞壁中存在的结构多糖，而藻酸盐则来源于某些褐藻。藻胶广泛应用于各种工业，作为乳化剂，胶凝剂，稳定剂，增稠剂以及悬浮剂，所以被认为是海藻的增值产品。传统上，藻胶通过来源于自然界的原材料提取得到。但是，随着海藻利用的不断增长，已不可能从自然界中获得足够的原材料，所以逐渐成功的开发出各种有效的培养技术以及对菌株的栽培及挑选技术。
现有技术参考
J.R.Waaland(Proc.of the Intl.Seaweed Symp.9.241-247，1979)在他的研究中试图通过收集自不同试验箱培养物种群的野生植物，比较其生长率，从gigartina exasparata中挑选出快速生长菌株。接下来，从皱波角叉菜，Gracilaria tikvahiae，口蓠等种群中挑选出生长和藻胶产量都具备优秀潜力的菌株(D.P Cheney等，Proc.of the Intl.Seaweed Symp.10，559-567，1981；J，H Ryther等，Proc.of the Intl.Seaweed Symp.9，1-16，1979；I.Levy和M.Friedlander，Botanica Marina，33，339-345，1990)。这些菌株最大的缺点是缺乏其表现预见性，因为选择是基于特定环境下，因此，最适的表现与选择进行的环境密切相关，并且，即使这种选择是成功的，也只能得到增值的收益。
G.C.Trono，(Seaweed Cultivation and Marine Ranching，M.Ohno和A.T.Critchley，(eds.)，JICA Publication，Japan，75-88，1993)已经讲述了麒麟菜和Kappaphycus的分类与培养，并说明栽培者确实在野外的农田环境下进行了初选，即从收获中筛选出最优等的植物作为原材料来种植下一季作物。培养这种菌株最主要的缺点是由于它缺乏对农田环境下季节变化的适应性导致的产量不稳定。
C.J Dawes和E.W.Koch(J.Appl.Phycology，3，247-257，1991)以及C.J.Dawes，G..C.Trono和A.0.Lluisma(Hydrobiologia，260/261，379-383，1993)尝试通过微量繁殖和组织培养找到一种合适的方法来维持和繁殖所选择出的麒麟菜各种培育品种克隆，他们的研究重点在于建立合适的实验室培养技术，通过微小的植物碎片来克隆繁殖种植的麒麟菜。这种使用小插条的繁殖主要缺点是后代只具备亲本的特征，而在目的特征的表达上并没有明显优于亲本。
D.P.Cheney，Wang和Le Zhong在美国专利No.5,585,544，1996中公开了一种使耳突麒麟菜和刺麒麟菜体细胞杂交的方法，通过在营养液中培养两个非常相近种的海藻体细胞，然后分离出具有更可取终产物特征的杂交体细胞苗。这种藻类体细胞杂交的主要不足在于目前该方法只能使后代从亲本中继承已有的特性而不能导入新的特性。
已有几篇关于商业种植和培养Kappaphycus和麒麟菜的文章发表(J.R.Lim和J.Porse.Proc.of the Intl.Seaweed Symp.10，601-606，1981；H.Adnan和H.Porse，Hydrobiologia，151/152，355-358，1987；R.Azanza-Corrales and P.Sa-a，Hydrobiologia，204/205，521-525，1990；G.P.B.Samonte，A.Q.Hurtado-ponce and R.Caturao，Aquaculture，110，1-11，1993)。G.C.Trono(Seaweed Cultivation and Marine Ranching，M.Ohno和A.T.Critchley(eds.)，JICA Publication，Japan，75-88，1993)，其中公开了两种类型培养方法，例如固定离底单线方法和漂浮筏或长线方法，该方法已在全球范围内被接受为麒麟菜的培养方法，在这两种方法中，挑选出的带有丰富分枝的麒麟菜尖端插条(5-100g)以25-30cm的间隔使用软塑料材料系在培养绳上使其生长(在菲律宾被称为节-节方法)，等生长到一千克或更多时收获海藻。根据其生长率每60-90天收获一次作物。不论单线方法还是流动阀或长线方法都存在几个局限和不足，分别是：(i)无性芽/种子物质被食草动物所食，这些食草动物可能吃掉全部的材料，这样就影响了后续的作物收成，(ii)由于植物未加保护，它们可能因为恶劣的海洋条件从培养绳上被冲走，(iii)在恶劣海洋环境生长过程中，附生植物和外来颗粒的沉积需要累赘又费时的清洗工作以确保终产物的质量。
