CN102144544B - 一种麒麟菜属海藻原生质体分离培养和再生植株的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种麒麟菜属海藻原生质体分离培养和再生植株的方法，其主要是根据海藻体细胞发育的全能性，利用海藻工具酶分解麒麟菜组织，游离出体细胞原生质体，获得再生细胞壁的体细胞和细胞系，然后将其培养得到再生植株。本发明利用体细胞原生质体直接进行育苗，无须培育麒麟菜生殖成熟的藻体；体细胞原生质体再生细胞壁转化为体细胞，相对于有性生殖育苗技术，无须生殖细胞的有性生殖过程，缩短了育苗周期；并且苗种繁育效率高，适合于大规模育苗生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种藻类培养方法，具体涉及一种麒麟菜属海藻原生质体分离培养和再生植株的方法。
背景技术
麒麟菜属海藻的自然繁育主要是通过四分孢子囊和果孢子囊的方式进行繁育。目前，在麒麟菜属海藻养殖生产中，主要是采用切段再生的方式进行栽培养殖。但由于这种方式占用水体面积大，且夏季藻体因水温过高、降水量大导致盐度过低等环境影响，苗种繁育生产不稳定。另外，麒麟菜属海藻体壁具有较厚的胶质层，无法直接应用电转化等遗传转化技术进行品种的改良。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的是提供一种育苗周期短、苗种繁育效率高的麒麟菜属海藻的培养方法，它能够解决麒麟菜属海藻苗种保种和繁育的问题，可用于生产性育苗。
一种麒麟菜属海藻原生质体分离培养和再生植株的方法，其主要是根据海藻体细胞发育的全能性，利用海藻工具酶分解麒麟菜组织，游离出体细胞原生质体，获得再生细胞壁的体细胞和细胞系，然后将其培养得到再生植株。具体步骤如下：
（1）利用海洋贝类提取纯化制得海藻工具酶，然后加入渗透剂；
（2）将麒麟菜研磨或剪切成细小的组织块或小的分枝，浸没在海藻工具酶溶液中消化，获得麒麟菜体细胞原生质；
（3）将原生质体培养得到再生细胞壁的细胞，进一步培养即可得到再生植株。
所述的海洋贝类为鲍。
所述渗透剂为甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖、KCl、NaCl中的一种。
所述步骤（3）中原生质体的培养条件为：采用PES培养基配成培养液，温度20℃下黑暗培养3-4天，转为光照培养，光照时间为12h/d，光强1500-2000lx，定期更换培养液。
本发明利用体细胞原生质体直接进行育苗，无须培育麒麟菜生殖成熟的藻体；体细胞原生质体再生细胞壁转化为体细胞，相对于有性生殖育苗技术，无须生殖细胞的有性生殖过程，缩短了育苗周期；并且苗种繁育效率高，适合于大规模育苗生产。
附图说明
图1是麒麟菜原生质体的荧光检测图（×10倍）。
图2是麒麟菜原生质体埃文斯蓝染色结果。
其中，箭头1所示为活细胞，染色结果显示亮黄色；箭头2所示为死细胞，染色结果显示深蓝色。
图3是麒麟菜原生质体培养各阶段图。
其中，（a）培养5d；（b）培养15d；（c）培养22d；（d）培养37d。
图4是培养22天时麒麟菜细胞的荧光检测图。
其中，（a）为荧光检测前；（b）为荧光检测后。
具体实施方式
下面结合附图通过具体实施例进一步说明本发明。
本实施例实验材料为麒麟菜（Eucheuma denticulatum）。
1．原生质体分离方法
取1-2克麒麟菜，将其研磨或剪切成细小的组织块或小的分枝，利用海洋贝类（鲍）消化腺提取纯化，按照生物化学纯化蛋白质（酶）的方法制成海藻工具酶，添加2 M 的葡萄糖作为渗透剂，在20-25℃下，将细小的组织块或小的分枝浸没在海藻工具酶溶液中2-3个小时，期间用玻璃棒进行搅拌。用300目筛绢过滤细胞混合液，除去未消化的细胞、细胞团、碎片；取上清液离心，800rpm离心10min，使单细胞（原生质体）下沉，细胞碎片留在上清液中，弃去上清液，用高渗消毒海水（分别含有1mol/L，O.5mol/L葡萄糖）反复冲洗、离心、弃上清液等过程2-3次，即获得较为纯净的麒麟菜体细胞原生质体悬液。
2．原生质体鉴定方法
采用0.1%的荧光增白剂染色法对所得细胞进行了鉴定。首先采用0.1%的荧光增白剂对所得样品进行染色5min，于荧光显微镜镜下观察，激发光波长为370nm紫外光，如图1所示检测显示为红色。这是因为有壁细胞会有蓝绿色荧光显示纤维素存在，原生质体无蓝绿色荧光，其由于叶绿体的存在而发红色荧光，显示无纤维素的存在。
用血球计数板统计原生质体数量，统计不同酶解时间下其产量和平均成活率，见表1和表2。
表1 不同酶解时间下原生质体产量
| 酶解时间（h） | 2.0 | 2.5 | 3.0 |
| 原生质体产量（个/ml） | （29.0±3.3）×104 | （42.1±2.3）×104 | （47.5±1.2）×104 |
表2 不同酶解时间下原生质体平均成活率
