CN113728921A - 一种铁筷子组培繁殖方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种铁筷子组培繁殖方法，包括以下步骤：（1）外植体的获取与处理；（2）不定芽诱导培养；（3）不定芽继代增殖培养；（4）生根培养；（5）炼苗和移栽，得铁筷子种苗。本发明通过对激素、培养环境的综合调节，使铁筷子不定芽增殖倍数达到3.5以上，生根率达到90%以上，解决了铁筷子繁殖系数低、生根难、生产周期长的难题。另外，通过将优良株系的优良性状保持下来，可以生产优良性状稳定的种苗，易于标准化、工厂化操作，为市场提供统一标准的优良种苗。

Description

一种铁筷子组培繁殖方法
技术领域
本发明涉及一种组培繁殖方法，特别是一种铁筷子组培繁殖方法，属于植物繁育技术领域。
背景技术
铁筷子（Helleborus）是毛茛科多年生植物，该属大约有22种，主要分布在欧洲和西亚，我国只有铁筷子（Helleborus thibetanus）一种。铁筷子株型低矮、叶色墨绿、花叶奇特，用作盆栽植物，冬春或早春开花，被称为“圣诞玫瑰”，具有极高的观赏价值。铁筷子主要以种子繁殖为主，但因种子具有休眠特性，且受环境条件的限制，受精后的种子需要10~12周才会成熟，成熟种子播种到萌发需要26~34周的时间，造成生产周期过长，严重制约了铁筷子的规模化生产和商业应用。现有的铁筷子组织培养，因为褐变、内生菌等导致离体培养启动困难、增殖率低、生根和驯化困难等问题。因此有必要对现有技术加以改进。
发明内容
为解决现有铁筷子因种子具有休眠特性，造成生长周期过长，且离体培养启动困难、污染率高、增值率低、生根和驯化困难等问题，本发明提供一种铁筷子组培繁殖方法。
本发明通过下列技术方案完成：一种铁筷子组培繁殖方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）外植体的获取与处理：在8月份切取叶片尚未展开的小腋芽，用质量浓度为15-30%的洗衣粉水浸泡3-6min后，流水冲洗30min以上，用质量浓度为70%酒精浸泡20-35s，再用质量浓度为0.2%的Fungicide浸泡15min，最后用质量浓度为0.15%的升汞浸泡20-30min，用无菌水冲洗3次，滤除水分，得处理后的小腋芽；
（2）不定芽诱导培养：将步骤（1）处理后的小腋芽接种于下列不定芽诱导培养基上：MS+2iP 2mg/L+6-BA 1~2mg/L+NAA 0.1~0.3mg/L，琼脂6.5g/L，蔗糖30g/L蔗糖，pH5.8；
于温度为15±2℃，光照强度为2000～3000lx，光照时间为8-12h/d的条件下，诱导培养40~60d，直至外植体分化出不定芽；
（3）不定芽继代增殖培养：将步骤（2）诱导出的不定芽切下，转接至下列增殖培养基中：
MS+2iP 2mg/L+6-BA 1mg/L+NAA 0.1~0.3mg/L，琼脂6.5g/L，蔗糖30g/L蔗糖，pH5.8；
在温度为15~23℃，光照强度为2000～3000lx，光照时间为8-12h/d的条件下进行继代培养，每30d继代一次，直至得到1~2cm长的不定芽；
（4）生根培养：将步骤（3）继代增殖培养的不定芽转接至下列生根培养基中：
MS+IBA 0.5~1.0mg/L，琼脂6.50g/L琼脂，蔗糖30g/L蔗糖，pH5.8；
在温度为15±2℃，光照强度为2000～3000lx，光照时间为8-12h/d的条件下进行诱导生根培养25~35d，得植株基部长出5~8根须根的无菌苗；
（5）炼苗和移栽：将步骤（4）生根培养的无菌苗取出，洗净根部琼脂，放入质量浓度为0.1～0.2%的多菌灵溶液中消毒1～2min后，移栽至下列质量比的基质中：腐植土∶红土∶珍珠岩=1∶1∶1，按常规在温室中驯化炼苗40~60d后即可移栽至大田中，移栽成活率达95%以上。
本发明具有下列优点及效果：采用上述方案，通过对激素、培养环境的综合调节，使铁筷子不定芽增殖率达到3.5以上，生根率达到90%以上，解决了铁筷子繁殖系数低、生根难、生产周期长的难题。另外，通过将优良株系的优良性状保持下来，可以生产优良性状稳定的种苗，易于标准化、工厂化操作，为市场提供统一标准的优良种苗。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述。