O.P.Mairh等人(Indian J.Marine Sciences，24，24-31，1995)成功的表明养殖场条件下在实验规模袋装培养异枝麒麟菜的可行性。但是，该方法的主要不足在于，与在没有聚乙烯袋子的开放性水环境中生长相比，该方法的日生长率有所降低。本发明克服了在袋子中生长微弱的不足，通过对传统的海藻进行体外组织培养技术，开发出了一种快速生长的菌株，该菌株在袋中展现出与亲本植物在开放的水环境中差不多相同的生长潜力。
发明目的
本发明的主要目的是提供一种改进的培养藻类的方法，尤其是麒麟菜，该方法克服了上述的不足。
本发明的另一目的是通过组织培养形成一种麒麟菜快速生长品种。
本发明还提供一种方法，该方法使克隆生产大量繁殖体(幼苗材料)用于大规模培养重要的海藻成为可能。
附图说明
以下是附图说明；
图1是本发明中所述麒麟菜带有愈伤组织的外植体。
图2是外植体分离出的麒麟菜愈伤组织再次培养中旺盛的生长。
图3显示分离出的愈伤组织上球形或椭圆形微小无性芽。
图4是本发明培养快速生长菌株方法的一个具体实施方案中所述由微小无性芽生长得到的幼无性芽。
图5是从无性芽传代得到的麒麟菜多分枝幼胚。
图6是本发明生产大量种子方法的一个实施方案中所述愈伤组织体细胞胚胎在体外的发育。
图7是改进的培养方法一个实施例中聚乙烯袋中的麒麟菜漂浮长线培养体系。
图8显示对照亲本植株和组织培养得到的海藻生长比较。
发明详述
相应的，本发明提供一种培养海藻的组织培养方法，所述方法包括以下步骤：
a)建立用于组织培养的无污染可生长海藻材料，依次用带有家用液体去污剂，聚乙烯吡咯酮碘(povidine iodine)的无菌海水处理海藻材料，最后在含有广谱抗生素混合物和杀真菌剂的Provasoli浓缩海水培养基(PES)中温育处理过的材料24到96个小时，然后用无菌海水彻底清洗，去除痕量的抗生素和杀真菌剂，再与无菌滤纸印记，得到无菌的外植体；
b)在温度20-25℃，20-50μmol光量子m-2s-1辐射量的冷白荧光下和12∶12黑白循环，PES加强的琼脂板上培养无菌的外植体，诱导愈伤组织；
c)至少40天后，从外植体分离出愈伤组织，在40-60μmole光量子m-2s-1辐射量的冷白荧光和12∶12黑白循环下在新鲜琼脂板上传代培养愈伤组织，得到分化的深着色的椭圆形或球形小无性芽；
d)在PES培养基琼脂板中在40-60μmole光量子m-2s-1辐射量的冷白荧光和12∶12黑白循环下，传代培养着色愈伤组织薄片约20-40天，使得着色丝状愈伤组织中的体细胞胚胎发生和小无性芽的形成都得到了提高；
e)将带有体细胞胚胎的丝状愈伤组织转入液体PES培养基在振动条件下培养，使其进行形态发生并从无性芽发展成带有多枝的幼胚；以及
f)在封装的穿孔聚乙烯袋中培养幼胚，大规模培养海藻。
在一个实施方案中，所用外植体是从海藻上部取下的长1-6mm，直径3-4mm的插条。
在另一实施方案中，海藻用1-5％含青霉素，链霉素硫酸盐，卡那霉素，制霉菌素和新霉素在100ml蒸馏水中的抗生素混合物的PES培养基处理。
在另一实施方案中，无菌的外植体在20-25℃，20-30μmole光量子m-2s-1辐射量的冷白荧光和12∶12黑白循环下，在PES加强的含有0.8-3％琼脂的琼脂板中培养。
在另一实施方案中，通过培养在20-25℃，20-50μmole光量子m-2s-1辐射量的冷白荧光和12∶12黑白循环下，在PES培养基制成的且以包埋培养物形式存在于含有0.3-0.6％琼脂的琼脂板中的着色愈伤组织的薄片，传代培养愈伤组织，在每个包埋块上得到丰富分枝的丝状着色愈伤组织。