| 酶解时间（h） | 2h | 2.5h | 3h |
| 原生质体平均成活率（%） | 76.92±0.86 | 68.89±0.34 | 67.76±0.98 |
采用0.25% Evans Blue染色法对原生质体活力染色测定，在载玻片上滴一滴所得样品，再滴一滴染液，于显微镜下进行观察计数，成活的原生质体呈现亮黄色，死细胞成深蓝色，如图2所示。
3．原生质体培养方法
培养液：培养基用过滤消毒海水加PES培养基配成，并加入二氧化锗来抑制硅藻的生长。
PES培养基配方为在100 ml蒸馏水中加入NaNO3 350mg，Na2glycerophosphate . 5 H2O（五水磷酸甘油二钠）50 mg，Fe-solution（铁溶液）25 mL，PII 金属液25 mL，维生素B12 10μg，硫胺0.5 mg，生物素5μg，Tris buffer (Tris-HCl缓冲液，Sigma Co.) 500 mg，调节pH 7.8，每20ml PES培养液加无菌海水定容至1000ml。
培养条件：在培养皿中培养，温度20℃，黑暗培养3-4天，转为光照培养，光照时间为12h/d，光强1500-2000lx，定期更换培养液。
培养5天后，细胞（图3-a）呈规则圆形，可观察到细胞经过4天后的暗培养处理后长出细胞壁，胞质较不均匀，可能是叶绿体受光照强度影响生长分布不均匀导致；培养15天后，细胞（图3-b）轮廓清晰，白色较透明；培养22天后，细胞（图3-c）呈圆形，胞质颜色变为黄褐色；培养37天后，可见细胞胞质较均匀（图3-d），黄色箭头处可见3-4个细胞，推测可能是类愈伤组织状细胞团，蓝色箭头处为两个细胞进行二分裂。
在培养了22天时，对麒麟菜细胞再次进行了荧光染色，如图4所示，发现与原生质体时期有所不同，细胞呈现暗绿色荧光，可见圆形细胞轮廓。图4-a为荧光检测前，麒麟菜细胞为圆形，胞质较均匀。图4-b为荧光检测后的情况，可明显看出细胞轮廓，呈暗绿色，说明其已长成细胞壁，同时也再次证明酶解所得的细胞是原生质体。
Claims (1)
1.一种麒麟菜属海藻原生质体分离培养和再生植株的方法，其特征在于它包括如下步骤：
（1）利用海洋贝类鲍提取纯化制得海藻工具酶，然后加入渗透剂；所述渗透剂为甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖、KCl、NaCl中的一种；
（2）将麒麟菜研磨或剪切成细小的组织块或小的分枝，浸没在海藻工具酶溶液中消化，获得麒麟菜体细胞原生质体，具体方法如下：在20-25℃下，将细小的组织块或小的分枝浸没在海藻工具酶溶液中2-3个小时，期间用玻璃棒进行搅拌，用300目筛绢过滤细胞混合液，除去未消化的细胞、细胞团、碎片；取上清液离心，800rpm离心10min，使单细胞下沉，细胞碎片留在上清液中，弃去上清液，用高渗消毒海水反复冲洗、离心、弃上清液过程2-3次，即获得较为纯净的麒麟菜体细胞原生质体悬液；
（3）将原生质体培养得到再生细胞壁的细胞，进一步培养即得到再生植株，原生质体培养的培养条件为：采用PES培养基配成培养液，温度20℃下黑暗培养3-4天，转为光照培养，光照时间为12h/d，光强1500-2000lx，定期更换培养液。
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Application publication date: 20110810 Assignee: QINGDAO LIBANGDA MARINE TECHNOLOGY Co.,Ltd. Assignor: Ocean University of China Contract record no.: 2013370000200 Denomination of invention: Method for separating Eucheuma seaweed protoplast and culturing regenerated plant Granted publication date: 20130306 License type: Exclusive License Record date: 20130829 |
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| LICC | Enforcement, change and cancellation of record of contracts on the licence for exploitation of a patent or utility model | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20130306 |
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