实施例1
一种铁筷子组培繁殖的方法，包括以下步骤：
（1）外植体的选择与灭菌：在秋季8月份，切取叶片尚未展开的小腋芽，用质量浓度为15%的洗衣粉水浸泡6min后，用流水冲洗30min以上，置于超净工作台上，先用质量浓度为70%酒精浸泡30s，再用质量浓度为0.2%Fungicide浸泡15min，最后用质量浓度为0.15%升汞浸泡20min，无菌水冲洗3次，滤除多余水分，得处理后的小腋芽；
（2）不定芽诱导培养：将步骤（1）处理的小腋芽接种于下列不定芽诱导培养基上：
MS+2iP 2mg/L+6-BA 1mg/L+NAA 0.1mg/L，琼脂6.5g/L，蔗糖30g/L蔗糖，pH5.8；
于温度为15℃，光照强度为2000lx，光照时间为10h/d的条件下，诱导培养60d，直至外植体分化出不定芽；
（3）不定芽继代增殖培养：将步骤（2）诱导出的不定芽切下，转接至下列增殖培养基中：
MS+2iP 2mg/L+6-BA 1mg/L+NAA 0.1mg/L，琼脂6.5g/L，蔗糖30g/L蔗糖，pH5.8；
在温度为15℃，光照强度为2000lx，光照时间为10h/d的条件下进行继代培养，每30d继代一次，直至得到2cm长的不定芽；
（4）生根培养：将步骤（3）继代增殖培养的不定芽转接至下列生根培养基中：
MS+IBA 0.5mg/L，琼脂6.50g/L琼脂，蔗糖30g/L蔗糖，pH5.8；
在温度为15℃，光照强度为2000lx，光照时间为10h/d的条件下培养35d，得植株基部长出5根须根的无菌苗；
（5）炼苗和移栽：将步骤（4）诱导生根培养的具有5根须根的无菌苗取出，洗净根部琼脂，放入质量浓度为0.1%的多菌灵溶液中消毒2min后，移栽至比例为腐植土：红土：珍珠岩=1：1：1的基质中，按常规方式在温室中驯化炼苗60d后，移栽至大田中。
本实施例的铁筷子不定芽增殖倍数达到4.1，生根率达到96%，移栽成活率为98%。
实施例2
一种铁筷子组培繁殖的方法，包括以下步骤：
（1）外植体的选择与灭菌：在秋季8月份，切取叶片尚未展开的小腋芽，用质量浓度为30%的洗衣粉水浸泡3min后用流水冲洗30min以上，置于超净工作台上，先用质量浓度为70%酒精浸泡30s，再用质量浓度为0.2%的Fungicide浸泡15min，最后用质量浓度为0.15%的升汞浸泡20min，无菌水冲洗3次，滤除多余水分，得处理后的小腋芽；
（2）不定芽诱导培养：将步骤（1）处理的小腋芽接种于不定芽诱导培养基中，于温度为13℃，光照强度为3000lx，光照时间为8h/d的条件下，诱导培养40d直至外植体分化出不定芽；
所述不定芽诱导培养基为：MS+2iP 2mg/L+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.2mg/L，琼脂6.5g/L，蔗糖30g/L蔗糖，pH5.8；
（3）不定芽继代增殖培养：将步骤（2）中诱导出的不定芽切下转接至增殖培养基中，在温度为20℃，光照强度为3000lx，光照时间为8h/d的条件下进行继代培养，每30d继代一次，直至得到1cm长的不定芽；
所述增殖培养基为：MS+2iP 2mg/L+6-BA 1mg/L+NAA 0.2mg/L，琼脂6.5g/L，蔗糖30g/L蔗糖，pH5.8；
（4）生根培养：将步骤（3）继代增殖培养的不定芽转接至生根培养基中诱导生根，在温度为13℃，光照强度为3000lx，光照时间为8h/d的条件下培养25d，得植株基部长出6根须根的无菌苗；
所述生根培养基为：MS+IBA 0.8mg/L，琼脂6.50g/L琼脂，蔗糖30g/L蔗糖，pH5.8；
（5）炼苗和移栽：将步骤（4）诱导生根培养的无菌苗取出，洗净根部琼脂，放入质量浓度为0.1～0.2%的多菌灵溶液中消毒1～2min后，移栽至比例为腐植土：红土：珍珠岩=1：1：1的基质中，按常规方式在温室中驯化炼苗50d后移栽至大田中。
本实施例的铁筷子不定芽增殖倍数达到3.6，生根率达到92%，成活率为96%。
实施例3
一种铁筷子组培繁殖的方法，包括以下步骤：
（1）外植体的选择与灭菌：在秋季8月份切取叶片尚未展开的小腋芽，用质量浓度为20%的洗衣粉水浸泡5min后用流水冲洗30min以上，置于超净工作台上，先用质量浓度为70%酒精浸泡30s，再用质量浓度为0.2%的Fungicide浸泡15min，最后用质量浓度为0.15%的升汞浸泡20min，无菌水冲洗3次，滤除多余水分，得处理后的小腋芽；