在一个实施方案中，所用植物生长调节因子选自0.1-1.0mg/l萘乙酸和0.1mg l-1萘乙酸和6-苄氨基嘌呤。
在另一实施方案中，无菌的外植体是在琼脂板上培养约40-45天。
在另一实施方案中，顶部的插条在附着到海中长漂浮线上的聚乙烯袋中生长，经过大约60天将其收获。
在另一实施方案中，幼胚在穿孔的袋中培养，年海水温度范围22.5℃-28.5℃，pH范围7.81-8.26，盐度范围24.0％-34.0％，溶解氧范围7.84ml/l-15.68ml/l，磷酸盐范围0.02μmol-3.23μmol，硝酸盐范围0.15μmol-2.58μmol，亚硝酸盐范围0.01μmol-0.85μmol。
在另一实施方案中，小无性芽是通过着色丝状愈伤组织体细胞胚胎发生克隆繁殖。
在另一实施方案中，在海中幼胚在附着在漂浮长线上的浸没的带孔透明聚乙烯袋中保护性培养物中生长至少60天。
在另一实施方案中，着色愈伤组织体细胞胚胎发生得到的体细胞胚胎形成方法通过加入植物生长调节因子，如a-萘乙酸和6-苄氨基嘌呤，进一步得到提高。
在另一实施方案中，至少60天的收获期可得到更高生物量，或者缩短培养期而生物产量仍可如常得到。
本发明提供一种改进的海藻培养方法，包括一种培育麒麟菜种植后代的快速生长变种的方法，通过组织培养，克服在袋中微弱生长的不足，其中组织培养所用无菌可生长海藻材料是这样得到的：用0.1-1％家用液体去污剂处理选出的植物材料(5-20min)，然后用0.1-2％聚乙烯吡咯酮碘(povidine iodine)(0.5％重量/体积有效碘)处理2-7min，最后在含有1-5％抗生素混合物(青霉素G-1g，链霉素硫酸盐-2g，卡那霉素-1g，制霉菌素-25mg和新霉素-200mg在100ml蒸馏水中)的PES培养基中处理24-96小时，在20-25℃，20-50μmole光量子m-2s-1辐射量的冷白荧光和12∶12黑白循环下在PES培养基加强的琼脂板上(0.8-3％琼脂)培养的无菌的麒麟菜外植体(5-6mm长，优选植物末梢插条)显示愈伤组织的诱导，该愈伤组织在没有外植体的传代培养中得到深着色椭圆形或球形小无性芽，通过培养作为3mm厚度PES培养基琼脂板(0.3-0.6％琼脂)中包埋培养物的着色愈伤组织(2mm×3mm×2mm)薄片其产量被进一步提高，但是，在琼脂培养基中加入植物生长调节因子尤其是0.1-1.0mg l-1的萘乙酸或0.1mg l-1萘乙酸和6-苄氨基嘌呤，进一步提高了着色丝状愈伤组织的体细胞胚胎发生和小无性芽的形成，并且将这些带有体细胞胚胎的愈伤组织物质转入液体PES培养基，在振动条件下促进形态发生和无性芽发展成幼胚的过程，幼胚在野外培养中展示出优等的生长，较对照亲本植物增长2倍多生物量，并且兼顾了海藻提炼到角叉菜胶的产量与质量，而且同时提出了改善的漂浮长线培养方法，其中100g鲜重麒麟菜顶端的插条(优选带有分枝的)在封闭的两面都带有3排(每排带有等距的12个孔)，间隔14cm的4mm直径孔的透明聚乙烯袋(450guage；60cm×45cm)中培养，在海中60天生长期后，组织培养后代得到1590°37.4g.鲜重(4.6％日生长率)，对照亲本植物得到846.66°37.9g.鲜重(3.5％日生长率)。
在一个实施方案中，组织培养所用无菌可生长植物材料的制备工艺是这样建立的：用0.1-1％家用液体去污剂处理选出的植物材料(5-20min)，然后用0.1-2％聚乙烯吡咯酮碘(0.5％重量/体积有效碘)处理2-7min，最后在含有1-5％抗生素混合物(青霉素G-1g，链霉素硫酸盐-2g，卡那霉素-1g，制霉菌素-25mg和新霉素-200mg在100ml蒸馏水中)的PES培养基中培养24-96h。为确定上述材料无菌，将其转入Zobell 2216E琼脂板，22-23℃培养箱中培养2星期。
