CN108849502A - 一种墨角藻的培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种墨角藻的培养方法，其步骤如下：选择墨角藻顶芽为外植体，清洗，除菌，切成小段，备用；制成愈伤组织诱导培养基，分装，灭菌冷却后，将外植体插植于培养基中，诱导愈伤组织；向MS液体培养配方中添加琼脂、6‑苄基嘌呤、吲哚乙酸和茶氨酸，制成芽诱导培养基，分装，灭菌冷却后，接入愈伤组织，光照培养，诱导出芽；将1/2MS液体培养基分装，灭菌冷却后，接入幼芽，光照培养，诱导生根；待无菌苗长至叶片展开、长高且有根系时，在室温、自然光照下炼苗后，移栽至自然水体中，即完成培养。本发明培养方法简单易行，适用性强，易于人工控制，取材少、效率高，操作方便，便于推广。
Description
技术领域
本发明涉及植物组织培养技术领域，尤其是涉及一种墨角藻的培养方法。
技术背景
墨角藻，属褐藻门墨角藻目，藻体多年生，扁平或圆柱形，二叉状分枝或在主干周围呈辐射状分枝，藻体为黑褐色，顶端生长，每个表皮细胞内具有数个盘状色素体，成双叉状分枝，为扁平的角状叶。墨角藻是一种贴附在岸边岩石上生长的褐藻，在聚集丰富海洋生物的法国布列塔尼海岸生长，可在退潮时进行采割。墨角藻中具有保湿特性的谷氨酸能够增加肌肤的柔软和光滑，布列塔尼地区的妇女将墨角藻和其它海洋植物混合制作成滋润乳液，用于舒缓日晒后的肌肤。
褐藻的组织培养研究开始于20世纪70年代，组织培养是利用转基因技术对生物进行遗传改良、培育优良品种的有效途径，已在果树和花卉的快速繁殖、培育无病毒植物等方面得到了广泛的应用，为获得较高的诱导率和较好的除菌效果提供资料，并为褐藻基因工程操作提供一种有效的植株再生途径。
发明内容
本发明的目的在于提供一种遗传性状稳定、品质好、根系发达、生长周期短的墨角藻的培养方法，该方法简单易行，适用性强，易于人工控制，取材少、效率高，操作方便，便于推广。
本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：
一种墨角藻的培养方法，具体包括以下步骤：
外植体选择与预处理：选择生长健壮、无病虫害的墨角藻顶芽作为外植体，用煮沸过的海水清洗干净，在体积浓度为1.5-2.5%的KI溶液中浸泡20-30min，用无菌水反复冲洗4-5次后，用体积浓度为5-8%的植物组织抗菌剂PPM进行表面消毒5-10min，再放入高压蒸汽灭菌海水中恢复20-30min，将除菌后的外植体切成小段，在无菌滤纸上将水吸干，即制备好无菌外植体，置于无菌操作台上，备用，处于离体状态的植物活细胞，在合适的营养物质、激素和其他外界条件的作用下，可表现出全能性，发育成完整的植株，由于藻体表面附有大量微生物，且藻体内部也存在细菌，使用KI溶液和无菌海水处理藻体组织块可有效抑菌；
愈伤组织诱导：向MS液体培养配方中添加6-8g/L琼脂、0.50-0.75g/L6-苄基嘌呤和1.30-1.50g/L萘乙酸，将培养基的pH调至5.8-6.0，制成愈伤组织诱导培养基，分装于50mL三角瓶中，每瓶20-25mL，经110-120℃灭菌处理15-20min，冷却后，将外植体插植于固体培养基中，每份培养基接种一段，经过诱导培养，即可获得墨角藻愈伤组织，愈伤组织的诱导是诱导处于分化状态的细胞去分化，成为分裂状态，从而形成愈伤组织，采用固体培养基可以防止墨角藻组织内的物质与液体培养基中的物质发生沉淀，从而改变愈伤组织形成所需的条件，添加植物生长激素对愈伤组织的形成有促进作用；