（2）不定芽诱导培养：将步骤（1）处理的小腋芽接种于诱导培养基中，于温度为17℃，光照强度为2500lx，光照时间为12h/d的条件下，诱导培养50d，直至外植体分化出不定芽；
所述不定芽诱导培养基为：MS+2iP 2mg/L+6-BA 2mg/L+NAA 0.3mg/L，琼脂6.5g/L，蔗糖30g/L蔗糖，pH5.8；
（3）不定芽继代增殖培养：将步骤（2）中诱导出的不定芽切下转接至增殖培养基中，在温度为23℃，光照强度为2500lx，光照时间为12h/d的条件下进行继代培养，每30d继代一次，直至得到1.5cm长的不定芽；
所述增殖培养基为：MS+2iP 2mg/L+6-BA 1mg/L+NAA 0.3mg/L，琼脂6.5g/L，蔗糖30g/L蔗糖，pH5.8；
（4）生根培养：将步骤（3）继代增殖培养的不定芽转接至生根培养基中诱导生根，在温度为16℃，光照强度为2500lx，光照时间为12h/d的条件下培养25d，得到植株基部长出7根须根的无菌苗；
所述生根培养基为：MS+IBA 0.5~1.0mg/L，琼脂6.50g/L琼脂，蔗糖30g/L蔗糖，pH5.8；
（5）炼苗和移栽：将步骤（4）诱导生根培养的无菌苗取出，洗净根部琼脂，放入质量浓度为0.1～0.2%的多菌灵溶液中消毒1～2min后，移栽至比例为腐植土：红土：珍珠岩=1：1：1的基质中，按常规方式在温室中驯化炼苗40d后移栽到大田中。
本实施例的铁筷子不定芽增殖倍数达到3.5，生根率达到90%，成活率为95%。
对照例1
一种铁筷子组培繁殖的方法，包括以下步骤：
（1）外植体的选择与灭菌：在秋季4月份切取叶片已经展开的腋芽，用洗衣粉水浸泡5min后用流水冲洗30min以上，置于超净工作台上用质量浓度为70%酒精浸泡30s，0.15%升汞浸泡20min，无菌水冲洗3次，滤除多余水分；
（2）不定芽诱导培养：将步骤（1）处理的腋芽接种于下列不定芽诱导培养基上：MS+6-BA 2mg/L+NAA 0.2mg/L，琼脂6.5g/L，蔗糖30g/L，pH5.8；于温度为22℃，光照强度为2000～3000lx，光照时间为10h/d的条件下培养30d后因真菌污染而死亡。
对照例2
一种铁筷子组培繁殖的方法，包括以下步骤：
（1）外植体的选择与灭菌：在秋季4月份切取叶片已经展开的腋芽，用洗衣粉水浸泡5min后用流水冲洗30min以上，置于超净工作台上依次用70%酒精浸泡30s，0.2%Fungicide浸泡15min，0.15%升汞浸泡20min，无菌水冲洗3次，滤除多余水分；
（2）不定芽诱导培养：将步骤（1）处理的腋芽接种于不定芽诱导培养基中，于温度为22℃，光照强度为2000～3000lx，光照时间为10h/d的条件下，诱导培养60d直至外植体分化出不定芽；
所述不定芽诱导培养基为：MS+6-BA 2mg/L+NAA 0.2mg/L，琼脂6.5g/L，蔗糖30g/L蔗糖，pH5.8；
（3）不定芽继代增殖培养：将步骤（2）中诱导出的不定芽切下转接至增殖培养基中，在温度为22℃，光照强度为2000～3000lx，光照时间为10h/d的条件下进行继代培养，每30d继代一次；
所述增殖培养基为：MS+6-BA 1mg/L+NAA 0.2mg/L，琼脂6.5g/L，蔗糖30g/L蔗糖，pH5.8。
（4）生根培养：将步骤（3）继代增殖培养的1~2cm长的不定芽转接至生根培养基中诱导生根，在温度为22℃，光照强度为2000～3000lx，光照时间为10h/d的条件下培养30d，直至植株基部长2~3根须根；
所述生根培养基为：MS+IBA 0.5mg/L，琼脂6.50g/L琼脂，蔗糖30g/L蔗糖，pH5.8；
（5）炼苗和移栽：将步骤（4）诱导生根培养的具有2~3根须根的无菌苗取出，洗净根部琼脂，放入质量浓度为0.1～0.2%的多菌灵溶液中消毒1～2min后，移栽至比例为腐植土：红土：珍珠岩=1：1：1的基质中，按常规方式在温室中驯化炼苗50d后移栽，成活率为85%。
本对照例的铁筷子不定芽增殖慢，增值倍数为1.8，生根率低为65%，生根数少。
对照例3
一种铁筷子组培繁殖的方法，包括以下步骤：