在另一实施方案中，通过组织培养培育种植麒麟菜快速生长变种。20-25℃，20-50m mole光量子m-2s-1辐射量的冷白荧光下和12∶12黑白循环，生长于Provasoli浓缩海水(PES)培养基增强的琼脂板(0.8-3.0％琼脂)上的无菌外植体中，发现愈伤组织的诱导是可生长的。经过40天，从外植体分离出增殖的愈伤组织，分别在新鲜的琼脂培养基上如上所述传代培养。经过40天的生长，有些琼脂板上传代培养的愈伤组织进行分化，并产生了深着色的球形或椭圆形小无性芽(2-5mm直径)，这些小无性芽转至液体PES培养基后长成麒麟菜幼胚。对土壤培养的许多克隆植物进行重复的检测，显示这些植物中有相当大的比例(＞90％)不仅存活而且展示了高于对照亲本植物的生长能力。
在另一实施方案中，说明了通过着色愈伤组织细胞的体细胞胚胎发生在体外克隆生产并繁殖小无性芽。为提高小无性芽的产量，传代培养的着色愈伤组织被分割成若干薄块(2mm×3mm×2mm)，20-25℃，20-50μmole光量子m-2s-1辐射量的冷白荧光下和12∶12黑白循环，在琼脂板(0.3-0.6％)中作为包埋培养物生长，在第一个三周时间内，每个包埋块都可看到旺盛的分枝丝状着色愈伤组织，然后，在一些丝上分枝的暗灰色部分可观察到与体细胞胚胎相似的深着色小菌落的再生。将带有体细胞胚胎的这种丝状愈伤组织转移至液体浓缩海水培养基(PES)，促进小无性芽的快速生长和形态发生。
在另一实施方案中，通过向琼脂培养基中加入植物生长调节因子尤其是0.1-1.0mg l-1的萘乙酸或0.1mg l-1萘乙酸和6-苯甲基氨基嘌呤，着色丝状愈伤组织上体细胞胚胎的形成过程被进一步提高。
在另一实施方案中，起始植株，优选大约100g鲜重的多分枝的顶部插条，套在穿孔的透明聚乙烯袋(450gauge，60cm×45cm)中，将袋子附着于海中漂浮长线上，使植株生长。在一年中插条如上所述，在保护性袋中生长，每60-75天收获一次。30天内插条可达到394.6°20.8g.鲜重(4.7％日生长率)产量，60天的培养期可达到846.66°37.9g.鲜重(3.5％日生长率)的产量。
在另一实施方案中，采用袋培养方法比较本发明中快速生长菌株和对照亲本植株在野外条件下的产量。60天内快速生长的变种产量达到了1590°37g(4.6％日生长率)，对照亲本植株产量为846°38g.(3.6％日生长率)，而其在开放的水环境下培养产量1726g.(4.7％日生长率)。
以下详述一种改进的海藻培养方法中的创造性技术，包括培育组织培养所用的快速生长变种，通过体细胞胚胎发生大量生产和繁殖小无性芽(种子)，以用一种海洋大型海藻的改进培养方法。目的海藻生物应该是光合的并且对不同的海洋环境条件具有耐受性。适用于本发明的藻类是非丝状的结构复杂的海洋红藻和褐藻，它们是具有直立或倒伏习性的软骨菌体，并且由圆柱形的或扁平的枝条构成且产量很大。合适的海藻可以从红藻中选择，优选gigartinales目，其中更优选麒麟菜属，例如异枝麒麟菜，耳突麒麟菜，E.denticulatum，刺麒麟菜，E.alvarazii和E.procrusteanum；杉藻属，例如小杉藻，G..exasparata；和角叉菜属，例如皱波角叉菜。褐藻门合适的属为海带属，裙带菜属，昆布属，羽叶藻属，巨藻属，马尾藻属和喇叭藻属。
为得到无菌的材料，选出的植物材料在高压灭菌过的含有0.1-1％家用液体去污剂的过滤海水(无菌海水)处理(5-20min)，然后用0.1-2％聚乙烯吡咯酮碘(0.5％重量/体积有效碘)处理2-7min，最后在含有1-5％抗生素混合物(青霉素G-1g，链霉素硫酸盐-2g，卡那霉素-1g，制霉菌素-25mg和新霉素-200mg在100ml蒸馏水中)的PES培养基中，20-25℃，25-30μmole光量子m-2s-1辐射量的冷白荧光下，12∶12黑白循环培养24-96h。但是，经过了0.1％液体去污剂，1％聚乙烯吡咯酮碘(povidine iodine)和3％广谱抗生素两天时间的处理后，植物材料已经无菌，在Zobell培养基上即使经过3周的培养，也未显示出有细菌生长。