芽诱导：向MS液体培养配方中添加6-8g/L琼脂、0.65-0.95g/L6-苄基嘌呤、0.85-1.05g/L吲哚乙酸和0.2-0.4mg/L茶氨酸，将培养基的pH调至5.8-6.0，制成芽诱导培养基，分装于50mL三角瓶中，每瓶20-25mL，经110-120℃灭菌处理15-20min，冷却后，接入块状愈伤组织，于光照培养箱中静置培养，诱导新芽发生，待幼芽长至1.0-1.5cm后进行增殖生根培养，上述茶氨酸中含有质量占比为0.65-0.75%的右旋茶氨酸，该配比的茶氨酸在通过细胞壁向内扩散时，能打破束缚微纤丝的交联聚糖间的非共价键，允许细胞壁向外释放压力，使细胞壁上排列的微纤丝之间的作用力变小，孔隙变大，致使细胞壁的结构松弛、伸展性增加，从而使外源激素更加快速的扩散至细胞内部，在激素作用下促使细胞壁进一步发生不可逆伸展，有利于组织培养中细胞体积增大，为幼芽的诱导提供便利，同时缩短了幼芽诱导所需时间，提高器官分化效率，组织培养中可以利用外源激素诱导愈伤组织分化为胚性细胞，诱导胚性细胞形成极性，促进分化基因的表达，从而使细胞朝着器官分化的方向发展；
增殖生根：选择蔗糖体积浓度为1.0-1.5%的1/2MS液体培养基，添加0.30-0.45g/L6-苄基嘌呤和0.50-0.65g/L吲哚乙酸，将液体培养基分装于200mL三角瓶中，每瓶100-120mL，经110-120℃灭菌处理15-20min，冷却后，接入长1.0-1.5cm的幼芽，于光照培养箱中静置，进行增殖培养，诱导幼芽生根，通过外源激素的诱导，使植物体内生物酶的活性发生变化，诱导根部细胞再生，促使植物快生根、多生根，利于形成完整的植株；
炼苗和移栽：待墨角藻无菌苗长至4.0-5.0cm，叶片展开、长高且有根系时，即可炼苗，打开瓶盖，在室温、自然光照下炼苗2-3天后，洗净培养基，取出试管苗，移栽至自然水体中，即完成培养。
作为优选，芽诱导、增殖生根均采用无菌环境，光照度为80-90μE/(m2·s)，光照周期为12-14h/d，温度为23-27℃。
与现有技术相比，本发明的优点在于：1）本发明中添加外源激素的培养基，在无菌的条件下，可直接诱导植物愈伤组织的形成，以及幼芽、根系的生长发育，最终发育成完整的植株，可缩短植物生长周期，提高培养效率，保留植物的优良性状，完成植物的培养和繁殖；2）本发明采用的培养方法可以不受季节、温度、地域影响，可短期内获得大量的墨角藻无菌苗，达到快速繁殖的目的，并可生产出遗传性状稳定、变异少、种性纯、品质好、根系发达的生产性墨角藻幼苗；3）本发明通过组织培养，可完成墨角藻培苗的规模化生产，既满足市场的需求，又达到利用和保护野生植物资源的目的，同时也为细胞学和遗传学研究提供材料，在利用墨角藻组织和细胞培养进行次生物质合成和特殊药物转化的研究方面也具有潜在的应用价值；4）本发明提供的培养方法简单易行，适用性强，易于人工控制，取材少、效率高，操作方便，便于推广。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
一种墨角藻的培养方法，具体包括以下步骤：
1）选择生长健壮、无病虫害的墨角藻顶芽作为外植体，用煮沸过的海水清洗干净，在体积浓度为1.5%的KI溶液中浸泡20min，用无菌水反复冲洗4次后，用体积浓度为5%的植物组织抗菌剂PPM进行表面消毒5min，再放入高压蒸汽灭菌海水中恢复20min，将除菌后的外植体切成小段，在无菌滤纸上将水吸干，即制备好无菌外植体，置于无菌操作台上，备用，处于离体状态的植物活细胞，在合适的营养物质、激素和其他外界条件的作用下，可表现出全能性，发育成完整的植株，由于藻体表面附有大量微生物，且藻体内部也存在细菌，使用KI溶液和无菌海水处理藻体组织块可有效抑菌；
2）向MS液体培养配方中添加6g/L琼脂、0.50g/L6-苄基嘌呤和1.30g/L萘乙酸，将培养基的pH调至5.8，制成愈伤组织诱导培养基，分装于50mL三角瓶中，每瓶20mL，经110℃灭菌处理15min，冷却后，将外植体插植于固体培养基中，每份培养基接种一段，经过诱导培养，即可获得墨角藻愈伤组织，愈伤组织的诱导是诱导处于分化状态的细胞去分化，成为分裂状态，从而形成愈伤组织，采用固体培养基可以防止墨角藻组织内的物质与液体培养基中的物质发生沉淀，从而改变愈伤组织形成所需的条件，添加植物生长激素对愈伤组织的形成有促进作用；