（1）外植体的选择与灭菌：在秋季4月份切取叶片已经展开的腋芽，用洗衣粉水浸泡5min后用流水冲洗30min以上，置于超净工作台上依次用70%酒精浸泡30s，0.2%Fungicide浸泡15min，0.15%升汞浸泡20min，无菌水冲洗3次，滤除多余水分；
（2）不定芽诱导培养：将步骤（1）处理的小腋芽接种于诱导培养基中，于温度为22℃，光照强度为2000～3000lx，光照时间为10h/d的条件下，诱导培养60d直至外植体分化出不定芽；
所述不定芽诱导培养基为：MS+2iP 2mg/L+6-BA 2mg/L+NAA 0.3mg/L，琼脂6.5g/L，蔗糖30g/L蔗糖，pH5.8；
（3）不定芽继代增殖培养：将步骤（2）中诱导出的不定芽切下转接至增殖培养基中，在温度为22℃，光照强度为2000～3000lx，光照时间为10h/d的条件下进行继代培养，每30d继代一次；
所述增殖培养基为：MS+2iP 2mg/L+6-BA 1mg/L+NAA 0.3mg/L，琼脂6.5g/L，蔗糖30g/L蔗糖，pH5.8；
（4）生根培养：将步骤（3）继代增殖培养的1~2cm长的不定芽转接至生根培养基中诱导生根，在温度为22℃，光照强度为2000～3000lx，光照时间为10h/d的条件下培养25d，直至植株基部长出3~5根须根；
所述生根培养基为：MS+IBA 0.5mg/L，琼脂6.50g/L琼脂，蔗糖30g/L蔗糖，pH5.8；
（5）炼苗和移栽：将步骤（4）诱导生根培养的具有3~5根须根的无菌苗取出，洗净根部琼脂，放入质量浓度为0.1～0.2%的多菌灵溶液中消毒1～2min后，移栽至比例为腐植土：红土：珍珠岩=1：1：1的基质中，按常规方式在温室中驯化炼苗60d后移栽，成活率为90%。
本对照例的铁筷子不定芽增殖较慢，增值倍数2.4，生根率为80%。
对比分析
表1对比了常规组培方法对照例2和采用本发明实施例1对铁筷子繁殖的差别，包括：外植体污染率、不定芽诱导数量、增殖倍数、生根率、须根数量、和移栽成活率。结果显示，除本发明的外植体污染率低于常规组培方法外，不定芽诱导数量、增殖倍数、生根率和须根数量都明显高于常规组培方法。
表1
Figure 623654DEST_PATH_IMAGE002
。

Claims (1)

1.一种铁筷子组培繁殖方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）外植体的获取与处理：在8月份切取叶片尚未展开的小腋芽，用质量浓度为15-30%的洗衣粉水浸泡3-6min后，流水冲洗30min以上，用质量浓度为70%酒精浸泡20-35s，再用质量浓度为0.2%的Fungicide浸泡15min，最后用质量浓度为0.15%的升汞浸泡20-30min，用无菌水冲洗3次，滤除水分，得处理后的小腋芽；
（2）不定芽诱导培养：将步骤（1）处理后的小腋芽接种于下列不定芽诱导培养基上：MS+2iP 2mg/L+6-BA 1~2mg/L+NAA 0.1~0.3mg/L，琼脂6.5g/L，蔗糖30g/L蔗糖，pH5.8；
于温度为15±2℃，光照强度为2000～3000lx，光照时间为8-12h/d的条件下，诱导培养40~60d，直至外植体分化出不定芽；
（3）不定芽继代增殖培养：将步骤（2）诱导出的不定芽切下，转接至下列增殖培养基中：
MS+2iP 2mg/L+6-BA 1mg/L+NAA 0.1~0.3mg/L，琼脂6.5g/L，蔗糖30g/L蔗糖，pH5.8；
在温度为15~23℃，光照强度为2000～3000lx，光照时间为8-12h/d的条件下进行继代培养，每30d继代一次，直至得到1~2cm长的不定芽；
（4）生根培养：将步骤（3）继代增殖培养的不定芽转接至下列生根培养基中：
MS+IBA 0.5~1.0mg/L，琼脂6.50g/L琼脂，蔗糖30g/L蔗糖，pH5.8；
在温度为15±2℃，光照强度为2000～3000lx，光照时间为8-12h/d的条件下进行诱导生根培养25~35d，得植株基部长出5~8根须根的无菌苗；
（5）炼苗和移栽：将步骤（4）生根培养的无菌苗取出，洗净根部琼脂，放入质量浓度为0.1～0.2%的多菌灵溶液中消毒1～2min后，移栽至下列质量比的基质中：腐植土∶红土∶珍珠岩=1∶1∶1，按常规在温室中驯化炼苗40~60d后即可移栽，移栽成活率达95%以上。
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