建立了无菌材料的制备过程后，20-25℃，在20-50μmole光量子m-2s-1辐射量的冷白荧光下，12∶12黑白循环，在PES培养基加强的琼脂板(0.8-3％琼脂)上培养麒麟菜外植体(长5mm插条，优选植株的末端部分)一个月。在培养的最初两周内可以观察到愈伤组织的诱导。40天后，增殖的丝状分枝愈伤组织从外植体中分割出来，分别在新鲜的琼脂板上，除光照增加到50μmol光量子m-2s-1辐射量外，其它条件相似，进行传代培养，诱导愈伤组织的形态发生和分化。经过约40-50天琼脂板培养后，一些传代培养的愈伤组织的确经过形态发生而产生了深着色的球形或椭圆形小无性芽(2-5mm直径)，将其转移至液体PES培养基中发育成麒麟菜幼胚。将其转移至Thoniturai(Gulf of Mannar，India)的试验培养区，重复检测这些植物在野外的可生长性及成长表现。上述所有被检测植物在野外始终如一的显示出低死亡率，还有几株在相同的培养期内，鲜重高于对照亲本植物2倍多。这种趋势甚至以可忽略的变化持续到第三代海藻。
通过着色愈伤组织体细胞胚胎发生克隆产生小无性芽的方法已经建立。体细胞胚胎发生和小无性芽产量可以，通过在3mm厚度PES培养基琼脂板(0.3-0.6％琼脂)中作为包埋培养物传代培养着色丝状愈伤组织薄块(2mm×3mm×2mm)进一步被提高。植入到琼脂培养基中的愈伤组织块在一个月内快速生长，在琼脂培养基中形成了带有大量生长分枝丝状着色愈伤组织的色斑。外植块上新再生的丝状愈伤组织最后转化发展成深着色(暗灰色)小菌落，与一些丝上分枝的体细胞胚胎相似。在琼脂培养基中加入植物生长调节因子尤其是0.1-1.0mg l-1的萘乙酸或0.1mg l-1萘乙酸和6-苯甲基氨基嘌呤，进一步提高体细胞胚胎发生。将这种带有体细胞胚胎的丝状愈伤组织从固体(琼脂板)培养基转移到液体PES培养基中，促进其快速生长和小无性芽的形态发生。
在本发明中，选出的麒麟菜插条，优选带有分枝的，作为种子材料，在完全封闭的保护袋中生长，优选带孔(直径4mm)透明袋，这些透明袋允许光线渗透以及维持生长所需的海水循环，同时，排除了这些材料被进食以及沉积外来颗粒的可能性。而袋子的表面沉积了外来颗粒，可以每周或必要时清洗。在培养过程中，种植区的年海水温度范围22.5℃-28.5℃，pH范围7.81-8.26，盐度范围24.0％-34.0％，溶解氧范围7.84ml/l-15.68ml/l，磷酸盐范围0.02μmol-3.23μmol，硝酸盐范围0.15μmol-2.58μmol，亚硝酸盐范围0.01μmol-0.85μmol。经过60天的培养期，100g鲜重起始种子材料，组织培养培育植株可达到1590°37.4g.鲜重产量，对照亲本得到846.66°37.9g.鲜重的产量。
本发明首次揭示在体外条件下快速生长菌株的制备方法，以及通过结构复杂的红藻着色愈伤组织体细胞胚胎发生来大规模克隆得到小无性芽的方法。早期对海藻的组织培养研究显示通过转移愈伤组织到液体培养基中得到整株的从头再生。但是在本发明中，首次成功地在琼脂板上生产了由少至3个多至几百个细胞构成的像着色小菌落一样的体细胞胚胎。我们发现在昏暗光条件下的琼脂板上着色小菌落可理想地经过延长的期限直到需要时仍保持存活。在相似的条件下，组织培养的植株日生长量已几次显示高于对照亲本植株40％的增长，60天期限末时，这种增长已达到较于对照2倍的生物量，而对照的产量与在开放的水环境条件下所得相似。这种从干燥的组织培养培育植株中半提纯的角叉菜胶产量为43％，凝胶力为540g.cm-2，而对照的产量为43％，角叉菜胶凝胶力为550g.cm-2。本发明中改进的步骤为(i)发展一种制备洁净无菌的组织培养所用植物材料的方法，(ii)发展一种通过着色愈伤组织的小无性芽制备快速生长变种的方法，使其具有2倍增加的生长量而不影响角叉菜胶的产量和质量，(iii)在体外克隆繁殖小无性芽，通过将着色愈伤组织作为包埋培养物在琼脂板中培养，使其进行体细胞胚胎发生，(iv)利用植物生长调节因子如萘乙酸和6-苯甲基氨基嘌呤促进着色愈伤组织中体细胞胚胎发生的形成过程，以及(v)在放入封套的带孔透明塑料袋中培养海藻，袋子可以防止海藻被进食以及得到纯净的原材料，没有污染物影响终产物。
下述实施例是具体说明本发明，本发明保护范围并不局限于下述实施例。
更明确地，本改进了的培养方法包括一种具有改进特性--即快速生长--的克隆方法，通过组织培养和使用带小孔的透明聚乙烯袋长线流动培养方法，袋子防止海藻被食草动物所食以及得到纯净的原材料，没有污染物影响终产物kappa角叉菜胶。