3）向MS液体培养配方中添加6g/L琼脂、0.75g/L6-苄基嘌呤、0.85g/L吲哚乙酸和0.2mg/L茶氨酸，将培养基的pH调至5.8，制成芽诱导培养基，分装于50mL三角瓶中，每瓶20mL，经110℃灭菌处理15min，冷却后，接入块状愈伤组织，于光照度为80μE/(m2·s)、光照周期为12h/d、温度为23℃的光照培养箱中静置培养，诱导新芽发生，待幼芽长至1.0cm后进行增殖生根培养，上述茶氨酸中含有质量占比为0.65%的右旋茶氨酸，该配比的茶氨酸在通过细胞壁向内扩散时，能打破束缚微纤丝的交联聚糖间的非共价键，允许细胞壁向外释放压力，使细胞壁上排列的微纤丝之间的作用力变小，孔隙变大，致使细胞壁的结构松弛、伸展性增加，从而使外源激素更加快速的扩散至细胞内部，在激素作用下促使细胞壁进一步发生不可逆伸展，有利于组织培养中细胞体积增大，为幼芽的诱导提供便利，同时缩短了幼芽诱导所需时间，提高器官分化效率，组织培养中可以利用外源激素诱导愈伤组织分化为胚性细胞，诱导胚性细胞形成极性，促进分化基因的表达，从而使细胞朝着器官分化的方向发展；
4）选择蔗糖体积浓度为1.0%的1/2MS液体培养基，添加0.30g/L6-苄基嘌呤和0.50g/L吲哚乙酸，将液体培养基分装于200mL三角瓶中，每瓶100mL，经110℃灭菌处理15min，冷却后，接入长1.0cm的幼芽，于光照度为80μE/(m2·s)、光照周期为12h/d、温度为23℃的光照培养箱中静置，进行增殖培养，诱导幼芽生根，通过外源激素的诱导，使植物体内生物酶的活性发生变化，诱导根部细胞再生，促使植物快生根、多生根，利于形成完整的植株；
5）待墨角藻无菌苗长至4.0cm，叶片展开、长高且有根系时，即可炼苗，打开瓶盖，在室温、自然光照下炼苗2天后，洗净培养基，取出试管苗，移栽至自然水体中，即完成培养。
实施例2：
一种墨角藻的培养方法，具体包括以下步骤：
1）选择生长健壮、无病虫害的墨角藻顶芽作为外植体，用煮沸过的海水清洗干净，在体积浓度为2.0%的KI溶液中浸泡25min，用无菌水反复冲洗5次后，用体积浓度为7%的植物组织抗菌剂PPM进行表面消毒10min，再放入高压蒸汽灭菌海水中恢复30min，将除菌后的外植体切成小段，在无菌滤纸上将水吸干，即制备好无菌外植体，置于无菌操作台上，备用；
2）向MS液体培养配方中添加7g/L琼脂、0.70g/L6-苄基嘌呤和1.40g/L萘乙酸，将培养基的pH调至6.0，制成愈伤组织诱导培养基，分装于50mL三角瓶中，每瓶25mL，经120℃灭菌处理20min，冷却后，将外植体插植于固体培养基中，每份培养基接种一段，经过诱导培养，即可获得墨角藻愈伤组织；
3）向MS液体培养配方中添加7g/L琼脂、0.90g/L6-苄基嘌呤、1.05g/L吲哚乙酸和0.4mg/L茶氨酸，将培养基的pH调至6.0，制成芽诱导培养基，分装于50mL三角瓶中，每瓶25mL，经120℃灭菌处理20min，冷却后，接入块状愈伤组织，于光照度为90μE/(m2·s)、光照周期为14h/d、温度为26℃的光照培养箱中静置培养，诱导新芽发生，待幼芽长至1.5cm后进行增殖生根培养，上述茶氨酸中含有质量占比为0.75%的右旋茶氨酸；
4）选择蔗糖体积浓度为1.5%的1/2MS液体培养基，添加0.40g/L6-苄基嘌呤和0.60g/L吲哚乙酸，将液体培养基分装于200mL三角瓶中，每瓶120mL，经120℃灭菌处理20min，冷却后，接入长1.5cm的幼芽，于光照度为90μE/(m2·s)、光照周期为14h/d、温度为26℃的光照培养箱中静置，进行增殖培养，诱导幼芽生根；