这种改进的培养方法主要用法/用途包括以下：(i)通过组织培养制备具有快速生长的改进特性的体细胞克隆方法，(ii)通过愈伤组织细胞的体细胞胚胎发生在体外克隆繁殖海藻，(iii)通过愈伤组织培养物在体外的体细胞胚胎发生，大规模的生产和提供统一的实用性种植海藻所用种子(小无性芽)，(iv)开发愈伤组织作为长期种质储存来源，以及(v)使用带小孔的透明聚乙烯袋进行培养，防止海藻被食草动物所食以及得到纯净的原材料，没有污染物影响终产物k--角叉菜胶。
实施例1
无菌外植体的制备：为得到用于组织培养所用无菌的，可生长的，单种藻的海藻材料，从培养区选择出异枝麒麟菜(＝kappaphycus alvarezii)菌体，从其上选出大约5cm长度的片段(靠近顶部，4-5mm直径的茎)。实验前，应在在充气烧瓶中PES浓缩海水培养基中，在20μmol光量子m-2s-1辐射量的冷白荧光下，12∶12黑白循环，生长10天，使其适应实验条件。在适应期间，烧瓶中的培养基以5天间隔共补充两次。适应后，首先，在高压灭菌的过滤海水(无菌海水)中，在显微镜下用刷子彻底清洗片段，去除表面的污染物，然后依次在灭菌过的含有0.1％家用液体去污剂的海水中处理10min，1％聚乙烯吡咯酮碘(有效碘0.5％w/v)处理2min，最后在含有3％的过滤无菌广谱抗生素混合物(青霉素G-1g，链霉素硫酸盐-2g，卡那霉素-1g，制霉菌素-25mg和新霉素-200mg在100ml蒸馏水中)的PES培养基中，23℃，在25μmol光量子m-2s-1辐射量的冷白荧光下，12∶12黑白循环，培养48h。每一步骤中，在将要进行的处理之前，海藻块用无菌海水冲洗以避免化合物的交叉污染。上述所有的操作，除材料在抗生素中的培育外，都在Bioclean工作台上进行。经过上述处理的植物材料成为无污染的，即使在Zobell琼脂板上生长2周也没有显示微生物生长。
实施例2
无菌外植体的愈伤组织诱导：在经过实施例1中所述方法得到的无菌材料中进行愈伤组织的诱导。首先，愈伤组织诱导所用植株材料用灭菌的海水彻底清洗，去除痕量的抗生素，然后切割成长度为5mm的外植体，与无菌滤纸印记去掉水份和切口处流出的粘液，因为即使经过一个月的外植体培养这种粘液仍可能成为微生物污染源。在PES培养基制备的1.5％琼脂板上，23℃，在25μmol光量子m-2s-1辐射量的冷白荧光下，12∶12黑白循环，培养外植体一个月。在最初的2周培养期内可以观察到愈伤组织的诱导。50天后，从植株上分离出繁殖的丝状分枝愈伤组织(图1)，分别在新鲜琼脂板上在相似条件下传代培养，除光照增加到50μmol光量子m-2s-1辐射量，以提高愈伤组织的生长。经过50天琼脂板培养的一些再次传代的愈伤组织(图2)的确经过形态发生，并在愈伤组织各处产生了深着色的直径2-5mm球形或椭圆形小无性芽(图3)，进一步地，在振荡条件下在液体PES培养基中分别培养这些无性芽，使其成长为幼无性芽(图4)，这些幼芽在3周内成长为带有多枝的幼苗(图5)。
实施例3
体细胞胚胎发生和克隆繁殖：通过麒麟菜着色愈伤组织的体细胞胚胎发生来克隆制备小无性芽。体细胞胚胎发生和小无性芽的产生可以通过传代培养着色丝状愈伤组织块(2mm×3mm×2mm)薄片得到提高，这些薄片在23℃，50μmol光量子m-2s-1辐射量的冷白荧光下，12∶12黑白循环，在PES培养基的3mm厚琼脂板中(0.4％琼脂)作为包埋培养物培养。种植在琼脂培养基中的愈伤组织块在一个月内快速生长，在琼脂培养基中形成了带有大量生长分枝丝状着色愈伤组织的色斑。外植块上新再生的丝状愈伤组织最后转化发展成深着色(暗灰色)小菌落，与一些着色丝状愈伤组织分枝上的体细胞胚胎(图6)相似。
实施例4
利用植物生长因子提高体细胞胚胎发生：通过向生长培养基中加入植物生长调节因子如萘乙酸(植物生长素)和6-苯甲基氨基嘌呤(细胞分裂素)提高从麒麟菜着色丝状愈伤组织生产小无性芽的产量。着色愈伤组织块薄片(2mm×3mm×2mm)作为包埋块在含有0.1，1.0mg l-1萘乙酸或0.1mgl-1萘乙酸和6-苯甲基氨基嘌呤的PES培养基制备的3mm厚琼脂板中(0.4％琼脂)培养。所有带有包埋愈伤组织的陪氏培养皿保持在23℃，在50μmol光量子m-2s-1辐射量的冷白荧光下，12∶12黑白循环。种植在琼脂培养基中的愈伤组织块在一个月内快速生长，形成深着色的小菌落，与琼脂培养基中的体细胞胚胎相似。将这些着色愈伤组织从固体(琼脂板)培养基转入液体PES培养基，促进其快速生长以及小无性芽的形态发生。为加速小无性芽的形态发生，优选进行搅拌培养。
实施例5
采用漂浮长线方法培养麒麟菜：首先先建立传统的在开放水环境下漂浮长线方法培养麒麟菜得到的产量数据。在这种方法中，选出的麒麟菜插条，优选带有多分枝的顶尖部分，取约100g鲜重，作为种植用起始种子，以30cm间隔将10份插条直接系在聚丙烯绳(直径8mm长度30米)上，绳子悬挂在底部固定的两根竹竿(约5米长)上。竹竿以1m间隔等距形成点阵。在海水低潮时绳子离地约0.5米，高潮时1.0-1.5。每30天分别称量新鲜植株以检测植株的生长情况，然后根据公式：r＝(Wt/Wo)1/1-1×100计算日生长率，其中r代表以百分比表示的日生长率，Wt是在t天的湿重，Wo是起始湿重。植株在开放性水环境中30天的平均生物量和日生长率分别为450g鲜重和7.3％，60天的主产量和日生长率分别为1726g鲜重和4.7％。
实施例6
采用漂浮长线方法在聚乙烯袋中培养麒麟菜：在这种方法中，选出的麒麟菜插条，优选带有多分枝的顶尖部分，取10份约100g鲜重，作为种植用起始种子，在带孔(海水循环所需)的封闭透明聚乙烯袋(450guage，60cm×45cm)中生长至收获。从袋子开口端留出18cm，以14cm间隔，共3排(每排有等距的12个孔)在两面打孔，每孔直径4mm。这样每个袋子两面共有72个孔(即每面有36个)。袋子用尼龙线缝纫，然后系在漂浮绳上(图7)。总共50个袋子以10cm间隔系在上述绳子上。60天后收获，称重，用实施例5中所述公式计算日生长率。
实施例7
比较研究组织培养后代和亲本植株的生长，角叉菜胶的产率和胶的特性：对组织培养后代长出的野外生长植株和对照亲本植株进行研究，比较其生长(图8)，干海藻重量基础上角叉菜胶(半提纯的)产量，以及角叉菜胶凝胶强度。两种植株各10份实验材料如实施例6中所述，以漂浮长线方法，在封闭透明聚乙烯袋中培养。30天的平均生物量为394.58±20.8g鲜重(4.7％日生长率)，60天的平均生物量为846.6±38g鲜重(3.5％日生长率)，而组织培养植株30天的平均生物量为711.6±13g鲜重(6.8％日生长率)，60的平均生物量为1590±37g鲜重(4.6％日生长率)。半提纯的角叉菜胶含量是这样得到：10g预清洗过的海藻在200ml 8％ KOH溶液中处理1.5h，轻轻倒出滤出液，中和剩余物质，用蒸馏水清洗。然后在40℃使其彻底干燥，称重，计算其产量。凝胶强度通过凝胶强度测试计(Nikkansui，Co.Japan)进行测试，通过在1％KCl溶液中煮沸，制备1％角叉菜胶凝胶。在43％干海藻的基础上，对照亲本植株的产量和小无性芽发育成的植株产量相近。相应的凝胶强度分别为550gcm-2和540gcm-2。
优点
本发明的主要优点是：
1.一种改进亲本植株以得到改进特性如快速生长的新方法。
2.一种大规模从目的菌株快速生产小无性芽(种子材料)的方法。
3.一种在琼脂板上以可生长形式，也就是作为体细胞胚胎储存生殖质的方法。
4.一种改进的培养海藻方法，减少了自然界恶劣条件如强大水流的不良影响，降低了食草动物和附生植物造成的损失，并得到等于或高于亲本植株在开放水中的生长率。
5.一种改进的培养方法，提供了最高纯度材料，没有任何影响终产物质量的污染物。

Claims (17)

1.一种培养海藻的组织培养方法，该方法包括步骤：
a)通过下述步骤建立组织培养所用无菌的可生长海藻材料：依次用含有家用液体去污剂和含有聚乙烯吡咯酮碘(povidine iodine)的无菌海水处理海藻材料，最后在含有广谱抗生素混合物和杀真菌素的Provasoli浓缩海水(PES)培养基中培育24到96小时，再用无菌海水彻底清洗，去除痕量的抗生素和杀真菌素，再与无菌的滤纸印记，得到无菌的外植体；