5）待墨角藻无菌苗长至5.0cm，叶片展开、长高且有根系时，即可炼苗，打开瓶盖，在室温、自然光照下炼苗3天后，洗净培养基，取出试管苗，移栽至自然水体中，即完成培养。
实施例3：
一种墨角藻的培养方法，进一步优化步骤如下：
1）选择生长健壮、无病虫害的墨角藻顶芽作为外植体，用煮沸过的海水清洗干净，在体积浓度为2.0%的KI溶液中浸泡25min，用无菌水反复冲洗5次后，用体积浓度为7%的植物组织抗菌剂PPM进行表面消毒10min，再放入高压蒸汽灭菌海水中恢复30min，将除菌后的外植体切成小段，在无菌滤纸上将水吸干，即制备好无菌外植体，置于无菌操作台上，备用；
2）向MS液体培养配方中添加7g/L琼脂、0.70g/L6-苄基嘌呤和1.40g/L萘乙酸，将培养基的pH调至6.0，制成愈伤组织诱导培养基，分装于50mL三角瓶中，每瓶25mL，经120℃灭菌处理20min，冷却后，将外植体插植于固体培养基中，每份培养基接种一段，经过诱导培养，即可获得墨角藻愈伤组织；
3）向MS液体培养配方中添加7g/L琼脂、0.90g/L6-苄基嘌呤、1.05g/L吲哚乙酸和0.4mg/L茶氨酸，将培养基的pH调至6.0，制成芽诱导培养基，分装于50mL三角瓶中，每瓶25mL，经120℃灭菌处理20min，冷却后，接入块状愈伤组织，于光照度为90μE/(m2·s)、光照周期为14h/d、温度为26℃的光照培养箱中静置培养，诱导新芽发生，待幼芽长至1.5cm后进行增殖生根培养，上述茶氨酸中含有质量占比为0.75%的右旋茶氨酸；
4）选择蔗糖体积浓度为1.5%的1/2MS液体培养基，添加0.40g/L6-苄基嘌呤和0.60g/L吲哚乙酸和0.2mg/L迷迭香酸，将液体培养基分装于200mL三角瓶中，每瓶120mL，经120℃灭菌处理20min，冷却后，接入长1.5cm的幼芽，于光照度为90μE/(m2·s)、光照周期为14h/d、温度为26℃的光照培养箱中静置，进行增殖培养，诱导幼芽生根，迷迭香酸与培养基中的钙、镁离子络合，进入植物细胞内部后，在细胞内部形成高渗环境，进一步提高细胞内外渗透压差，促使培养基中成分向细胞内转移，使外源激素快速进入细胞内部，促进细胞体积增大，加速生长，致使植物快速生根，根系生长发育优良，达到诱导幼芽生根、根系发达的目的，有效缩短植物生长周期，节省成本；
5）待墨角藻无菌苗长至5.0cm，叶片展开、长高且有根系时，即可炼苗，打开瓶盖，在室温、自然光照下炼苗3天后，洗净培养基，取出试管苗，移栽至自然水体中，即完成培养。
实施例4：
一种墨角藻的培养方法，具体包括以下步骤：
1）选择生长健壮、无病虫害的墨角藻顶芽作为外植体，用煮沸过的海水清洗干净，在体积浓度为1.5%的KI溶液中浸泡20min，用无菌水反复冲洗4次后，用体积浓度为5%的植物组织抗菌剂PPM进行表面消毒5min，再放入高压蒸汽灭菌海水中恢复20min，将除菌后的外植体切成小段，在无菌滤纸上将水吸干，即制备好无菌外植体，置于无菌操作台上，备用；
2）向MS液体培养配方中添加6g/L琼脂、0.50g/L6-苄基嘌呤和1.30g/L萘乙酸，将培养基的pH调至5.8，制成愈伤组织诱导培养基，分装于50mL三角瓶中，每瓶20mL，经110℃灭菌处理15min，冷却后，将外植体插植于固体培养基中，每份培养基接种一段，经过诱导培养，即可获得墨角藻愈伤组织；
3）向MS液体培养配方中添加6g/L琼脂、0.75g/L6-苄基嘌呤、0.85g/L吲哚乙酸，将培养基的pH调至5.8，制成芽诱导培养基，分装于50mL三角瓶中，每瓶20mL，经110℃灭菌处理15min，冷却后，接入块状愈伤组织，于光照度为80μE/(m2·s)、光照周期为12h/d、温度为23℃的光照培养箱中静置培养，诱导新芽发生，待幼芽长至1.0cm后进行增殖生根培养；