b)在PES培养基增强的琼脂板上培养无菌外植体，温度范围为20-25℃，在20-50μmol光量子m-2s-1辐射量的冷白荧光下，12∶12黑白循环，诱导愈伤组织；
c)至少40天后，从外植体上分割出愈伤组织，在40-60μmol光量子m-2s-1辐射量的冷白荧光下，12∶12黑白循环，在新鲜琼脂板上传代培养愈伤组织，得到分化的深着色椭圆形或球形小无性芽；
d)在40-60μmol光量子m-2s-1辐射量的冷白荧光下，12∶12黑白循环，在含有植物生长调节剂的PES培养基制成的琼脂板上传代培养深着色愈伤组织薄片约20到40天，在着色丝状愈伤组织中得到增多的体细胞胚胎发生和小无性芽形成；
e)将带有体细胞胚胎的丝状愈伤组织转移至液体PES培养基，振荡条件下培养，使其进行形态发生以及从无性芽发育成带有多枝的幼苗；和
f)通过在封装的带孔聚乙烯袋中培养幼苗大规模培养海藻生物量。
2.权利要求1的方法，其中组织培养所用材料选自海洋红藻和褐藻，包括麒麟菜属、杉藻属、角叉菜属、海带属、裙带菜属、昆布属、羽叶藻属、巨藻属、马尾藻属和喇叭藻属。
3.权利要求1的方法，其中组织培养所用材料选自：异枝麒麟菜、Kappaphycus alvarezzi、耳突麒麟菜、E.denticulatum、刺麒麟菜、E.alvarazii、E.procrusteanum、小杉藻、G.exasparata和皱波角叉菜。
4.权利要求1的方法，其中所用外植体包含取自海藻顶部、且直径为3-4mm，长度为1-6mm的插条。
5.权利要求1的方法，其中海藻材料首先用0.1-1％家用液体去污剂处理5-20分钟，接着用0.1-2％聚乙烯吡咯酮碘处理2-7分钟，最后在含有1-5％抗生素混合物的provasoli浓缩海水中处理04-96小时。
6.权利要求1的方法，其中该抗生素混合物包括青霉素，链霉素硫酸盐，卡那霉素，制霉菌素和新霉素在100ml蒸馏水中。
7.权利要求1的方法，其中无菌外植体在PES培养基增强的含有0.8-3％琼脂的琼脂板上培养，20-25℃，在20-50μmol光量子m-2s-1冷白荧光下，12∶12黑白循环的辐射量。
8.权利要求1的方法，其中愈伤组织的传代培养是通过将着色愈伤组织的薄片作为包埋培养物在含有0.3-0.6％琼脂的由PES培养基制成的琼脂板中生长，20-25℃，在20-50μmol光量子m-2s-1冷白荧光下，12∶12黑白循环的辐射量，在每个包埋块上得到多分枝的丝状着色愈伤组织。
9.权利要求1的方法，其中所用植物生长调节因子选自0.1-1.0mg/l萘乙酸以及各0.1mg l-1的萘乙酸和6-苯甲基氨基嘌呤。
10.权利要求1的方法，其中无菌外植体在琼脂板上培养约40-45天。
11.权利要求1的方法，其中步骤(f)的海藻生物量在附着在海中长漂浮线上的60×45cm聚乙烯袋中培养，并在约60天后收获。
12.权利要求1的方法，其中步骤(f)的幼苗在穿孔聚乙烯袋中培养，年海水温度范围22.5℃-28.5℃，pH范围7.81-8.26，盐度范围24.0％-34.0％，溶解氧范围7.84ml/l-15.68ml/l，磷酸盐范围0.02μmol-3.23μmol，硝酸盐范围0.15μmol-2.58μmol，亚硝酸盐范围0.01μmol-0.85μmol。
13.权利要求1的方法，其中步骤(d)的小无性芽通过着色丝状愈伤组织经过体细胞胚胎发生克隆繁殖。
14.权利要求1的方法，其中步骤(f)的幼苗在附着到漂浮长线上的浸没的带孔透明聚乙烯袋中，在海中保护性的培养物中生长至少60天。
15.权利要求1的方法，其中着色愈伤组织通过体细胞胚胎发生形成体细胞胚胎的过程通过加入植物生长调节因子进一步提高，如a-萘乙酸和6-苯甲基氨基嘌呤。
16.权利要求1的方法，其中至少60天的收获期可产生更高的生物量，或其中缩短培养期仍可维持原生物量。
17.权利要求1的方法，其中通过由着色愈伤组织形成小无性芽，使得在不改变产物产率(角叉菜胶)和凝胶强度的情况下与对照亲本植物相比生长增长两倍(鲜重)。
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