4）选择蔗糖体积浓度为1.0%的1/2MS液体培养基，添加0.30g/L6-苄基嘌呤和0.50g/L吲哚乙酸，将液体培养基分装于200mL三角瓶中，每瓶100mL，经110℃灭菌处理15min，冷却后，接入长1.0cm的幼芽，于光照度为80μE/(m2·s)、光照周期为12h/d、温度为23℃的光照培养箱中静置，进行增殖培养，诱导幼芽生根；
5）待墨角藻无菌苗长至4.0cm，叶片展开、长高且有根系时，即可炼苗，打开瓶盖，在室温、自然光照下炼苗2天后，洗净培养基，取出试管苗，移栽至自然水体中，即完成培养。
实施例5：
以实施例1-3培养的墨角藻无菌苗，与实施例4所得未添加茶氨酸培养的墨角藻无菌苗形成对照试验，通过对墨角藻组织培养期间形成愈伤组织耗时、芽诱导耗时、出芽率、生根率进行记录，取平均数据并分析，结果如下表。
表1墨角藻生长状况的综合分析
由上表可明显得出，经过添加有外源激素的培养基的组织培养，墨角藻顶芽组织可以发育成完整的新植株，茶氨酸和迷迭香酸的添加，可以缩短墨角藻生长周期，提高培养效率，短期内即可获得墨角藻无菌苗，达到快速繁殖的目的，生产出的墨角藻幼苗品质好、根系发达、性状稳定，既满足市场需求，又节省了生产成本。
本发明操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种墨角藻的培养方法，包括外植体选择与预处理、愈伤组织诱导、芽诱导、增殖生根、炼苗和移栽，其特征在于：所述芽诱导步骤为：向MS液体培养配方中添加琼脂、6-苄基嘌呤、吲哚乙酸和茶氨酸，调节pH，制成芽诱导培养基，分装，灭菌，冷却后，接入块状愈伤组织，于光照培养箱中静置培养，诱导新芽发生，待幼芽长成后进行增殖生根培养。
2.根据权利要求1所述的一种墨角藻的培养方法，其特征在于：所述茶氨酸的添加量为0.2-0.4mg/L，所述茶氨酸中含有质量占比为0.65-0.75%的右旋茶氨酸。
3.根据权利要求1所述的一种墨角藻的培养方法，其特征在于：所述外植体选择与预处理步骤为：选择生长健壮、无病虫害的墨角藻顶芽作为外植体，用煮沸过的海水清洗干净，经除菌处理后，将外植体切成小段，在无菌滤纸上将水吸干，即制备好无菌外植体，置于无菌操作台上，备用。
4.根据权利要求3所述的一种墨角藻的培养方法，其特征在于：所述除菌处理方法为：将外植体在体积浓度为1.5-2.5%的KI溶液中浸泡20-30min，用无菌水反复冲洗4-5次后，用体积浓度为5-8%的植物组织抗菌剂PPM进行表面消毒5-10min，再放入高压蒸汽灭菌海水中恢复20-30min即可。
5.根据权利要求1所述的一种墨角藻的培养方法，其特征在于：所述愈伤组织诱导步骤为：向MS液体培养配方中添加6-8g/L琼脂、0.50-0.75g/L6-苄基嘌呤和1.30-1.50g/L萘乙酸，将培养基的pH调至5.8-6.0，制成愈伤组织诱导培养基，分装，灭菌，冷却后，将外植体插植于固体培养基中，每份培养基接种一段，经过诱导培养，即可获得墨角藻愈伤组织。
6.根据权利要求1所述的一种墨角藻的培养方法，其特征在于：所述增殖生根步骤为：选择蔗糖体积浓度为1.0-1.5%的1/2MS液体培养基，添加0.30-0.45g/L6-苄基嘌呤和0.50-0.65g/L吲哚乙酸，将液体培养基分装，灭菌，冷却后，接入长1.0-1.5cm的幼芽，于光照培养箱中静置，进行增殖培养，诱导幼芽生根。
7.根据权利要求1所述的一种墨角藻的培养方法，其特征在于：所述炼苗和移栽步骤为：待墨角藻无菌苗长至4.0-5.0cm，叶片展开、长高且有根系时，即可炼苗，打开瓶盖，在室温、自然光照下炼苗2-3天后，洗净培养基，取出试管苗，移栽至自然水体中，即完成培养。
8.根据权利要求1或6所述的一种墨角藻的培养方法，其特征在于：所述光照培养均采用无菌环境，光照度为80-90μE/(m2·s)，光照周期为12-14h/d，温度为23-27℃。
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